具有△⁶脂肪酸脱氢酶功能的基因及其应用的制作方法

专利名称：具有△⁶脂肪酸脱氢酶功能的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物编码基因及其应用。具体地，涉及两个具有完整阅读 框架的基因i "D6C和i "Z)dD,其分别来源于黑茶薦子(&'6" "/gram L.)白勺 两段DNA序列，以及以此为基础克隆的两个具有完整阅读框架的基因序 列。本发明还涉及该基因所编码具有^6脂肪酸脱氢酶功能的多肽，以及 含有该DNA序列的低等真核细胞表达载体和植物表达载体、宿主细胞以 及利用该基因分别转化低等真核生物和植物生产GLA和SDA的应用。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty adds, PUFAs)是指含有两个 或两个以上双键且碳链长为18 22个碳原子的直链脂肪酸，主要包括亚 油酸(linoleicacid， LA， 18:2A9,12)、 Y -亚麻酸(y-linolenic acid， GLA， 18:3， △6'9'12)、花生四烯酸(Arachidonic Acid， AA， 20:4A5，8，11，14)、 二十碳五烯 酸(Eicosapentaenoic Acid ， EPA ， 20:5A5'8'1U4'17) 、 二十二碳六烯酸 (DecosahexaenoicAcid， DHA， 20:5A4'7'1()'13'16'19)等。其中，亚油酸及亚 麻酸被公认为人体必需脂肪酸(Essential fatty acids， EFA)，可进一步衍化 成具有不同功能的高度不饱和脂肪酸，如AA、 EPA、 DHA等。
PUFAs具有非常重要的生理功能。第一，PUFAs在心血管运动、大脑、 视网膜和神经组织发育等生理功能中发挥重要作用。第二， DHA和EPA 具有较好的抗癌作用，如可以预防(尤其是绝经后妇女)乳腺癌的发生。 第三，花生四烯酸、EPA和DHA等多不饱和脂肪酸在免疫调节中发挥了 重要的作用。第四，多不饱和脂肪酸还能具有防止皮肤老化、延缓衰老、 促进毛发生长等作用。
在脂肪酸代谢过程中，Al旨肪酸脱氢酶(A6-fatty acid desaturase， D6D)分别催化底物亚油酸(LA)和a-亚麻酸(ALA)的第6位碳原子脱氢形成y-亚麻酸(GLA) [l]和十八碳四烯酸(Stearidonicacid， SDA， 18:4A6,9,12，15)。
Y-亚麻酸又可通过碳链延长和脱氢作用进一步形成AA、前列腺素和 白三烯类生理活性物质，这些产物在人的大脑发育、视觉、过敏反应及心 血管运动等一系列生理功能中产生重要影响。作为人体的一种必需的不饱
和脂肪酸，Y-亚麻酸具有降血脂、抗脂质过氧化、减肥、抑制溃疡、增强 胰岛素、抗血栓性心血管疾病等一系列生物学功能[1，2]，目前国际上已作 为一种新的维生素一维生素F被研究利用[3]。 SDA是EPA和DHA的代 谢前体，在人体内很容易转化为EPA和DHA，利用效率是ALA的4倍， 可以有效缓解与EPA和DHA缺乏有关的生理疾病。当然通过直接补充 EPA或DHA也可以获得同样效果。
然而，PUFAs的现行商业来源主要是特定的种子植物、海洋鱼类和 一些动物组织。除了 LA以外，现有的来源在总产量和质量两个方面都不 能满足日益增长的PUFAs的市场需求。这主要是基于下面的一些原因
(1) PUFAs的植物资源受到季节和地域限制，PUFAs产量和质量 的不稳定；而且植物资源大都产量低、不适合大面积种植。例如含有Y -亚麻酸的月见草、琉璃苣和黑茶薦子等植物产量仅300 600 kg/ha，远远 低于常规油料作物如油菜的3t/ha的产量[4]。
(2)有限的天然海洋渔业资源由于过度捕捞造成渔业资源缺乏，而 且鱼油固有的鱼腥味和氧化不稳定性，限制了 PUFAs的进一步利用；
(3)由于需对低品质的油进行提炼，大大增加了 PUFAs的生产成本。 由此造成了纯品PUFAs的高昂市场价格，阻碍了其许多潜在的用途。
鉴于PUFAs的供应量很快将不能满足其需求量及其应用于生物药品 所需纯品PUFAs供应量的不足，因此有必要寻求商业化生产的可替代性 来源。
所以，作为GLA和SDA生产中的关键酶一Al旨肪酸脱氢酶己被越 来越多的研究和利用。迄今为止，AS脂肪酸脱氢酶基因已从动物[5]、植 物[4]、真菌[6]和线虫[7]等不同生物中克隆获得，并在酿酒酵母[7,8]、番 茄[9]、烟草[4,〗0]、油菜[6,8]和大豆[11]中成功获得了表达。
在植物中，GLA和SDA仅存在于月见草(Oe"o沩era ^ .)、琉璃苣
(5orago 丄.)、黑茶薦子等少数几种植物中[12]，而这些植物的
种子油生产亦成为目前世界上GLA和SDA的主要商业来源。利用产油真 菌发酵也可提取获得GLA和SDA。但通过现有的这些生产方式获得的 GLA和SDA产量都很低，远远不能满足日益增长的市场需求[13]。因此， 利用酿酒酵母或转基因油料作物植株表达外源A6脂肪酸脱氢酶来生产 GLA和SDA具有重要的研究意义和经济价值。此外，虽然琉璃苣[5]具有 △6脂肪酸脱氢酶基因在国外己有研究报道，但本申请的两个基因是来源 于黑茶薦子的Al旨肪酸脱氢酶基因，迄今在国内外未见报道。

发明内容
本发明提供了两个基因W"D6C、 i^D6D，其核苷酸酸序列分别如SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2所示，这两个基因分别来源于黑茶藤子(i A^ m'grwm L.)的DNA片段，所编码的多肽分别如SEQ ID NO:3， SEQ ID NO:4所示。
本发明的另一个目的是提供含基因i wZMC、 i^D6Z)的低等真核细胞 表达载体如酵母表达载体，以及利用该表达载体转化的酵母细胞。在转化 的酵母细胞中所表达的多肽具有A6脂肪酸脱氢酶功能，可以分别催化外 加底物亚油酸和a-亚麻酸分别生成Y —亚麻酸(GLA)和十八碳四烯酸 (SDA)。
由于这类基因所编码的是一个蛋白，可采用酿酒酵母表达体系来进行 体外表达，但由于该蛋白为膜蛋白，在体外表达体系中即使表达出来，亦 较难分离纯化。故一般采用考察所表达的蛋白对外加底物的催化活性的方 法来进行功能鉴定。
在所采用的酿酒酵母表达体系中，受体菌是尿嘧啶缺陷型INV & I， 本身不含LA (亚油酸)、ALA (a-亚麻酸)、GLA (y-亚麻酸)禾H SDA， 因此，在添加底物亚油酸的条件下，如若在酵母工程菌中检测到催化产物 GLA或SDA，就可以确定外源基因所编码蛋白在酿酒酵母表达体系中获 得了表达，对外加底物产生了催化作用。所以酿酒酵母已经作为研究外源 的A6、 Al2-脂肪酸脱氢酶基因功能性鉴定的最常用、最有效的表达体系， 且己有许多成功的研究报道[4， 6， 7]。脂肪酸的检测主要采用GC — MS(气相色谱一质谱联用技术)来完成。其原理是通过GC (气相色谱)将 不同的脂肪酸组分分离，然后通过MS (质谱)检测器分别对每种组分进 行质谱定性分析，从而确定每一种组分的成分及含量的比较成熟的联用分 析技术。
本发明的又一个目的是提供一种含基因7 D6C、 T^D6D的植物表达 载体。可使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。这些 植物表达载体包括但不限于，双元农杆菌载体，例如pBIN19、 pBI121、 pB221， pCambia 1300， pGreen等的植物表达载体。
本发明的载体也可含有适当的启动子。在本发明中可使用任何一种强 启动子。这些启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV35S)、 Ubiqutin、 Actin启动子。它可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
本发明的表达载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直 接的DNA转化，微注射，电穿孔等方式导入植物细胞。
可使用本发明的方法转化的低等真核宿主选自由酵母、藻类等低等真 核生物组成的组。
可使用本发明的方法转化的植物宿主包括烟草、油菜、向日葵、大豆、 番茄、蓖麻、芝麻和花生等植物。
本发明还涉及基因i "D6C、 A/7D(5D在生产GLA和SDA中的应用。


图1. i "D6C片段核苷酸序列，SEQIDN0:1。 图2. /67D6Z)片段核苷酸序列，SEQIDNO:2。
图3.基因i^D6C所编码的多肽序列，SEQIDNO:3，其中划线部分
分别为Cytb5功能域和三个His Box功能域。 图4.基因i MD6D所编码的多肽序列，SEQIDNO:4，其中划线部分
分别为Cytb5功能域和三个His Box功能域。 图5.基因AmD6C和i^D6D的酵母表达载体图。 图6.基因/^D6C和/ "Z)6D的植物表达载体图。a)以潮霉素(Hyg)
作为筛选标记的/ "D6C/D的植物表达载体图；b)去除筛选标
记的i^A5C/D的植物表达载体图。
图7.基因/^D6C和在酿酒酵母表达中表达的总脂肪酸 GC-MS分析
a) INV&I酵母菌株脂肪酸组成的GC-MS;
b) INV&I酵母菌株脂肪酸组成和加有LA(亚油酸)、GLA(， 亚麻酸)标准样品的GC-MS;
c) 含空载pYES2表达质粒酵母的总脂肪酸GC-MS;
d) 含空载pYES2表达质粒酵母在添加LA底物诱导后的总脂肪 酸GC-MS;
e) 表达i "Z)(5C基因的酵母在添加LA底物诱导后的总脂肪酸 GC-MS，红色箭头所指为产物峰；
f) 表达A"Z)6Z)基因的酵母在添加LA底物诱导后的总脂肪酸 GC-MS，红色箭头所指为产物峰；
g) 含空载pYES2表达质粒酵母在添加ALA底物诱导后的总脂 肪酸GC-MS;
h) 表达/^D(5C基因的酵母在添加ALA底物诱导后的总脂肪酸 GC-MS，红色箭头所指为产物峰；
i) 表达i "D6D基因的酵母在添加ALA底物诱导后的总脂肪酸 GC-MS，红色箭头所指为产物峰；
j)由napin启动子启动i "D(5Z)基因表达的转基因油菜H165种
子的总脂肪酸GC-MS，红色箭头所指为产物峰； k)对照一未转化的油菜H165种子的总脂肪酸GC-MS。 图8.酿酒酵母中/ "A5C、 i^D6D基因表达催化产物GC-MS分析中 MS图谱，a: i^2D6C、 7 mZ)6D的酵母表达催化产物GLA的MS图；b: y_ 亚麻酸标准品的MS图。
具体实施例方式
下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以 理解的是，下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本 发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。
实施例一、J wD6C、及"Z)6Z)基因的获得
1. 黑茶薦子基因组DNA的制备
以北京植物园中种植的黑茶薦子(化6" m'gr臓L.)活体植株为材料，取 其幼嫩叶片(约100mg)，于7mlEp管中加入钢珠(直径5mm)，置于 液氮中冷冻20-30 min，于漩涡器上高速破碎，反复操作2-3次，至材料完 全破碎。加入1-2 ml预热的CTAB抽提液(参见"精编分子生物学实验指 南"2001，科学出版社，颜子颖，王海林译)，混匀。65。C水浴30 min。 加入等体积氯仿，轻柔抽提约5 min。于12 000 rpm室温离心10 min。取 上清，加入1/2体积异丙醇混匀，室温放置10 min沉淀DNA。用Tip头 将沉淀出的DNA挑出，用70%乙醇中洗涤两次，于70%乙醇中室温放置 30min。除去70%乙醇，空气中吹干。溶于适量灭菌ddH20， -20"保存。
2. / "D6C、 i^D6Z)DNA片段的克隆
设计引物分别从前面所提取的DNA中克隆i^Z)6C、 i "Z)6D的 DNA片段。所用反应体系如下 PCR反应体系(50^1):
PCR产物电泳(1%琼脂糖凝胶浓度)后切胶回收目的片段 (/ D6C、 W"D6D，约1.3 kb)，连入pGEM-T载体(购自Promega
公司)，测序验证。
DNA模板1 nl (50 ng)
pfu: 0. 5 pl
10X buffer: 5 )al
正向引物2.5 pi
反向引物2.5 pi
dNTP: 2 pi
H20: 36.5 pi
PCR程序:预变性95。CX 4 min，变性94'CX 30 s, 退火50。CX 40 s，延伸72。CX 1 min 30s、 25个循 环，延伸72°CX 10 min。
所用引物分别如下
1) . i "D6CDNA片段的克隆所用引物 正向引物
I
5'-CGCGGGTACCATGGCTAATGCAATCAAG-3' (SEQ ID NO:5 )
反向引物 I
5'- CGCCGAGCTCTCAGCCATAGGTGTTGAC -3' (SEQ ID NO:6)
2) . i "Z^DDNA片段的克隆所用引物
正向引物 ^cw I
5，-CGCGGGTACCATGGGTGAAAATGGAAGG-3， ( SEQ ID NO:7)
反向引物 I
5，-CGCCGAGCTCTCAACCATAGGTGTTGAC-3， (SEQ ID NO:8)
实施例二、 / "P6C、及"i)6Z)基因酵母载体的构建
从含有基因/^D6C和A"D(5Z)的pGEM-T载体中，利用AT; "I、 &c I 酶切位点，双切后获得i "D6C和W"Z)6D基因，定向克隆于酵母表达载体 pYES2 (购自Ivitrogen公司)，获得酵母表达质粒pYRnD6C和pYRnD6D， 转化大肠杆菌DH-5a (由本实验室保存)保存。其载体图见图5。
实施例三、i wZMC、及rtZ)6Z)基因在酵母中的表达
1. 酵母的转化
参照Invitrogen公司pYES2Kit(Cat# V285-20)所述方法，将上述嵌 合基因的酵母表达质粒pYRnD6C和pYRnD6D，采用醋酸锂介导转化酿 酒酵母营养缺陷型菌株INVSc I (购于Invitrogen公司)，以空载pYES2 质粒为对照，获得含有各表达质粒的酵母细胞。
2. 转化酵母细胞的诱导表达
取含目的基因酵母表达质粒转化的酵母单菌落，接种于50 ml SC-U培 养液(参照Invitrogen公司pYES2 Kit所述配方)含2%绵子糖的SC-U培 养液中，250rpm， 28°C，培养过夜；加入NP-40 (购自BBI公司)(终浓
度1%)、外源亚油酸和a-亚麻酸底物(购自Sigma公司)(终浓度为
0. 003.)，以及酵母表达诱导物D-半乳糖(购自Amresco公司)(终浓度 为2%) 250rpm， 22。C培养48 h诱导表达。
实施例四、及"D6C、 i ""6Z)基因酵母表达物对Al旨肪酸脱氢酶底物催化 产物的GC-MS分析
1. 脂肪酸的提取与甲酯化。
离心收集取诱导后的酵母菌体，去离子水洗涤，5(TC烘干。取40mg 酵母粉(在实例3.2中所诱导获得的酵母经5(TC烘干即得)充分研磨，加. 入5 ml 5% KOH-CH3OH， 70。C水浴5 h后加入HC1酸化至其pH值达2.0。 再加入4ml 14%BF3-CH3OH (购自A'ldtich公司)溶液，70。C水浴1.5h。 加入2ml0.9。/。NaCl溶液，混匀后静止片刻。加入2ml氯仿正己烷(V/V l:4滩提，吸取抽提液，N2吹干。最后溶于100(il乙酸乙 酯。
2. 终产物GC-MS检测分析实验。
所用GC-/MS仪为TurboMass (PerkinElmer公司)，柱子BPX-70， 30 m x0.25 mmx0.25 vm，柱温120°C ，气化室温度230°C 。取1 pl终产物
上样，分流比10: 1。
3. GC-MS结果分析。
对比图7-la、 7-lb和7-lc，表明在不添加亚油酸底物条件下，所用 酵母工程植株以及含经诱导的空载pYES2表达质粒酵母中没有新的产物 峰出现，说明所用酵母工程菌株及空载pYES2表达质粒酵母的总脂肪酸 中不含外加底物亚油酸(LA)、 a-亚麻酸(ALA)和催化产物y-亚麻酸 (GLA)、十八碳四烯酸(SDA)。
当添加亚油酸底物，并进行诱导表达时，对照(空载pYES2)亦没 有产物峰，亚麻酸(GLA)的出现(参见图7-ld)。而pYRnD6C/D的酵 母表达菌被诱导后，外加底物亚油酸(LA)可以被催化生成，亚麻酸(GLA) (参见图7-le和7-lf)。
对比图7-ld、 7-le禾P7-lf，可以发现在保留时间为7.25min左右时，
有一个新的物质生成。其出峰时间和质谱图与标准品Y-亚麻酸(购自Sigma 公司)的峰图及质谱图一致(参见图8a和图b)，确定为Y-亚麻酸。
当添加a-亚麻酸底物，并进行诱导表达时，对照(空载pYES2)亦 没有产物峰SDA的出现(参见图7-2g)。而pYRnD6C/D的酵母表达菌被 诱导后，外加底物oc-亚麻酸可以被催化生成SDA (参见图7-2h和7-2i)。
对比图7-2g、 7-2h禾Q7-2i，可以发现在保留时间为7.75 min左右时， 有一个新的物质生成。根据其出峰时间和质谱图确定为SDA。
以上结果证明来源于黑茶薦子的两个基因/ "D6C、 A"Z)6Z)在酿酒酵 母中成功表达，所表达的蛋白可以分别催化底物亚油酸(LA)和a-亚麻 酸(ALA)生成丫-亚麻酸和SDA。
实施例五、及""6C、 Z wiMZ)基因植物表达载体的构建
1. wa; /"启动子napin-T中间载体的构建
提取(芥菜型)油菜总DNA，(方法参见实施例1.1)。 "，/"启动子 片段的克隆所用引物
正向引物Hind III
5'-CGCGAAGCTTACTACAATGTCGGAGAGACAAGG-3' ( SEQ
ID NO:9)
反向引物BamHI
5 '-CGCGGGATCCTTGTGTATGTTCTGTAGTGATGAGTTTTG-3' (SEQIDNO:IO)
用Pyrobest DNA Polymerase PCR扩增(反应体系参见实施例1.2)， PCR产物电泳(1%琼脂糖凝胶浓度)后切胶回收目的片段(约1.S kb)， 连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，测序验证。
2. W"D6C、 /^Z)6D基因的RnFD6C/D-T中间载体的构建
根据i^FD6C/D的基因序列，分别设计含酶切位点为S画//1和&c I 的上下游特异引物，用Pyrobest DNA Polymerase扩增目的片段i "FD6C 和^FD6D，回收目的片段定向克隆到pGEM-T载体上，挑取单菌落，经 PCR、酶切和测序验证，得到RnFD6C/D-T中间载体。3. i^D6C、 i^D6D基因的植物表达载体的构建
1) pC1300-napin的构建
用///"dill和SamH I分别双酶切Napin-T和pCambia 1300，并回 收朋p/"启动子片段和pCambia 1300载体片段，连接转化大肠杆菌， 随机挑取单克隆，经PCR，酶切验证得到替换35S启动子为"^/"启动 子的pC1300-napin植物表达载体。
2) pC300-nRnD6C/D植物表达载体的构建
用5amH I和I分别双酶切RnD6C/D-T和pC1300-napin,并回 收i "D6C/D目的片段和pC1300-napin载体片段，连接转化大肠杆菌， 随机挑取单克隆，经PCR，酶切验证得到pC1300-nRnD6C/D的植物表 达载体。其载体图见图6a。
3) 去除潮霉素(Hyg)筛选标记的pC1300-nRnD6C/D的构建
在构建好之后，用屈ol单酶切，然后回收大片断，连接转化后， 随机挑取单克隆进行PCR、酶切验证获得去除潮霉素(Hyg)筛选标记 的pC1300-nRnD6C/D植物表达载体。其载体图见图6b。
实施例六、及w/MC、 / "D6"基因及在植物中的转化
1. 植物表达载体转入农杆菌
挑取农杆菌单菌落接种在5 ml YEP液体培养基中，28°C, 200 rpm，振荡 过夜培养。将2ml过夜培养的菌液加到含有50mlYEP培养基中，28"C， 220 rpm，振荡培养至OD綱在0.5-1.0之间。5 000 rpm离心菌液，弃上清，沉淀 悬浮于10ml0.5MNaCl， 4°C, 5 000 rpm离心5 min,弃上清，用lml预冷的 20 mM CaCl2重悬细胞。取0.2 ml加入约0.5-l吗质粒DNA,轻轻混匀,液 氮速冻l min， 37"C热激5 min，加入l ml YEP溶液，28。C振荡培养2-4 h。 5 OOOrpm离心菌液，弃上清，将细胞重悬于0.2mlYEP培养基中，均匀涂布 在含Kan的YEP平板上，28。C培养48h。随机挑取单菌落进行PCR和酶切验 证。
2. "or^-力》法转化油菜(H165)
选择初花期的甘蓝型油菜植株处理，前l d田间浇透水。去除主花序 和每个分枝花序的顶端花蕾，同时除去已开放的花朵，只保留快要开放的 花蕾用于转化。
用10 ml新鲜的YEP+kan的培养基28i:过夜培养含有目标基因植物表 达载体的农杆菌至次日10: 00，再取5ml转入100ml新鲜的YEP+kan的培 养基，过夜培养22h。 2 500 rpm离心农杆菌菌液，弃上清后，用100ml转 化Bufer(MS基本培养基+蔗糖5X+Silwet-77， pH5. 8)重悬至OD6。『1.0后 浸渍油菜花序。10 d内间隔l d连续处理5次。浸渍完后套上纸袋。浸渍处 理24 h后除去纸袋直至收获种子。
实施例七、Tl代种子的筛选
对浸渍处理后获得的油菜T1代种子经75X酒精表面消毒30 s， 0. 1% HgCl2消毒IO min，铺在预先倒好的筛选培养基上，经7 15 d筛选培养， 将正常生长的绿色苗进行第2次抗性筛选(7 15 d)，将第2次筛选后的抗 性植株进行第3次抗性筛选(7 15 d)，第2次，第3次筛选培养基为 Ms+Kan(150 mg / L)。将第三次筛选后的绿苗转入花盆，温室培养至种子 收获。
对于用含有去除筛选标记的pC1300-nRnD6C/D的农杆菌处理后获得 的T1代油菜种子直接播种于田间，提取叶片DNA，通过PCR筛选阳性植株。
实施例八、及"ZMC、 / "62>基因植物表达物对厶6脂肪酸脱氢酶底物催化 产物的GC-MS分析
1. 脂肪酸的提取与甲酯化。
取50-100 mg成熟对照或转基因油菜种子，液氮中充分研磨，加入5 ml 5% KOH-CH3OH， 7(TC水浴5 h后加入HC1酸化至其pH值达2.0。再 加入4ml 14%BF3-CH3OH (购自Aldtich公司)溶液，70。C水浴1.5 h。加 入2 ml 0.9% NaCl溶液，混匀后静止片刻。加入2 ml氯仿正己烷(V/V 1:4) 抽提，吸取抽提液，N2吹干。最后溶于lOO)al乙酸乙酯。
2. 终产物GC-MS检测分析实验。
所用GC/MS仪为TurboMass (PerkinElmer公司)，柱子BPX-70， 30 m x0.25 mm><0.25 vm，柱温120°C ，气化室温度230°C 。取1 pl终产物 上样，分流比10: 1。
3. GC-MS结果分析。
对比图7-2j和7-2k，与未进行转化的油菜种子对照相比，转化株油 菜出现两个新的产物峰，与标准品和酵母GC-MS结果比较，可以发现 在保留时间为7.25min左右时，出现GLA的产物峰；在保留时间为7.75 min左右时，出现SDA的产物峰。以上结果证明来源于黑茶薦子的基因 i oD6D在油菜种子中成功表达，所表达的蛋白可以分别催化底物亚油酸
(LA)和a-亚麻酸(ALA)生成GLA和SDA。这也就表明，将W"A5C/D 转入油菜，可以用转基因油菜作为生物反应器生产GLA和SDA。
参考文献
1. Gunstone FD (1992) Gamma linolenic acid-occurrence and physical and chemical properties. Prog Lipid Res 31:145—161.
2. Horrobin DF (1992) Nutritional and medical importance of gamma-linolenic acid. Prog Lipid Res 31: 163—194.
3. Huang YS and Milles DE (1996) Gamma-Linolenic Acid: Metabolism and Its Roles in Nutrition and Medicine. AOCS Press, Champaign, IL.
4. Sayanova O, Smith MA， Lapinskas P, Stobart AK, Dobson G, Christie WW, Shewry PR and Napier JA (1997) Expression of a borage desaturase cDNA containing an N-terminal cytochrome b5 domain results in the accumulation of high levels of A6-desaturated fatty acids in transgenic tobacco. Proc Natl Acad Sci USA 94:4211~4216.
5. Hyekyung PC, Manabu TN and Steven DC (1999) Cloning, Expression, and Nutritional Regulation of the Mammalian A6- Desaturase. J Biol Chem 274(1):471~477.
6. Hong HP, Datla N, Reed DW., Covello PS, MacKenzie SL and Qiu X (2002) High-Level Production of "y-Linolenic Acid in Bra肌'ca Using a A6 Desaturase from i^yZ/ z'訓z>regw/<are. Plant Physiol 129: 354—362.
7. Napier JA, Hey SJ， Lacey DJ and Shewry PR (1998) Identification of a G3e朋r/wW"s e/egam1 A6-fatty-acid-desaturase by heterologous expression in 5""cc/^o，ces cerev/w'ae. Biochem J 330: 611—614.
8. Qiu X, Hong HP, Datla N, MacKenzie SL， Tayler CD and Thomas LT (2002) Expression of borage A6- desaturase in fecc/zar簡yces cerew'57.ae and oilseed crops. Can J Bot 80:4249.
9. Cook D, Grierson D, Jones C, Wallace A， West G and Tucker G (2002)
Modification of fatty acid composition in tomato (Z^copera/co" escw/e齒m) by expression of a borage Z^-desaturase. Mol Biotechnol. 21(2》123-128.
10. Sayanova O, Smith MA， Lapinskas P, Stobart AK, Dobson G, Christie WW, Shewry PR and Napier JA (1997) Expression of a borage desaturase cDNA containing an N-terminal cytochrome b5 domain results in the
accumulation of high levels of △ -desaturated fatty acids in transgenic tobacco. Proc Natl Acad Sd USA 94: 421 l~4216 l 1. Sato S, Xing AQ, Ye XG, Schweiger B, Kinney A, Graef G and Clemente T (2004) Production of y-Linolenic Acid and Stearidonic Acid in Seeds of Marker-Free Transgenic Soybean. Crop Sci 44:646-652.
12. Ucciani E (1995) Nouveau Dictionnaire des Huiles V6g6tales -Composition en Acides Gms. Lavoisier, Paris pp 3—596.
13. Gyves EM, Sparks CA, Sayanova O, Lazzeri P, Napier JA and Jones HD (2004) Genetic manipulation of y-linolenic acid (GLA) synthesis in a commercial variety of evening primrose(Oe"o /2era s/ .) Plant Biotech 2 (4): 351-357.
序列表
<110〉中国科学院遗传与发育生物学研究所 〈120〉具有A6脂肪酸脱氢酶功能的基因及其应用
〈130〉 1
<160> 8
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211〉 1347
<212〉 腿
〈213〉 Ribes nigrum L
<400〉 1 atggct3at.gcaatcsaga.3gtacatgacagttgaggagc"taacaagcca60
g3gg3tUgtggat,CT.Ct,3t,tcsgggtsaggttt3C33tggasaaaggaa120
C3CCC3ggtgggg3tagctctctcctgaatCt3ggtggtCa.agatgtcac3g8tgC3ttC180
3ttgCtt3t,C3t,ccaggtactgcttggcaa.tatcttgaca.ggttCttt3Ctgggtstm240
ctcaaagatttC33tgtCt,C3gatgtatccaaa.gattataga333CttgCatctgagttt300
sccaaaatgggtcttttt,gcaaaga,3agggC3tggtgUttctactccttUgtcttggg360
gcattcttgt,ttgct.gtttgtgtttatggtgttttgtsnctcaaagtttgtttgtgcat420
t.tgtgttgtggtgggattt,tggggtmtatggatgcaaagtggttatgctggtx3cgat柳
tCtgggC3tt3tCag3C38tgtctsctcctttttatacca3tttggctcaaattcttact540
gg338ttgCCtt3gtggt3ttagtatggcttggtgg333tgg3CCC3C33tgctcsccac600
gttgctgttastagtattgaccatgaccctgstcttcagt3C3tgCC3ttttttgtcctc660
tctcccaaattgttca.atggcataacttctCgCtttt3tgggaggaagttggagl:Ug3t720
gcttttgctaggUC3tggtaagttatcagcattggacattttatccggtgatgattttt780
gC3Cg3ttUatatgtttgtgcccacgttttttatgttgctttcaaagaaaaaagtaccc840
sacagacctttgaatatagcgggaattaUgtgUctggatttggtttcctcttcttgtt900
tcat.gcctt.cccasttggsctgagaggatg3tgtUgtgCtagtgagcttt3C3gtt3Ct960
tc3a1;l:.c33C3Cgtt3C3ttttgtt"tgaatcactact,cggctgataattatatgggacat1020
cctactggg3acg3ttggtttgagaagcagscaagtgggaCtttgg3C3tttcgtgcccg1080
tcttggatggattggtttcatggtgggctgC33ttCC333ttgagcatca.tttgtt,ccca1140
agattgcctcg3tgccagcttaggaaggtctctccttttgtgaaagagctttgcaagaaa1200
cacaatttgccttatagg'agttt.3tC3t.tttttgaggcca3tgttgcaatcattasgacg1260
ttg3ggactgccgcct.t,gcsagctcgcgacCt3tCC33CCctatttcaa.31320
tggga3gctgtcsacacct3tggctga1347
〈210> 2
〈21" 1347
<212〉 DNA
<213〉 Ribes nigr固L.
<400> 2 3tgggtg333atgg3agga,agtacatgacagttg3gg3gCtaaaagtgcat33ta3gCC360
gaggatt.tgtgg3tctct,attcagggtaaggttt8C33tgtcsctgattggaaaaaggaa120
C3CCC3ggtgggg3t3gCtCactcct,gaatctgggtggtcaag3tgtcac3g3t,gC3ttC180
3ttgcttatcatccaggtactgtttggcsatatcttgacaggttctttactgggtsttat,240
CtC333g3tttC333gtctC3g3tgt3tCCaaagattacagaaa.ac"ttgcatctgagttt300
accaaaatgggtctttttgccatggtgttttctsctccttttgtcttggg360
gcatt,cttgttt.gctgtttgtgttt3tggtgttttgtattctcaaag"tttgtttgtgcat420
ttatgUgtggtgggattttggggtUtta.tggatgcaaa.gtggtmgctggtcat.gat480
tctgggcattaccagacaatgtctactcc"tttttataccaatttggctcaaattcttact540
ggsaattgccttagtggtattagt8tggc1:tggtggsaatggacccacaatgctcaccac600
3ttgctgttaatagtattga,CC3tg3CCCtgatcttcagtacatgccattttttgttctc660
tCtCCC333ttgttC33tagC8"t3act"tCtCgCtttt3t.gggagg33gttggagtttgat720
gCttttgCt3ggttC3t,ggtgagUatcagcattgg3cattttatccggtgatgattttt780
gC3Cg3tttt3t3tgtt"tgtgCCt3Cgttttttttgttgctttcaaagaaaaaagtaccc,
33C3g3CttttgS3t3t3gCtggaattattgtgttctggatttggtttcctcttcttgtt900
tcatgcctacccaattggactg柳ggatgatgtttgtgct3gtg3gCtttscggttact960
tcaattcaa.cacgttacattttgtttgastcactactcggctgataattatatggga.cat.1020
CCt3Ctggg3acgattggtttgaaaagcagacaa.gtgggactttggacatttcgtgcccg1080
tCttgg3tggattggtttca.tggtgggctgcaattccaact"tgagcatcatttgttccct1140
cgaatgcctcg3tgtC3gCtt3gg33ggtCt.ctccttttgtg33gg33Ctttgccagaag1200
C3t33tt.tgCCtt3t3gg3gtttgtC3tttttcgaggcca.atgtcgcgaccattaagacg1260
ttgaggactgC3gCCtt,gC3agctcgtgacctgtccaaccctattacaaagaatttgcta1320
tggga早tgtcaac3cct3tggttg31347
<210〉 3
<211> 448
<212> PRT
<213> Ribes nigrum
<柳> 3
Met Ala 1
Asn Ala lie Lys Lys Tyr Met Thr Val Glu Glu Leu Lys Val
5
10
15
His Asn Lys Pro Glu Asp Leu Trp lie Ser lie Gin Gly Lys Val Tyr
20
25
30
Asn Val Thr Asp Trp Lys Lys Glu His Pro Gly Gly Asp Ser Ser Leu 35 40 45
Leu Asn Leu Gly Gly Gin Asp Val Thr Asp Ala Phe lie Ala Tyr His
50
55
60
Pro Gly Thr Ala Trp Gin Tyr Leu Asp Arg Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr
65
70
75
80
Leu Lys Asp Phe Asn Val Ser Asp Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu 85 90 95
Ala Ser Glu Phe Thr Lys Met Gly Leu Phe Ala Lys Lys Gly His Gly
100
105
110
Val Phe Tyr Ser Phe Cys Leu Gly Ala Phe Leu Phe Ala Val Cys Val
115
120
125
Tyr Gly Val Leu Tyr Ser Gin Ser Leu Phe Val His Leu Cys Cys Gly
130
135
140
Gly lie Leu Gly Phe Leu Trp Met Gin Ser Gly Tyr Ala Gly His Asp
145
150
155
160
Ser Gly His Tyr Gin Thr Met Ser Thr Pro Phe Tyr Thr Asn Leu Ala
165
170
175
Gin lie Leu Thr Gly Asn Cys Leu Ser G、'lie Ser Met Ala Trp Trp 180 185 190
Lys Trp Thr His Asn Ala His His Val Ala Val Asn Ser lie Asp His
195
200
205
Asp Pro Asp Leu Gin Tyr Met Pro Phe Phe Val Leu Ser Pro Lvs Leu 210 215 220
Phe Asn Gly lie Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Leu Glu Phe Asp
225
230
235
240
Ala Phe Ala Arg Phe Met Val Ser Tyr Gin His Trp Thr Phe Tyr Pro 245 250 2&
Val Met lie Phe Ala Arg Phe Tyr Met Phe Val Pro Thr Phe Phe Met
260
265
270
Leu Leu Ser Lys Lys Lys Val Pro Asn Arg Pro Leu Asn lie Ala Gly
275
280
285
I〗e I〗e Val Phe Trp lie Trp Phe Pi-o Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro
290
295
300
Asn Trp Thr Glu Arg Met Met Phe Val Leu Val Ser Phe Thr Val Thr 305 310 315 320
Ser lie Gin His Val Thr Phe Cys Leu Asn His Tvi- Ser Ala Asp Asn 325 ' 330' 335
Tvr Met Gly His Pro Thr Gly Asn Asp Trp Phe Glu Lvs Gin Thr Ser 340 345 350
Glv Thr Leu Asp lie Ser Cys Pro Ser Trp Met Asp Trp Phe His Gly 355 '360 365
Gly Leu Gin Phe Gin lie Glu His His Leu Phe Pro Arg Leu Pro Arg 370 375 380
Cys Gin Leu Arg Lys Val Ser Pro Phe Val Lys Glu Leu Cys Lys Lys 385 390 395 400
His Asn Leu Pro Tyr Arg Ser Leu Ser Phe Phe Glu Ala Asn Val Ala 405 410 415
lie lie Lys Thr Leu Arg Thr Ala Ala Leu Gin Ala Arg Asp Leu Ser 420 425 430
Asn Pro lie Ser Lys Asn Leu Leu Trp Glu Ala Val Asn Thr Tyr Gly 435 440 445 '
〈210〉 <211〉 <212〉 <213>
4
448 PRT
Ribes nigrum
<400〉 4
Met 1
Gly Glu Asn Gly Arg Lys Tyr Met Thr Val Glu Glu Leu Lys Val 5 10 沾
His Asn Lvs Pro Glu Asp Leu Trp lie Ser lie Gin Gly Lys Val Tyr 20 25 ' 3i)
Asn Val Thr Asp Trp Lvs Lys Glu His Pro Gly Gly Asp Ser Ser Leu 35 40 45
Leu Asn Leu Glv Gly Gin Asp Val Thr Asp Ala Phe lie Ala Tyr His 50 55 60
Pro Gly Thr Val Trp Gin Tyr Leu Asp Arg Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr 65 '70 75 ' 80
Leu Lys Asp Phe Lvs Val Ser Asp Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu & 90 95
Ala Ser Glu Phe Thr Lys Met Gly Leu Phe Ala Lys Lys Gly His Gly 100 105 110
Val Phe Tvr Ser Phe Cys Leu Gly Ala Phe Leu Phe Ala Val Cvs Val 115 120 125
Tvr Gly Val Leu Tyr Ser Gin Ser L_eu Phe Val His Leu Cys Cys Gly 130 135 140
GIy lie Leu Gly Phe Leu Ti—p Met Gin Ser Gly Tyr Ala Gly His Asp 145 150 15^ 160
Ser GIy His Tvr Gin Thr Met Ser Thr Pro Phe Tvr Thr Asn Leu Ala 165 170 175
Gin lie Leu Thr Gly Asn Cvs Leu Ser Gly lie Ser Met Ala Trp Trp 180 185 190
Lys Trp Thr His Asn Ala His His lie Ala Val Asn Ser lie Asp His 195 200 205
Asp Pro Asp Leu Gin Tyr Met Pro Phe Phe Val Leu Ser Pro Lys Leu 210 215 220
Phe Asn Ser lie Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Arg Lys Leu Glu Phe Asp 225 230 235 240
Ala Phe Ala Arg Phe Met Val Ser Tyr Gin His Trp Thr Phe Tyr Pro 245 250 255
Val Met lie Phe Ala Arg Phe Tyr Met Phe Val Pro Thr Phe Phe Leu 260 265 270
Leu Leu Ser Lys Lys Lys Val Pro Asn Arg Leu Leu Asn lie Ala Gly 275 ' 280 285
lie lie Val Phe Trp lie Trp Phe Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro 290 295 300
Asn Trp Thr Glu Arg Met Met Phe Val Leu Val Ser Phe Thr Val Thr 305 310 315 320
Ser lie Gin His Val Thr Phe Cys Leu Asn His Tyr Ser Ala Asp Asn 325 330 335
Tyr Met Glv His Pro Thr Gly Asn Asp Trp Phe Glu Lys Gin Thr Ser 340 345 350
Gly Thr Leu Asp lie Ser Cys Pro Ser Trp Met Asp Trp Phe His Gly 355 360 365
Gly Leu Gin Phe Gin Leu Glu His His Leu Phe Pro Arg Met Pro Arg 370 375 380
Cys Gin Leu Arg U's Val Ser Pro Phe Val Lys Glu Leu Cys Gin Lys 385 390 3& 400His Asn Leu Pro Tyr Arg Ser Leu Ser Phe Phe Glu Ala Asn Val Ala 405 410 415
Thr lie Lvs Thr Leu Arg Thr Ala Ala Leu Gin Ala Arg Asp Leu Ser 420 425 430
Asn Pro lie Thr Lys Asn Leu Leu Trp Glu Ala Val Asn Thr Tyr Gly 435 440 445
〈210> <211〉 〈212> 〈213>
5
28 DNA
人工序列
<400〉 5
cgcgggtacc a.tggctaatg caatcaag
28
<210〉 <211〉 〈212〉 <213〉
6
28 魏
人工序列
<400> 6
cgccgagctc tcagccatag gtgttga
28
〈210〉 〈211> <212> 〈213〉
7
28 DNA
人工序列
<400> 7 cgcgggtacc
atgggtgaaa atggaagg
28
<210〉 <211> 〈212〉 〈213〉
8
28 DNA
人工序列
〈400〉 8
cgccgagctc tcaaccatag gtgttgac
28
〈210> 9 〈211〉 33 <212> 隨<213〉 人工序列
<400〉 9
cgcgaagctt actacastgt cggag3gaca agg <210〉 10 <211〉 39 〈212〉 DNA <213〉 人工序列
〈400> 10
cgcgggatcc ttgtgtatgt tctgtagtga. tgagtttg
权利要求
1.基因RnD6C，其核苷酸酸序列如SEQ ID NO1所示。
2. 基因i^D6D，其核苷酸酸序列如SEQIDNO:2所示。
3. 权利要求l的基因W"D(5C所编码的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。
4. 权利要求2的基因i^D6D所编码的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5. —种表达载体，其特征在于包含权利要求l和/或2所述的基因。
6. 权利要求5的表达载体，其为低等真核细胞表达载体或植物表达载体。
7. 权利要求6的表达载体，其中低等真核细胞表达载体选自pYES2等用 于低等真核细胞表达的载体。
8. 权利要求6的表达载体，其中所述植物表达载体选自pBIN19、pBI121、 pB221、 pCambia 1300， pGreen等的植物表达载体。
9. 权利要求5的表达载体，其特征在于还包含启动子，所述启动子选自 花椰菜花叶病毒CaMV35S、 Ubiqutin、 Actin、或植物组织部位特异表 达启动子，所述启动子单独或与其它植物启动子结合使用。
10. —种宿主细胞，其特征在于包含权利要求5的表达载体。
11. 权利要求10的宿主细胞，其中所述表达载体是通过Ti质粒、Ri质 粒、植物病毒表达载体、直接的DNA转化、微注射或电穿孔的方式导 入。
12. 权利要求10的宿主细胞，其为低等真核细胞或植物细胞。
13. 权利要求12的宿主细胞，其中所述低等真核细胞为酵母、藻类等 的细胞，所述植物细胞包括烟草、油菜、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、 芝麻和花生等细胞。
14. 权利要求1的基因i "I)6C或权利要求2的基因hZ)6Z)在生产GLA 和SDA中的应用。
全文摘要
本发明利用来源于黑茶藨子(Ribes nigrum L.)DNA中的两个具有完整阅读框架的基因RnD6C和RnD6D，将其在酵母表达体系中进行了表达。通过GC-MS分析表明，在酵母中这两个基因所编码的蛋白可以分别催化外加底物亚油酸(LA)和α-亚麻酸(ALA)分别生成γ-亚麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(SDA)，具有Δ⁶脂肪酸脱氢酶功能。本发明可应用于采用基因工程技术以低等真核细胞表达体系和植物表达体系生产GLA和SDA。
文档编号C12N15/53GK101353661SQ20071011947
公开日2009年1月28日 申请日期2007年7月25日 优先权日2007年7月25日
发明者宋丽英, 尹维波, 岩 张, 军 胡, 胡赞民, 陈宇红 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所