专利名称：一种制备7-氨基头孢烷酸的方法
技术领域：
本发明涉及药物合成领域，具体涉及一种采用微生物方法来制备7-氨基头孢烷酸。
背景技术：
7-氨基头孢烷酸，分子量为272. 27，是头孢菌素(β内酰胺类)抗生素关健中间体。生产过程是通过生物发酵、化学提炼制取头孢菌C，再由头孢菌C化学裂解或酶解成 7-氨基头孢烷酸。7-氨基头孢烷酸有两个活性基团，3-位的乙酰氧基和7-位的氨基，在这两个活性基团上连接不同的侧链，就构成不同性质的头孢类抗生素，可以生成80余种下游头孢抗生素产品，如头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢美唑钠、头孢呋辛钠、头孢哌酮钠等，因此已成为当今国际抗生素市场的主角。目前国际上生产国家主要集中在意大利、奥地利和西班牙，由于他们大多采用酶法工艺生产，因而7-氨基头孢烷酸产品的化学溶媒残留少、 纯度高，一直牢牢占据欧美高端法规市场。国内生产企业主要是采取化学裂解法工艺生产， 在生产工艺和质量控制上与国外先进的生产企业还有一定的差距。现有技术主要是采用化学裂解法来生产7-氨基头孢烷酸，其主要不足有Α.防火防爆要求高。化学法所使用的原材料包括大量的溶媒，这些溶媒在生产过程以及回收过程中具有很强的挥发性以及易燃易爆，其对防火防爆要求等级很高。B.环境污染大。化学法在反应过程中使用大量的二氯甲烷、苯胺和氯硅烷等均为有毒有害的强烈污染源，这些污染源在生产过程中产生的大量高COD、难生化的废水、有害的废气等的治理成本很高。C.生产成本高。化学法生产7-氨基头孢烷酸的通常步骤为酯化、氯化、醚化、水解、结晶等5个步骤，在生产过程中的使用的溶媒还需专门的回收车间建立回收工序进行回收，同时化学法在生产过程中使用了多种有机溶剂以及蒸汽，承担着较重的能耗成本以及治污成本。D. 反应条件苛刻生产过程不易控制。化学法必须在无水条件下反应，所以必须使用头孢菌素 C钠盐固体投料，头孢菌素C必须通过结晶干燥除去水分后才能用于7-氨基头孢烷酸的生产。E. 7-氨基头孢烷酸结晶液中杂质多，容易对其结晶过程产生不利影响，造成产品晶型不好，含量低，色级高，稳定性差并且残留溶媒多。另一方面，由于7-氨基头孢烷酸分子内含有比较活泼的内酰胺环和游离的伯氨基，稳定性相对较差。在长途运输以及室温放置时间较长时，内酰胺环可能开环，产生的杂质包括去乙酰7-氨基头孢烷酸及去乙酰氧基 7-氨基头孢烷酸等，并会进一步形成高分子聚合物.
发明内容
针对以上问题，本发明提出了一种酶法裂解法制备7-氨基头孢烷酸的方法，使生产过程大大简化，发酵得到的头孢菌素C不需结晶就可用于酶解，生产过程中没有用到有毒溶剂，省掉加保护剂和去保护剂等步骤，产品能够达到高收率、高质量，同时降低成本和减少污染。具体的实施步骤如下在酶反应器中加入头孢菌素C钠盐溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，经双氧水中转后，加GL-7氨基头孢烷酸酰化酶裂解，再经结晶，离心过滤，洗涤，干燥，检验即得 -氨基头孢烷酸，纯度在96%以上。所述的头孢菌素C钠盐溶液的浓度是4%，其配制步骤称取48克头孢菌素C钠盐于1200ml烧杯中，加入适量蒸馏水，充分溶解后，用3N氨水调节PH至7. 0左右，真空抽滤除去不溶物，加蒸馏水至1200ml，20°C恒温水浴备用，取样HPLC分析。所述的氧化酶的投入量为每升头孢菌素C钠盐溶液投入2500U氧化酶。所述的酰化酶的投入量为每升头孢菌素C钠盐溶液投入5000U酰化酶。氧化过程中酶反应器的温度控制在20°C，氧气的流量保持100L/h，反应器罐上压力0. 1 士0. OlMPa，滴加1.5N氨水控制反应pH7. 2 7. 25，每10分钟记录一次pH，当pH上升至7. 6-7. 8时结束反应，取样HPLC分析。中转加双氧水过程是将过氧化氢电极插入氧化反应液中，滴加:3ml过氧化氢的质量分数是10%的双氧水，控制过氧化氢读数l(T40ppm，取样HPLC分析。酰化过程中酶反应器的温度控制在20°C，在氧化中转溶液中滴加3N氨水控制反应pH8. 3 8. 4，控制反应温度20°C，每10分钟记录一次pH值，当PH值能维持3-5min不变时，停止反应，取样HPLC分析。结晶过程是搅拌下在酰化后的溶液中缓慢滴加6N HCL，在30、5分钟内调节PH至 5. 6飞.0，出现沉淀时，暂停加酸，降低搅拌速度，在冰浴中冷却至2、°C，让结晶慢慢析出约 20^30分钟，继续加酸调节PH至4. (Γ4. 2 ；保持溶液在广4°C下，养晶约2 3小时；过滤，用少量冷蒸馏水(2、°C)洗涤两次，丙酮充分洗涤结晶3次，真空抽于；结晶粉置于真空干燥箱中，真空度0. 06^0. IMPa下，温度30 36°C下，干燥4_8h。本发明的显著优点和创新点如下
1、本发明是采用酶法裂解法。它利用生物催化裂解反应，且催化剂可反复使用；反应过程在常温中进行；反应在水相中进行；反应步骤少，副反应少，杂质少。用碳酸氢钠洗脱替代醋酸钠洗脱方法，从而达到降低生产过程的COD总量和清洁生产的目的。减少传统工艺的溶媒结晶、过滤、干燥工序，直接用液体进行酶法裂解。工艺路线达到经济、安全、环保的目的。2、菌种筛选主要优点及创新点
采用分子遗传学和理性化筛选相结合的方法进行，利用两株菌种的不同特性，通过杂交育种，将不同菌株的优良特性集合到一个新菌株中，然后再经诱变、筛选获得具有高产性能、稳定的新型重组体菌株，提高发酵滤液头孢菌素C纯度，提高菌株发酵效价水平。3、头孢菌素C提炼工艺主要优点及创新点
主要是膜技术，包括超滤、纳滤、反渗透等膜技术在头孢菌素C钠盐提炼工艺的运用。 尽可能去除蛋白质和色素；浓缩除水和盐类，提高中间产品的质量从而达到后面酶法裂解的质量要求。从而能够根据自身物料的不同阶段的特性，灵活组合各种膜技术与其他树脂除杂的技术，达到除杂、提高产品质量的目的。4、质量研究上主要优点及创新点
首创7-氨基头孢烷酸蛋白质测定方法，解决7-氨基头孢烷酸生产过程中蛋白质测定方法，从而为工艺去除蛋白质和色素创造了条件；首创了 7-氨基头孢烷酸高分子杂质测定方法，从而实现从源头上控制头孢菌素的高分子杂质；应用先进的LC-MS及LC-MS-MS等技术对7-氨基头孢烷酸可能杂质进行深入研究，从而彻底分析出7-氨基头孢烷酸产品生产过程中可能出现的副产物结构；应用现代分析技术对7-氨基头孢烷酸立体结构，晶形结构进行研究，并与化学法生产产品进行比对，确定其绝对构型及结构。5、技术效果及与原工艺比对
A.生产过程环境要求降低，环保压力小，生产安全性高。酶法生产不采用溶媒，在非防爆的工作环境下即可生产，生产工艺安全性高。在生产过程中基本不产生废气，而废水具有良好的可生化性，易处理，相比化学法节省了不少环保支出。使用较少的环保支出即可使环保达标排放。B.成本上具有优势两步酶法生产7-氨基头孢烷酸步骤为氧化、酰化、结晶等3个步骤，酶法裂解在反应过程中均采用水相，生产过程条件温和，易于控制不采用没有使用溶媒及有毒有害物质，可以使用头孢菌素C的液体直接投料，节省了 CPC的结晶干燥过程，从而节省了大量的电、蒸汽、水等能源和治污成本，使7-氨基头孢烷酸的成本更具有竞争优势。C.本发明的制备的7-氨基头孢烷酸质量，稳定性，化学立体构型以及晶型等与原化学裂解法生产的产品一致。
具体实施例方式实施例1
在酶反应器中加入头孢菌素C钠盐溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，经双氧水中转后，加GL-7氨基头孢烷酸酰化酶裂解，再经结晶，离心过滤，洗涤，干燥，检验即得7-氨基头孢烷酸，纯度在96%以上。所述的头孢菌素C钠盐溶液的浓度是4%，其配制步骤称取48克头孢菌素C钠盐于1200ml烧杯中，加入适量蒸馏水，充分溶解后，用3N氨水调节PH至7. 0左右，真空抽滤除去不溶物，加蒸馏水至1200ml，20°C恒温水浴备用。所述的氧化酶的投入量为每升头孢菌素C钠盐溶液投入2500U氧化酶。所述的酰化酶的投入量为每升头孢菌素C钠盐溶液投入5000U酰化酶。氧化过程中酶反应器的温度控制在20°C，氧气的流量保持100L/h，反应器罐上压力0. IMPa,滴加1. 5N氨水控制反应pH7. 2，每10分钟记录一次pH，当pH上升至7. 6时结束反应。中转加双氧水过程是将过氧化氢电极插入氧化反应液中，滴加:3ml过氧化氢的质量分数是10%的双氧水，控制过氧化氢读数lOppm。酰化过程中酶反应器的温度控制在20°C，在氧化中转溶液中滴加3N氨水控制反应pH8. 3，控制反应温度20°C，每10分钟记录一次pH值，当PH值能维持^iin不变时，停止反应。结晶过程是搅拌下在酰化后的溶液中缓慢滴加6N HCl，在30分钟内调节PH至 5. 6，出现沉淀时，暂停加酸，降低搅拌速度，在冰浴中冷却至2°C，让结晶慢慢析出约20分钟，继续加酸调节PH至4.0 ；保持溶液在1°C下，养晶约2小时；过滤，用少量冷蒸馏水(2°C) 洗涤两次，丙酮充分洗涤结晶3次，真空抽于；结晶粉置于真空干燥箱中，真空度0. 06MPa 下，温度30°C下，干燥4h。实施例2在酶反应器中加入头孢菌素C钠盐溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，经双氧水中转后，加GL-7氨基头孢烷酸酰化酶裂解，再经结晶，离心过滤，洗涤，干燥，检验即得7-氨基头孢烷酸，纯度在96%以上。所述的头孢菌素C钠盐溶液的浓度是4%，其配制步骤称取48克头孢菌素C钠盐于1200ml烧杯中，加入适量蒸馏水，充分溶解后，用3N氨水调节PH至7. 0左右，真空抽滤除去不溶物，加蒸馏水至1200ml，20°C恒温水浴备用。所述的氧化酶的投入量为每升头孢菌素C钠盐溶液投入2500U氧化酶。所述的酰化酶的投入量为每升头孢菌素C钠盐溶液投入5000U酰化酶。氧化过程中酶反应器的温度控制在20°C，氧气的流量保持100L/h，反应器罐上压力0. IlMPa,滴加1. 5N氨水控制反应pH7. 25，每10分钟记录一次pH，当pH上升至7. 8时
结束反应。中转加双氧水过程是将过氧化氢电极插入氧化反应液中，滴加:3ml过氧化氢的质量分数是10%的双氧水，控制过氧化氢读数40ppm。酰化过程中酶反应器的温度控制在20°C，在氧化中转溶液中滴加3N氨水控制反应pH8. 4，控制反应温度20°C，每10分钟记录一次pH值，当PH值能维持5min不变时，停止反应。结晶过程是搅拌下在酰化后的溶液中缓慢滴加6N HCl，在45分钟内调节PH至 6. 0，出现沉淀时，暂停加酸，降低搅拌速度，在冰浴中冷却至2、°C，让结晶慢慢析出约30 分钟，继续加酸调节PH至4. 2 ；保持溶液在4°C下，养晶约3小时；过滤，用少量冷蒸馏水 (4°C)洗涤两次，丙酮充分洗涤结晶3次，真空抽于；结晶粉置于真空干燥箱中，真空度 0. IMPa下，温度36°C下，干燥8h。实施例3
7-氨基头孢烷酸双酶转化HPLC分析方法一、流动相的配制 1、A相
称取1. 542g乙酸铵加IOOOml蒸餾水溶解后，用冰乙酸调pH至4. 5，0. 45 μ m的水系滤膜过滤后脱气20分钟。2、B 相
量取900ml的A相，加IOOml乙腈混合均勻后脱气20min。二、HPLC分析条件
柱子类型Rp_8e，5 μ m, LiChroCART 250-4 总流速:1. Oml/min 检测波长260nm
转化液精确移取0. 5ml转化液至50ml容量瓶中，用流动相A相稀释并定容至刻度，摇勻后进液相分析。标准液
精确称取CPC标准品2(T25mg，用流动相A相溶解后定容至50ml，摇勻后进液相分析。精确称取7-ACA标准品l(Tl5mg，用流动相A相溶解后定容至50ml，摇勻后进液相分析。
精确称取GL-7-ACA标准品15 20mg，用流动相A相溶解后定容至50ml，摇勻后进液相分析。进样量5μ1
时间程序表
权利要求
1. 一种制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于包括以下步骤在酶反应器中加入头孢菌素C钠盐溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，经双氧水中转后，加GL-7氨基头孢烷酸酰化酶裂解，再经结晶，离心过滤，洗涤，干燥，检验即得7-氨基头孢烷酸，结构式如下
2.根据权利要求1所述的制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于头孢菌素C钠盐溶液的浓度是4%。
3.根据权利要求1所述的制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于头孢菌素C钠盐溶液的配制步骤称取48克头孢菌素C钠盐于1200ml烧杯中，加入适量蒸馏水，充分溶解后，用3N氨水调节PH至7. 0左右，真空抽滤除去不溶物，加蒸馏水至1200ml，20°C恒温水浴
4.根据权利要求1所述的制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于氧化酶的投入量为每升头孢菌素C钠盐溶液投入2500U氧化酶。
5.根据权利要求1所述的制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于酰化酶的投入量为每升头孢菌素C钠盐溶液投入5000U酰化酶。
6.根据权利要求1所述的制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于氧化过程中酶反应器的温度控制在20°C，氧气的流量保持100L/h，反应器罐上压力0. 1 士0. OlMPa，滴加 1. 5N氨水控制反应pH7. 2^7. 25，每10分钟记录一次pH，当pH上升至7. 6-7. 8时结束反应。
7.根据权利要求1所述的制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于中转加双氧水过程是将过氧化氢电极插入氧化反应液中，滴加:3ml过氧化氢的质量分数是10%的双氧水， 控制过氧化氢读数l(T40ppm。
8.根据权利要求1所述的制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于酰化过程中酶反应器的温度控制在20°C，在氧化中转溶液中滴加3N氨水控制反应pH 8. 3^8. 4，控制反应温度20°C，每10分钟记录一次pH值，当PH值能维持3-5min不变时，停止反应。
9.根据权利要求1所述的制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于结晶过程是搅拌下在酰化后的溶液中缓慢滴加6N HCl，在30 45分钟内调节PH至5. 6 6. 0，出现沉淀时，暂停加酸，降低搅拌速度，在冰浴中冷却至2、°C，让结晶慢慢析出约2(Γ30分钟，继续加酸调节PH至4. (Γ4. 2 ；保持溶液在1、°C下，养晶约2 3小时；过滤，用少量冷蒸馏水洗涤两次， 丙酮充分洗涤结晶3次，真空抽于；结晶粉置于真空干燥箱中，真空度0. 06、. IMI^a下，温度 30 36°C下，干燥4-8h。
10.根据权利要求9所述的制备7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于冷蒸馏水的温度是2、°C。
全文摘要
本发明是一种制备7-氨基头孢烷酸的方法。在酶反应器中加入头孢菌素C钠盐溶液，再加入D-氨基酸氧化酶氧化，经双氧水中转后，加GL-7氨基头孢烷酸酰化酶裂解，再经结晶，离心过滤，洗涤，干燥，检验即得7-氨基头孢烷酸。生产过程大大简化，发酵得到的头孢菌素C不需结晶就可用于酶解，生产过程中没有用到有毒溶剂，省掉加保护剂和去保护剂等步骤，产品能够达到高收率、高质量，同时降低成本和减少污染。
文档编号C12P35/02GK102286597SQ20111019422
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月12日 优先权日2011年7月12日
发明者赵松 申请人:福建省福抗药业股份有限公司