专利名称：一种病原体核酸的等温链多重检测卡的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及病原体核酸的等温链多重检测卡。
背景技术：
传统病原体检测方法包括基于血清学对病原体抗体的检测，和分子检测方法、如对病原体核酸的检测。通过酶联免疫方法对病原体抗体的检测有一定优点，如特异性好，重复性高等，但是该方法不能用于诊断活动性的与慢性的感染。自核酸检测方法建立后，该缺点得到了解决，核酸检则方法是直接对病原体的核糖核酸或脱氧核糖核酸的检测，无论是在定性或者定量方法都有一定的优势。尽管核酸检则方法具有高灵敏度、高特异性的优点， 但是它们需时长，费用高，而且需要特殊的仪器用需要专业的培训。因此，人们仍然需要寻找快速、灵敏、低成本、操作简易的检测工具。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的病原体检测方法中存在的不足，提供一种病原体核酸的等温链多重检测卡，该检测卡结合了多重检测病原体的核酸等温链置换方法和纳米胶体金技术，克服了传统检测方法的操作技术负责、耗时长、需要特殊仪器等缺陷。本发明目的通过以下技术方案予以实现
本发明结合胶体金标记核酸的技术，核酸等温链置换技术，多重检测病原体核酸，通过待检测模板诱导的核酸等温链置换方法形成大量的用于检测的带标志的双链混合物，通过在硝酸纤维素膜上包被不同的检测用核酸，链霉亲和素，分别形成检测线和质控线，最终得到准确的检测结果。本发明所述病原体核酸的等温链多重检测卡涉及的等温链置换核酸检测方法包括具有通过核酸比对后合成的特异性发夹结构，特异性发夹结构为5’端巯基标志，3’端生物素标志，5’端巯基标志用于与胶体金偶联，3’端生物素标志用于检测时于质控线的链霉亲和素结合，该发夹结构的环可与待检病原体核酸互补配对，配对后打开发夹结构。当待检测病原体核酸存在时，发夹结构可被打开，通过等温链置换方法形成带标签的双链混合物 (见图1)。因待检测病原体核酸在检测过程中未被扩增，所以本试纸条具有防止实验室扩增物交叉污染，防止假阳性的优点。具体地，一种病原体核酸的等温链多重检测卡，从左到右依次为固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；该胶体金检测卡标记有可以识别待检病原体核酸特定序列的分子探针的纳米金颗粒；所述分子探针为一段可形成发夹结构的核苷酸序列，其5’端与3’端互补配对形成径结构，突起的环识别待检病原体核酸特定序列，5’端标记了巯基，还含有延伸引物，3’端标记了生物素；所述纳米金颗粒的粒径为25 40nm。作为一种优选方案，所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、吸水纸之间的相邻部分彼此重叠广5mm。作为一种优选方案，所述硝酸纤维素膜同时包被有检测线用核苷酸序列、一条质控线用链霉亲和素。作为一种优选方案，所述质控线和检测线相距3mm。本发明所述病原体核酸的等温链多重检测卡在检测线上包被了四条用于检测乙肝、丙肝、人免疫缺陷病毒、梅毒等病原体核酸的核酸序列，质控线包被有链霉亲和素；在检测卡加样的一端固定有经特殊样品垫处理液处理的样品垫。经收集、处理后的病人血液样品先用于核酸抽提，然后与胶体金颗粒标志的发夹结构混合物混合，在酶的作用下进行核酸等温链置换反应，形成用于检测卡检测用的带标签的双链混合物。双链混合液依靠毛细管作用在检测卡的纤维素膜上向检测线方向侧向层析，当病人样品中存在病原体核酸时， 带标签的双链混合物在运行至检测线时，与检测线上出现一条红色色带，结果为阳性。如果样品中没有病原体核酸时，在检测区便没有红色线条出现，结果为阴性。质控线在检测样品时均应出现红色色带，质控线的出现表示检测试纸条工作正常。本发明所述多重检测乙肝、丙肝、人免疫缺陷病毒、梅毒等核酸的病原体核酸的等温链多重检测卡为特异性在硝酸纤维素膜上包被不同的检测用核酸和链霉亲和素。本发明所述病原体核酸的等温链多重检测卡主要应用了多重检测病原体核酸的等温链置换方法，该方法主要为一发夹结构，该发夹结构为5’端巯基标志，3’端生物素标志，5’端巯基标志用于与胶体金偶联，3’端生物素标志用于检测时于质控线的链霉亲和素结合，该发夹结构的环可与待检测模互补配对，配对后打开径环结构，在带标志的引物， DNIPs，Klen0W聚合酶作用下作等温链置换反应，后形成大量的用于检测的带标志的双链混合物。本发明所述病原体核酸的等温链多重检测卡可以用于多重检测乙肝病毒核酸、丙肝病毒核酸、人免疫缺陷病毒核酸和梅毒核酸。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明快速、简单、不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易变，适合基层检测， 对多重检测乙肝、丙肝、人免疫缺陷病毒、梅毒等核酸、对输血前，输血后的检测起到重要的作用；
因本发明在检测过程中没有扩增病原体核酸，所以可以有效防治实验室扩增交叉污染，防治假阳性。
图1为显示试纸条整体结构示意图2为显示试纸条检测样品效果图，其中^为无冊￥，!1(^，!11￥3 的检测结果(阴性)， B为含有HBV，HCV，HIV, TP的检测结果(阳性)。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。本发明所述应用多重检测病原体核酸的等温链置换技术制得
1、乙肝病毒检测用发夹结构序列如SEQ ID NO: 1所示，延伸引物如SEQ ID NO: 2所示， 检测用T线对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
丙肝病毒检测用发夹结构序列如SEQ ID N0:4所示，延伸引物如SEQ ID N0:5所示，检测用T线对应的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。人免疫缺陷病毒检测用发夹结构序列如SEQ ID N0:7示，延伸引物如SEQ ID NO:8 示，检测用T线对应的核苷酸序列如SEQ ID N0:9示。梅毒病毒检测用发夹结构序列如SEQ ID NO: 10延伸引物如SEQ ID NO: 11检测用 T线对应的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。2、等温链置换体系 待检测模板 Iul 发夹结构2ul 引物(IOuM) Iul Klenow 酶 0. 5ul dNTPs(IOmM) 0. 5ul buffer (IOX) 2. 5ul ddH20 17. 5ul
42 °C 30min
2、所述病原体核酸的等温链多重检测卡的制备 1.纳米金(胶体金)的制备
在500ML的圆底烧瓶中加入IOOml 0. 01%的HAuCL4溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中加入anl 1%枸橼酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸lOmin，停止加热继续搅拌15min ；胶体金溶液4°C避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度值鉴定。2.胶体金试纸条的组装
将标志有检测用T线，质控线的硝酸纤维素膜、吸水纸、结玻璃纤维、样品垫依次固定于PVC板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得到本发明所述的免疫层析胶体金检测卡。质量控制标准
(1) C线(质控线)出现红色的线证明胶体金试纸条有效。(2) T线(检测线)出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。结果判定标准
(1)C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；
(2)C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性； (2) C线没有出现红色的线，说明纳米生物传感器失效(图2)。
权利要求
1.一种病原体核酸的等温链多重检测卡，其特征在于所述检测卡从左到右依次为固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；该病原体核酸的等温链多重检测卡标记有可以识别待检病原体核酸序列的分子探针的纳米金颗粒；所述分子探针为一段可形成发夹结构的核苷酸序列，其5’端与3’端互补配对形成茎环结构，突起的环识别待检病原体核酸特定序列，5’端标记了巯基，还含有延伸引物，3’端标记了生物素；所述纳米金颗粒的粒径为25 40nm。
2.根据权利要求1所述的病原体核酸的等温链多重检测卡，其特征在于所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、吸水纸之间的相邻部分彼此重叠广5mm。
3.根据权利要求1所述的病原体核酸的等温链多重检测卡，其特征在于所述硝酸纤维素膜同时包被有检测线用核苷酸序列、一条质控线用链霉亲和素。
4.根据权利要求3所述的病原体核酸的等温链多重检测卡，其特征在于所述质控线和检测线相距3mm。
5.权利要求广4中任意一条权利要求所述病原体核酸的等温链多重检测卡在多重检测乙肝病毒核酸、丙肝病毒核酸、人免疫缺陷病毒核酸和梅毒核酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种病原体核酸的等温链置换多重检测卡。本发明所述病原体核酸的等温链置换多重检测卡利用了核酸等温链置换方法与胶体金检测技术制备得到的检测卡，可以多重检测乙型肝炎病毒DNA、丙型肝炎病毒RNA、人免疫缺陷病毒RNA、梅毒苍白螺旋体DNA。本发明病原体核酸的等温链置换多重检测卡是一种操作简单、快速、灵敏度高、不需要专业仪器设备的检测卡，因待检病原体核酸在检测过程中未被扩增，所以该检测卡具有防止实验室扩增物交叉污染、防止假阳性的优点，可以广泛应用于临床检测、检验检疫、传染病控制、生物技术等领域的高灵敏度的病原体核酸检测，具有广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/70GK102230032SQ20111017506
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者何秀华, 方志远 申请人:广州弗赛生物科技有限公司