专利名称：一种肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
乙型肝炎病毒(h印atitis B virus，HBV)为嗜肝病毒，目前HBV感染已经成为全球性危害的态势，全球60亿人口中，约20亿人有过HBV感染经历，3. 5亿人为慢性HBV感染者，大约80%的患者有不同程度的肝细胞受损，并可能发展成肝硬化和肝癌。每年死于乙肝相关疾病的人数高达100多万，WHO已将HBV感染列为全球十大最常见致死病因之一。我国属HBV高流行区，一般人群HBsiVg携带率高达7. 18%，这不仅严重影响人民身体健康，同时也是一个严重的社会问题。大量的临床研究证明，HBV在体内长期存在和不断复制引起肝脏病变的持续活动和发展是导致病情进展的根本原因，故抗病毒治疗是慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)治疗的关键。目前临床上用于乙型肝炎的抗病毒药物主要有干扰素类、核苷(酸)类似物及免疫调节剂。①核苷(酸)类似物通过抑制HBV-DNA逆转录酶和DNA多聚酶的活性而发挥抗HBV作用，包括拉米夫定(LamiVudine，3TC)、恩替卡韦(Entecavir，ETV)、阿德福韦(Adefovir，ADV)等。由于其使用方便、病人耐受性良好等优点，被广泛用于治疗CHB患者。但随着核苷(酸)类药物的长期使用，耐药性HBV的产生以及停药后反跳等成为一个不容忽视的问题，从而限制了其临床应用。②免疫调节剂包括胸腺肽、免疫核糖核酸、HBV特异性转移因子和中医中药等，它们可以提高人体对HBV的特异性免疫，通过识别和破坏HBV 感染的靶细胞，清除HBV。但目前免疫调节剂在CHB中的应用还缺乏针对性，疗效还不够满意，尚有待进一步研究。干扰素(Interferon，IFN)在HBV基因的复制、表达等多个环节发挥抗病毒作用， 还能调动宿主的免疫功能，形成双重机制的抗病毒活性，成为CHB抗病毒治疗的首选药物之一。根据IFN的细胞来源、分子结构、理化性质和生物学活性的差别，将其分为α-干扰素(IFN α)、β-干扰素(IFNi3)和Y -干扰素(IFN γ )三型，每一型根据其组成氨基酸的差异又可分为多个亚型，如IFNa lb、IFNc^b等。IFNα沘是FDA批准的第一个抗HBV药， 经过几十年的临床运用，其治疗乙型肝炎得到了充分肯定。然而作为抗HBV的首选药物之一，IFNa 2b存在着用药剂量大、疗效不够理想、毒副作用大等缺点，限制了其在临床中的广泛应用。这主要原因是由于HBV主要在肝细胞内寄生和复制，治疗时IFNa 2b在体内容易扩散降解，导致相对平均的组织分布，未能在肝脏形成有效的抗病毒作用浓度。为了达到抗病毒效果，药物剂量常要加大几倍、几十倍，药物剂量的加大也加重了其不良反应，又容易产生耐药性HBV，从而影响疗效。针对这一问题，近年来开展了 IFN的靶向治疗研究，利用脂质体包裹、单克隆抗体介导及去唾液酸糖蛋白受体介导等方式特异性地将IFN运送到靶器官或靶细胞。靶向治疗具有特异性好、选择性强、能减少药物用量和给药次数，以及降低毒副作用和提高药物疗效等优点，因而有可能成为HBV感染治疗中最有效的方法之一。然而，由于受载体的种类、大小及特异性等多种因素的影响，目前IFN的靶向研究虽具有一定的靴向性，尚存在难以达到细胞水平的精确靶向、易被机体免疫系统清除等不足。因此，进一步寻求高效特异的靶向载体，探索设计新型靶向IFN显得非常重要。感染性按蚊叮咬宿主时，进入毛细血管的疟原虫子孢子(Sporozoite，SPZ)数分钟后便随血流跨过肝血窦枯否氏细胞，主动粘附、迅速侵入肝细胞。研究发现，这一过程涉及SPZ表面覆盖的一层表被蛋白---环子孢子蛋白(Circumsporozoite protein, CSP), 疟原虫首先利用其与肝细胞表面受体相互作用从而识别、粘附在肝细胞表面。通过静脉注射，重组的CSP在几分钟内就能结合到肝细胞表面，表明CSP有高效而特异的肝细胞靶向性。CSP约含400个氨基酸，由N端保守I区、中央重复区和C端保守II区构成。近年研究显示CSP N端保守I区可与肝细胞表面的受体一硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Ou5paran sulfateproteoglycans, HSPGs)特异性地结合，表明CSP I区除包含保守序列KLKQP，保守序列的上游还含有硫酸肝素结合序列，将这一含KLKQP和硫酸肝素结合序列的肽段称为 I-Plus0 Ancsin等研究证实CSP I_plus以饱和的方式结合肝素和硫酸肝素凝胶柱，并抑制重组CSP与肝素凝胶的结合。Robertson等将CSP I-plus固定在聚乙二醇脂质体顶端制备成含CSP脂质体，体内外实验均表明其能特异地结合HSP^从而靶向肝组织。小鼠静脉给药后，含CSP脂质体15分钟即可快速地从小鼠外周血清除，定量分析显示小鼠肝脏含CSP脂质体的浓度为心脏、肾脏和肺脏的数百倍，为脾脏的12倍。以上研究结果提示CSP I-Plus是一个良好的靶向载体。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，并基于CSP I-plus高效而特异的肝细胞靶向性与IFN的抗HBV作用，提供一种新的肝靶向干扰素IFN-CSP。利用肝靶向肽CSP I-plus高效特异的肝细胞靶向性将IFNa2b导向肝脏，使其在肝脏富集，从而提高了干扰素治疗HBV感染的特异性，减少全身用量，降低毒副反应，提高量效比。本发明另一目的在于提供提供一种新的融合基因，将来源于疟原虫环子孢子蛋白的CSP I-plus基因拼接在人IFN α 2b基因的C端而得，并对二者进行改造使得融合基因表达量得到大大提高。本发明还有一个目的在于提供上述肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
基于CSP高效而特异的肝细胞靶向性与IFN的抗HBV作用，本发明采用恶性疟原虫 CSP I -plus作为导向分子，利用基因工程方法将其与IFNa 2b融合，制备肝靶向干扰素 IFN-CSP0利用CSP I-plus高效特异的肝细胞靶向性将IFNa2b导向肝脏，使其在肝脏富集， 从而提高了干扰素治疗慢性HBV感染的特异性，减少全身用量，降低毒副反应，提高量效比。本发明创造性地探索了一条利用寄生虫的某些分子来治疗人类疾病的新途径，同时与目前干扰素的靶向治疗方式如利用脂质体包裹、单克隆抗体介导及去唾液酸糖蛋白受体介导等研究比较，具有能达到细胞水平的精确主动靶向和不易被机体免疫系统清除等特点， 因而具有非常好的应用前景，将给社会带来一定的经济效益和社会效益。一种肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本发明上述肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤
(1)对肝靶向肽和人干扰素a2b基因的DNA序列进行改造，利用SOE-PCR方法构建融合
基因；
(2)构建重组表达质粒；
(3)将重组表达质粒转化宿主细胞，获得表达融合蛋白的工程菌，发酵培养；
(4)纯化分离得到融合蛋白IFN-CSP。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(1)中构建融合基因是根据人干扰素 a2b的氨基酸序列和恶性疟原虫肝靶向肽的氨基酸序列，采用大肠杆菌偏爱的密码子，借助计算机辅助设计肝靶向干扰素IFN-CSP基因的核苷酸序列，将整个基因分为16个相互重叠的寡核苷酸片断，采用改良重叠延伸PCR方法构建具有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的融合基因。更进一步地，PCR时所用的引物序列如SED ID N0:3 19所示。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(2)所述构建重组表达质粒时所用的表达载体优选但不限于原核表达载体PET3M。作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤(3)中所述表达宿主菌优选但不限于大肠杆菌。本发明根据人IFNa2b的氨基酸序列和恶性疟原虫CSP I-plus的氨基酸序列，采用大肠杆菌偏爱的密码子，借助计算机辅助设计肝靶向干扰素IFN-CSP基因的核苷酸序列。将整个基因分为16个相互重叠的寡核苷酸片断，采用重叠延伸PCR (splice-overlap extension-PCR,SOE-PCR)技术构建具有如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的融合基因，命名为融合基因IFN-CSP(图广2)。将该融合基因克隆入PMD20-T载体，进行PCR、双酶切、测序鉴定。结果表明融合基因中IFNa2b和CSP I_plus序列、拼接组合的顺序及方向完全正确。 运用NCBI服务器中的CDD程序和http://expasy. org网站提供的ProtParam、ProtScale、 NPSi等相关生物信息学分析工具对融合蛋白的物理化学性质、功能域、疏水性、蛋白质二级结构进行预测分析。结果显示IFN-CSP为阳离子蛋白，含184个氨基酸，其中酸性氨基酸残基(Asp + Glu)和碱性氨基酸残基(Arg + Lys)含量分别为25和27个，分子量为21481. 7 Da，理论等电点为8.33，不稳定指数为53.91，脂溶性指数为81.63，6心￥￥指数(两亲性指数)为-0. 537。用NCBI上的CDD数据库分析该蛋白同时具有典型的IFN超家族保守结构域。用ftOtkale进行亲水性/疏水性分析显示该蛋白的亲水氨基酸数量大于疏水氨基酸。 NPSO分析显示该蛋白二级结构以α-螺旋、无规则卷曲和β-转角为主要结构元件。在成功地重组了融合基因的基础上进一步构建融合基因的原核表达质粒，对构建成功的重组质粒IFN-CSP/pMD20-T和原核表达载体pET_3h分别进行Λ^/ I和历^i/ III 双酶切并以Τ4 DNA连接酶连接。经菌落PCR初步鉴定为阳性的克隆摇菌抽取质粒进行 Kpn VHind III双酶切鉴定，结果表明重组质粒经命I/Hind III双酶切出与预期大小一致的条带(图3)，经DNA测序分析，无碱基错配，最终确定重组表达质粒IFN-CSP/pET3h构建成功。将构建成功的重组原核表达质粒转化宿主菌五coli BL21(DE3)，利用异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamine gel electrophoresis, SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western Blot)方法对表达产物进行分析鉴定，结果显示表达的蛋白为目的蛋白Trx-Mlis-IFN-CSP，表明融合蛋白表达成功(参见附图4)。分别对影响外源基因表达的常规表达条件(诱导温度、诱导菌体起始浓度、诱导剂浓度、诱导时间)进行优化，发现IFN-CSP/pET3h重组质粒在大肠杆菌BL21(DE!3)宿主菌中最佳表达条件为诱导温度为37°C、起始菌浓度为0D600约0. 6、诱导剂IPTG的终浓度为 0.8 mM、诱导时间为5小时。由于诱导表达的目的蛋白带有6XHis标签，能与Hisl^rap HP 亲和层析柱上6XHis配体特异性结合而挂在柱子上，其他杂蛋白不能与亲和层析柱结合而穿透，从而达到分离纯化的效果。再分别用含100 mM、300 mM、500 mM咪唑的磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱目的蛋白，分段收集洗脱液，SDS-PAGE分析结果表明，100 mM咪唑的PBS洗脱液中几乎不含融合蛋白，300 mM咪唑的PBS洗脱液中含有大量融合蛋白，500 mM咪唑的PBS 洗脱液中含有少量的融合蛋白。纯化后的目的蛋白用肠激酶酶切去除Trx-OTis标签蛋白， 以EKapture Agarose柱亲和捕获从反应混合液中去除肠激酶，酶切混合物再经HisTrap HP 柱进一步纯化后得到融合蛋白IFN-CSP (参见附图4)。将不同浓度的CSP-IFN与正常小鼠肝、心、脾、肺和肾组织切片共孵育，以 Anti-IFN-HRP为抗体进行免疫组化试验，结果显示重组融合蛋白IFN-CSP能够与正常小鼠肝细胞特异性地结合。以H印G2. 2. 15细胞为HBV感染细胞模型，分别加入含高、中、低不同浓度CSP-IFN的培养液培养，ELISA检测细胞上清液中的HBsAg、HBeAg浓度，结果显示 CSP-IFN能显著抑制HBsAg、HBeAg的分泌。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明首次将来源于疟原虫环子孢子蛋白的肝靶向肽CSP I-Plus与IFNa2b进行融合，利用CSP I-plus高效特异的肝细胞靶向性将IFNa2b导向肝脏，使其在肝脏富集，从而提高了干扰素治疗慢性HBV感染的特异性，减少全身用量，降低毒副反应，提高量效比。本发明创造性地探索了一条利用寄生虫的某些分子来治疗人类疾病的新途径，同时与目前干扰素的靶向治疗方式如利用脂质体包裹、单克隆抗体介导及去唾液酸糖蛋白受体介导等研究比较，具有能达到细胞水平的精确主动靶向和不易被机体免疫系统清除等特点，因而具有非常好的应用前景，将给社会带来一定的经济效益和社会效益。具体将本发明有益效果归纳如下
①首次采用SOE-PCR技术构建新的融合基因，在适宜的表达系统中表达得到融合蛋白。本发明融合蛋白综合了所融合的两种蛋白/肽的性能，利用CSP I-plus高效特异的肝细胞靶向性将IFNa2b导向肝脏，提高了干扰素治疗慢性HBV感染的特异性，减少干扰素治疗肝脏疾病的用药量，降低其毒副作用和耐药性，为开发临床新型肝靶向药物开辟新的道路。②本发明创造性地将来源于恶性疟原虫CSP的肽段与人IFNa2b进行融合，为利用寄生虫的某些分子来治疗人类疾病提供了新的思路。③提供了构建融合蛋白具体、完整的技术方案。本发明根据大肠杆菌偏好密码子， 对肝靶向肽和干扰素基因修饰和密码子优化，不仅提高了融合蛋白在大肠杆菌中的表达效率，还可以避免部分专利的限制，与传统的多肽合成方法及从天然资源提取多肽的方法相比，本发明的制备方法突破了以往仅从天然资源中提取或以氨基酸合成方法获得多肽的禁锢。同时所需要的培养基和发酵用的实验设备均具有价格低廉和易于操作的优点，使得大批量、低成本的规模生产成为可能，具有很好的应用推广前景。④本发明融合蛋白是蛋白质药物，可以通过降解、排泄以及受体介导的内吞等作用方式被清除，因而不会在体内蓄积，对人体无毒副作用。
图1为融合基因重组示意图2为融合基因IFN-CSP的重组。其中，M为DNA分子量标准(DL 2000) ； 1-4为第一步PCR扩增产物；5为重组的全长融合基因IFN-CSP ；
图3为重组原核表达质粒IFN-CSP /pET32a的菌落PCR和双酶切鉴定。其中，M为DNA 分子量标准(DL 2000 ；DL10000) ；1 为重组质粒 IFN_CSP/pET_32a 的 PCR 鉴定；2 % Kpn I、 Hind III 双酶切重组质粒 IFN_CSP/pET_32a ；
图4为融合蛋白IFN-CSP的SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。a图为目的蛋白 Trx-6His-IFN-CSP的表达、纯化、酶切和融合蛋白IFN-CSP的获得。其中，M为蛋白质分子质量标准；1-2代表五coli BL21/pET3^i-IFN-CSP诱导前和诱导后全菌蛋白；3代表五coli BL21/pET32a-IFN-CSP超声破菌后包涵体；4代表纯化后目的蛋白Trx-6His-IFN_CSP ；5 代表目的蛋白Trx_6His-IFN-CSP酶切后混合物；6代表Trx-6His-IFN_CSP酶切后纯化的IFN-CSP蛋白；7代表Trx-6His-IFN-CSP酶切后洗脱液中的Trx标签；b图为目的蛋白 Trx-6His-IFN-CSP的flfestern-blotting鉴定。其中，M为蛋白质分子质量标准；1-2分别为五coli BL21/pET3^i-IFN-CSP诱导前和诱导后全菌蛋白。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例中未注明具体条件的实验方法，可参照本领域常规方法条件，如J.萨姆布鲁克 (Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的方法和条件，或按照制造产品厂商所建议的条件进行。本发明采用的是常规的商品化的载体和表达宿主菌，本领域可以替代使用的其他原核载体不一一在实施例中赘述，但并不能因此限定本发明范围。实施例1基因的改造、融合基因IFN-CSP的重组及其表达质粒的构建
本实施例利用Novagen公司的pET表达系统表达融合基因IFN-CSP，以pET3h (+)质粒为表达载体，宿主细胞为大肠杆菌。1基因的改造及融合基因IFN-CSP重组(图1_2)
根据NCBI公布的人IFNa^ (NP_000596)的氨基酸序列和恶性疟原虫CSP I-plus (CAA33421)的氨基酸序列，采用大肠杆菌偏爱的密码子，借助计算机辅助设计肝靶向干扰素IFN-CSP基因的核苷酸序列。将整个基因分为16个相互重叠的寡核苷酸片断，用ft~imer Premier 5. O生物软件设计引物P1-P16，引物序列如SEQ ID N0:3 19所示。其中上游Pl 引入式μ I酶切位点，下游P16引入终止密码子和Hind III酶切位点。采用改良SOE-PCR 技术构建具有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的融合基因，具体方法如下 (1)第一步PCR扩增片段IC①、IC②、IC③、IC④
以扩增片段IC①为例，其余类似。向0.2 ml Eppendorf管中逐项加入下表所列成分
权利要求
1.一种肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0:1 所示，该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.权利要求1所述肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)对肝靶向肽和人干扰素a2b基因的DNA序列进行改造，利用SOE-PCR方法构建融合基因；(2)构建重组表达质粒；(3 )将重组质粒转化宿主细胞，获得表达融合蛋白的工程菌，发酵培养；(4)纯化分离得到肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白。
3.根据权利要求2所述肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白的制备方法，其特征在于步骤(1)中构建融合基因是根据人干扰素a2b的氨基酸序列和恶性疟原虫肝靶向肽的氨基酸序列，采用大肠杆菌偏爱的密码子，借助计算机辅助设计肝靶向干扰素IFN-CSP基因的核苷酸序列，将整个基因分为16个相互重叠的寡核苷酸片断，采用改良重叠延伸PCR方法构建具有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的融合基因。
4.根据权利要求3所述肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白的制备方法，其特征在于将整个基因分为16个相互重叠的寡核苷酸片断后，PCR时所用的引物序列如SED ID NO: 3~19 所示。
5.根据权利要求2所述肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白的制备方法，其特征在于步骤(3)所述重组表达时所用的表达系统为原核表达系统。
6.根据权利要求2所述肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述表达宿主菌为大肠杆菌。
7.—种重组载体，其特征在于所述重组载体含有权利要求1所述的肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白的核苷酸序列。
8.一种宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞含有权利要求7所述的重组载体。
9.权利要求1所述肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白在制备抗乙型肝炎病毒感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白及其制备方法和应用。本发明所述肝靶向肽与人干扰素a2b融合蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。体外实验证实，本发明所述融合蛋白具有较明显的抗HBV活性和肝细胞靶向性。本发明所述融合蛋白由于结合了疟原虫环子孢子蛋白的肝靶向肽CSPI-plus与人IFNa2b各自的特点，可用于制备新型的肝靶向抗病毒药物，对降低乙型肝炎病毒感染引起的肝脏疾病的发病率和死亡率具有深远的意义。该融合蛋白的表达量高，易纯化，并具有生产周期短，成本低的优点，市场前景广阔，具有重要的应用前景和实际意义。
文档编号C12N15/70GK102268093SQ20111017506
公开日2011年12月7日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者卢雪梅, 吴强, 朱家勇, 李小波, 梅寒芳, 沈娟, 肖明珠, 褚夫江, 金小宝, 马艳, 黄演婷 申请人:广东药学院