专利名称：油脂酵母δ12和δ15双功能脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一个来源于橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)的具有Δ 12/Δ 15双功能的脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturasedfatty acids，PUFAs)，如二十碳五烯酸(Eicosatetraenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid, DHA)等是人体中枢神经系统膜脂结构的主要成分，对人体特别是婴幼儿大脑和神经系统的发育是必不可少的，在医学和营养保健方面具有重要的作用。人体合成EPA和DHA的效率极低，在日常生活中补充足够的EPA和DHA对维持身体健康极为重要。目前市场上该类脂肪酸主要来源于深海鱼油，环境污染问题及鱼类资源的有限性使得人们必需寻找持久的、稳定安全的EPA和DHA替代来源。已知某些微生物如真菌和海洋微藻能从头合成PUFAs且体内含量丰富，目前直接从这些微生物发酵培养制备商业化的PUFAs只是在极少数物种中取得成功，高提取成本和低产量是需要克服的主要瓶颈。另一方面，基因工程已经能实现在一些植物中合成PUFAs，利用转基因植物尤其是油料作物作为“绿色细胞工厂”生产PUFAs也是今后发展的一个重要方向。一些微生物拥有合成PUFAs的全套基因，是转基因研究中优良基因的主要来源，因此从这些微生物中克隆合成PUFAs所必需的去饱和酶基因和延长酶基因是转基因研究及开发的基础。图1显示了生物体内合成PUFAs的主要过程，其中Δ 15-脂肪酸去饱和酶处于整个代谢途径的上游，可以将亚油酸(LA，018:2Δ9'12)转化生成α-亚麻酸(ALA, 018:3Δ9'12'15)，在ω -3途径中ALA是合成EPA和DHA的底物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种油脂酵母Δ12和Δ15双功能脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法，该基因编码的蛋白具有Δ 12和Δ 15去饱和酶两种活性。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是油脂酵母Δ 12和Δ 15双功能脂肪酸去饱和酶基因，其特征在于它的基因的全长序列如下atgtcagtcgttgactttaccgataccacaagtggctcggctatcaattcttcgaacatt60
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上述油脂環孝母Δ12和Δ15双功能脂肪酸去饱和酶基因[橘林油游■酵母
(Lipomyces kononenkoae)双功能的脂肪酸去饱和酶基因lkfadl5]的克隆方法，其特征在于对已经报道的Δ 15-脂肪酸去饱和酶氨基酸序列进行比对，根据对应的保守区域设计简并引物F2/R2，以提取的橘林油脂酵母总DNA为模板，采用降落PCR(Touch-downPCR)的方法扩增出LKFAD15保守区对应的基因编码序列并克隆到pMD18_T载体并测序；根据测序所得的DNA序列设进一步进行橘林油脂酵母基因组步移，利用接头PCR(Adaptor-PCR)和热不对称交错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)扩增出橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5 5’和3’端的侧翼序列；最后将获得的侧翼序列与之前得到的基因片段进行拼接，即得到橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) Ikfadl5结构基因的全长序列(即油脂酵母Δ 12和Δ 15双功能脂肪酸去饱和酶基因的全长序列)。与现有的脂肪酸去饱和酶基因相比，这个基因具有以下特点1)目前仅从原生动物和霉菌中克隆出具有Δ 12/Δ 15-双功能的脂肪酸去饱和酶基因。本发明从一种油脂酵母(橘林油脂酵母)中克隆到具有Δ 12/△ 15双功能的脂肪酸去饱和酶基因，该基因编码的蛋白具有△ 12和△ 15去饱和酶两种活性；该脂肪酸去饱和酶也具有较为广泛的底物特异性，这是从油脂酵母中克隆到具有双功能的脂肪酸去饱和酶基因的首次报道。橘林油脂酵母亚油酸含量高，通过在橘林油脂酵母中过表达以及在其它宿主中异源表达lkfadl5具有提高LA或ALA含量的潜力。2)在NCBI 中经Blast 分析表明，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5与其它物种的脂肪酸去饱和酶基因在核苷酸序列上没有同源性。
图1是多不饱和脂肪酸(PUFAs)的合成途径图。图2是橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因的酿酒酵母脂肪酸图谱。图3是不同来源的Δ-15脂肪酸去饱和酶进化树。LKFAD15 from Lipomyceskononenkoae, PipFAD15(ABL63813. l)from Pichia pastoris, LidFAD15 (AAA86690.1)from Limnanthes douglasii, PefFAD15(AAL36934. l)from Perilla frutescens,CyaFAD15(EAZ92081. l)from Cyanothece sp. , LynFAD15 (EAW33450. l)from Lyngbyasp.，SynFAD15(BAA02924. l)from Synechocystis sp.，CadFAD12(XP_002420902. 1)from Candida dubliniensis, CopFAD12(EER27935. l)from Coccidioides posadasii,AsoFAD12 (BAD04850. 1)from Aspergillus oryzae, CrcFAD12 (AAU12575. 1)fromCryptococcus curvatus, CrnFAD12(XP_570226. l)from Cryptococcus neoformans,PhcFAD12(ACJ26016. l)from Phanerochaete chrysosporium, LeeFAD12(BAD51484. 1)from Lentinula edodes, LabFAD12(XP_001876301.1)from Laccaria bicolor,MucFAD12(BAB69056. l)from Mucor circinelloides, MoaFAD12(BAA81754. l)fromMortierella alpinea, Acc bi-functionalFAD12,15(ABK15557. 1)from Acanthamoebacastellanii.图4是橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因的全长序列。图5是橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因所编码的氨基酸序列。
具体实施例方式1.油脂酵母Δ 12和Δ 15双功能脂肪酸去饱和酶基因[橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae)双功能的脂肪酸去饱和酶基因lkfadl5]的克隆方法对已经报道的Δ 15-脂肪酸去饱和酶氨基酸序列进行比对，根据对应的保守区域设计简并引物F2/R2，以提取的橘林油脂酵母总DNA为模板，采用降落PCR的方法扩增出LKFAD15保守区对应的基因编码序列并克隆到pMDIS-T载体并测序；根据测序所得的DNA序列设进一步进行橘林油脂酵母基因组步移，利用接头PCR(Adaptor-PCR)和热不对称交错 PCR(Ther mal Asymmetric Interlaced PCR)扩增出橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) lkfadl5 5’和3’端的侧翼序列；最后将获得的侧翼序列与之前得到的基因片段进行拼接，即得到橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5结构基因的全长序列(即油脂酵母Δ 12和Δ 15双功能脂肪酸去饱和酶基因的全长序列)。橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) lkfadl5 5，和 3，端的侧翼序列5，-GTCATGTCAGTCGTTGACTTTACCGATA-3’ ； 5’ -GGCCATTAATCTATTGGCTTAACTGGACCT-3’。采用TRIzol试剂盒提取橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)的总RNA，通过逆转录PCR扩增出橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因对应的全长cDNA序列。测序表明橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)结构基因的序列与其对应的全长cDNA序列一致，证明橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因不含有内含子。橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) Ikfadl5基因的全长序列(即油脂酵母Δ 12和Δ 15双功能脂肪酸去饱和酶基因的全长序列)atgtcagtcg ttgactttac cgataccaca agtggctcgg ctatcaattc ttcgaacatt 60tcccagagag gaaatggatc tacgatagtc gaaaccaaaa aagggccatc ttcaaatttg 120
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橘林油脂酵t母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因所编码的氨基酸序列如I
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myrnvngagp vkpid435。
2.经序列分析，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) Ikfadl5基因的全
长1308bp，不含内含子，其氨基酸序列与来自白假丝酵母(Candida albicans) SC5314的A12-FAD和毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115的Δ 15-FAD均具有很高的同源性，其相似性分别为76%和73%。3.在NCBI 中经Blast 分析表明，橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5与其它物种的脂肪酸去饱和酶基因在核苷酸序列上没有同源性。4.橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) Ikfadl5 (即油脂酵母 Δ 12 禾口 Δ 15双功能脂肪酸去饱和酶基因)编码的蛋白具有△ 12和△ 15去饱和酶两种活性的双功能验证
(1)将橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5克隆到酿酒酵母载体pHBM354，得到酿酒酵母重组表达质粒INVkI-LkFAD15，并将重组表达质粒INVScI-LkFAD15与空载体pHBM3M以醋酸锂方法分别转入酿酒酵母。从尿嘧啶缺陷型培养基(Synthetic Complete Medium lack of Uracil, SC-Ura :0. 67%酵母氮碱，2%葡萄糖，0. 002%亮氨酸，0. 004%色氨酸，0. 002%组氨酸，1.5%琼脂，均为质量百分数)，105°C灭菌30min(待培养基的温度在60°C左右时加入氨基酸，氨基酸的百分含量相当于单位为g/mL，即IOOmL尿嘧啶缺陷型液体培养基中，亮氨酸、色氨酸和组氨酸的加入量分别为0. 002g、0. 004g、0. 002g)上挑取多个阳性单菌落，接种于5mL SC-Ura的液体培养基(0. 67% YNB,2%葡萄糖，0. 002% Leu, 0. 004% Trp, 0. 002% His)中，、200rpm/min 振荡过夜培养；按液体培养基质量的接种，将过夜培养的菌液接种于50mL SC-Ura的液体培养基中振荡培养至0D_ = 2 4。收集细胞后用无菌水洗涤细胞，用50mL重组酿酒酵母诱导培养基[Buffered Synthetic Complete Medium, BSC-Ura :0. 67%酵母氮碱，2%半乳糖，0. 005%亮氨酸，0.005%色氨酸，0.0025%组氨酸(均为质量百分数)，50mM Tris-HCL PH8. 0缓冲液，105°C灭菌30min的液体培养基重悬细胞至0D_ = 0. 4，再将重悬液接种于新的IOOmLBSC-Ura液体培养基中，20°C ,200rpm/min振荡培养3 4天。收集酵母细胞提取总脂肪酸并甲酯化后上气相色谱(GC)进行分析。(2)橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5 基因在酿酒酵母 INVkI 中表达时，在没有添加外源底物的条件下，通过GC检测发现酿酒酵母重组菌株INV&I-D15中产生了四种新的脂肪酸成分即 α6:2Δ9’12，α6:3Δ9’12’15，C18:2"9'12, 018:3Δ9'12'15(图 2)，其含量分别占总脂肪酸的6. 23^,1.83^,12. 25^,3.47% (表1，均为质量百分数)。根据橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) Ikfadl5去饱和酶在进化树中的位置，推测橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5可能是一个新的双功能去饱和酶(图3)，即该基因编码的蛋白具有Δ12和△ 15去饱和酶两种活性。对橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5在酿酒酵母中表达的功能分析进一步证实了这种推测。在橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因转化酿酒酵母中，首先由酵母细胞内自身合成的C16:l"9作为底物，在橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5的Δ 12去饱和酶活性作用下先生成α6:2Δ9’12，然后016:2Δ9'12在橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) lkfadl5的Δ 15去饱和酶活性作用下最后生成α6:3Δ9’12’15，表1数据表明与空载体对照相比，转橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因的酿酒酵母中α6:1Δ9脂肪酸含量下降了 39.87%。C18系列脂肪酸可能也是在相同过程的作用下合成新的C18系列脂肪酸产物。GC分析的结果同时表明来源于橘林油脂酵母(Lipomyceskononenkoae) lkfadl5双功能去饱和酶对C16:1，C18:1底物都具有较高的特异性。表1橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5基因的酿酒酵母脂肪酸组成(% total fatty acids)
权利要求
1.油脂酵母Δ12和△ 15双功能脂肪酸去饱和酶基因，其特征在于它的基因的全长序列如下atgtcagtcgttgactttaccgataccacaagtggctcggctatcaattcttcgaacatt60tcccagagaggaaatggatctacgatagtcgaaaccaaaaaagggccatcttcaaatttg120aaggctattgacacgtttggtaacgagttcaaagtaccagattacaccattaagcaaatt180ttgtcggctatcccaaagcattgttatgaaagatctcttgttagatcgttaggctacgtt240gctcgtgatataaccatgatgtgtttaattggttacattggacaaaagactatcccaatg300gttgagatcgcaggcaaggaagggttgagtagtaacatcagaggaggcctCtggtgCgtg360tattcatacttgttggggttatttggttttggtttatggattttagctcacgaatgtgga420cacggggcattttctgattatcagaatgttaatgatgttgttggttggattttacactcg480tatttgatagtcccatatttttcgtggaaattctctcattcaaagcatcacaaggctact540ggccacttgactaaggatatggttttcattccttacaccaaggaagaatttgtcgaaaag600agcggcgtatctaaggtgtctgaagtcatggaagattcgccaatctggtcgttgatggtt660ttgattttccaacaaattggtggtttacaattgtatttagctactaatgccactggtcaa720tcatacctaggtcactcaaagatcgccaagtctcattatgctccagcttctccagttttt780gacaaggaacactactggtatattatcttgtctgacatcgggattattacaaccataacg840gttgtgtaccaatggtacaagaactttggtttcttcaacatgtttgtcaactggttcatg900ccttggttatgggttaaccactggttagtctttgttactttcttacaacataccgatcca960accatgcctcattaccgtgataatgaatggactttcgctcgtggtgctgctgctactatc1020gaccgtaactttggtttcatcggacaacacattttccatgatatcattgaaactcacgtt1080ttgcaccattacgtttcaagaataccattttacaatgctagagaagccaccgatgccatc1140agaaaggttatgggcgaacattatagatatgaaggtgaatctatgtggtattctttatgg1200aaatgtatgagaatgtgtcaatatgttgatgatgctgacactgacgccaaaggtgtttta1260atgtacagaaacgttaacggtgcaggtccagttaagccaatagattaa1308ο
2.如权利要求1所述的油脂酵母Δ12和△ 15双功能脂肪酸去饱和酶基因的克隆方法，其特征在于对已经报道的△ 15-脂肪酸去饱和酶氨基酸序列进行比对，根据对应的保守区域设计简并引物F2/R2，以提取的橘林油脂酵母总DNA为模板，采用降落PCRCTouch-down PCR)的方法扩增出LKFAD15保守区对应的基因编码序列并克隆到pMDlS-Τ载体并测序；根据测序所得的DNA序列设进一步进行橘林油脂酵母基因组步移，利用接头PCR(Adaptor-PCR)和热不对称交错 PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)扩增出橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae) lkfadl5 5’和3’端的侧翼序列；最后将获得的侧翼序列与之前得到的基因片段进行拼接，即得到油脂酵母Δ12和△ 15双功能脂肪酸去饱和酶基因的全长序列。
全文摘要
本发明涉及一个来源于橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)的具有Δ12/Δ15双功能的脂肪酸去饱和酶基因及其克隆方法。本发明分别以橘林油脂酵母(Lipomyces kononenkoae)为材料，通过设计简并引物扩增基因核心序列，再采用基因组步移的方法扩增出全长Δ15-脂肪酸去饱和酶基因lkfad15；通过在酿酒酵母INVScI中异源表达lkfad15证明该去饱和酶具有Δ12，15-脂肪酸去饱和酶的双功能，并且对C16和C18底物都具有较高的底物特异性。
文档编号C12N15/10GK102373229SQ201110174930
公开日2012年3月14日 申请日期2011年6月27日 优先权日2011年6月27日
发明者万霞, 张燕, 张银波, 梁焯, 江木兰, 郭兵, 龚阳敏 申请人:中国农业科学院油料作物研究所