专利名称：一种辅酶a的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅酶A的制备工艺。
背景技术：
辅酶A，Coenzyme A简称CoA，它是由β-巯基乙胺、4，-磷酸泛酸、5，-二磷酸腺苷组成。CoA在生物体内主要作为转乙酰基的辅酶。CoA是体内乙酰化反应的辅酶，对体内糖、脂质及蛋白质的代谢起着重要的作用，如三羧酸循环、肝糖原的积存、乙酰胆碱的合成、胆固醇的降低及血浆脂肪含量的调节等。临床用于动脉硬化、心肌梗塞、多种肝病包括肝炎、脂肪肝等症、血小板减少性紫斑、白细胞减少症、尿毒症、糖尿病酸中毒、功能性低热的辅助治疗等。辅酶A原料药为白色或淡黄色粉末，有类似蒜臭味，是体内乙酰化反应的辅酶，对糖、脂肪和蛋白质的代谢起重要作用。辅酶A是通过微生物发酵、酶促合成、大孔树脂吸附、氧化亚铜提纯、葡聚糖凝胶层析精制而得。目前市场普遍存在微生物发酵单位低(发酵单位在300 400u/ml之间， 平均在330u/ml)、发酵液杂质多后续分离纯化难度大、最终收率低等缺陷。
发明内容
针对上述现有技术中存在的发酵表达量低、活力单位收率少等缺陷，本发明提供了一种高活力发酵表达的辅酶A的制备工艺，本发明对微生物发酵培养基配比进行了改进，对适合微生物生长的葡萄糖、玉米浆及适合生物酶合成的蛋白胨、无机盐等进行了优化组合，筛选出了最适的微生物发酵酶促合成反应配比，使得微生物菌量与生物酶促合成达到平衡，辅酶A的生物合成表达最大化。本发明是通过以下技术方案实现的一种辅酶A的制备工艺，包括微生物发酵、酶促合成、大孔树脂吸附、氧化亚铜提纯、葡聚糖凝胶层析和还原沉淀六部分，其中，微生物发酵包括菌种选育、菌种发酵两个阶段；所述菌种发酵阶段，所采用的培养基的配方组成如下葡萄糖8% 10% ；玉米浆 1. 3% 1. 5%;牛骨或鱼蛋白胨1. 5% 1. 8%;硫酸镁1. 0% 1. 2%;氯化钙0. 01%
0.02 %，尿素0. 8 % 1. 0 %，余量为水，各组分按重量百分比。优选的，所述养基的配方组成如下葡萄糖10% ；玉米浆1. 4%，牛骨蛋白胨
1.5% ；硫酸镁1.0% ；氯化钙0. 01%，尿素0.8%，余量为水。优选的，所述菌种发酵阶段，发酵条件为温度30 35°C，空气流量1 (0.6 1. 0)，时间20 沈小时，发酵完成后，检测PH值、OD值、残留糖量并镜检有无杂菌。优选的，在所述菌种选育阶段，选用产氨短杆菌，理由为能进行辅酶A酶合成反应的菌种很多，如酵母菌、短杆芽孢杆菌、假单孢菌、产氨短杆菌等；国内外文献报道表明， 产氨短杆菌通过发酵富集菌量然后进行酶促合成辅酶A产量是最高的，因此选用产氨短杆菌。优选的，在所述酶促合成部分，向酶反应液中分次加入1次、2次或3次前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙和三磷酸腺苷二钠，进一步优选的，向酶反应液中分加入1次前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙和三磷酸腺苷二钠。优选的，所述前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙和三磷酸腺苷二钠按酶反应液的重量百分比添加，添加量分别为0. 1 % 0. 2 %盐酸半胱氨酸、0. 07 % 0. 08 %泛酸钙、
0. 2% 0. 3%三磷酸腺苷二钠。优选的，所述酶促合成部分，酶反应温度30 35°C，空气流量1 (0.3 0.6)， 时间20 M小时，反应过程中不断地搅拌；反应后，得反应液，反应液酸化压滤，得压滤清液。本发明的辅酶A的制备工艺具体步骤可以如下(一)微生物发酵辅酶A发酵菌种经发酵培养，温度30 35°C，空气流量1 (0.6 1.0)，时间 20 沈小时，检测pH值、OD值、残留糖量并镜检无杂菌。(二)酶促合成向酶反应液中逐步加入前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙、三磷酸腺苷二钠，酶反应温度30 35°C，空气流量1 (0. 3 0. 6)，时间20 M小时。搅拌得反应液，反应液酸化压滤，得压滤清液。(三)大孔树脂吸附压滤清液上已处理好的CAD型大孔树脂吸附，低浓度乙醇淋洗除杂质，碱性乙醇液洗脱得到分离液，洗脱液真空浓缩，得浓缩液。(四)氧化亚铜提纯浓缩液加入盐酸半胱氨酸，硫酸调节pH，加入氧化亚铜，使辅酶A形成巯醇盐沉淀，用无盐水洗涤沉淀，用硫化氢脱除铜，离心后浓缩得浓缩液。(五)葡聚糖凝胶层析浓缩液上已处理好的G-25型葡聚糖凝胶树脂进行分离纯化，使用紫外分析检测仪和薄层层析进行检测，在^Onm ^Onm波长范围检测，收集辅酶A的有效成份。(六)还原沉淀洗脱液用饱和的氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾调节pH值到4. 5 5. 0，加入巯基乙醇为还原剂，摇勻后放入恒温箱中，30 35°C还原10 16小时，真空浓缩得浓缩液。浓缩液使用丙酮沉淀辅酶A，温度控制小于< 5°C，过滤得辅酶A湿品，五氧化二磷真空干燥。上述步骤中，步骤(三) (六)均为常规技术，本发明对此无改进，在此不再赘述。经本发明的工艺制备得到的辅酶A，活力测定达到500 600u/ml，最高批次可达 717u/ml ；与现有技术相比，提高了辅酶A发酵表达量，使单位体积的酶活力提高1/3，最高表达单位717u/ml ；减少了发酵液的杂质，为后续分离纯化提供了有利条件；提高了最终的收率每吨发酵液的平均收率由原来的0. 51亿单位提高至0. 79亿单位以上。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。需要说明的是，本发明仅对微生物发酵部分的配方比例和酶促合成反应阶段进行了优化，其他大孔树脂吸附、氧化亚铜提纯及葡聚糖凝胶层析仍采用原工艺技术，因此实施例中未对原工艺技术进行详细的说明。实施例1(一)微生物发酵将培养基按规定配比葡萄糖8% ；玉米浆1. 4% (玉米浆购自石家庄中营淀粉有限公司，080715批，下同)；牛骨蛋白胨1.5% (进口)；硫酸镁1.0% ；氯化钙0· 01%，尿素0. 8% ；余量为水，各组分按重量百分比，投入发酵罐内，加入余量的水，搅拌均勻，流通蒸汽消毒灭菌。然后将培养好的辅酶A产氨短杆菌种按接种量6%移入发酵罐培养，培养温度控制在30 35°C，空气流量1 0. 8，时间22小时，培养终点控制；pH值应为6. 0 6. 5、 OD值为1. 5 2.0、镜检无杂菌、残留糖量4% 6%。( 二 )酶促合成向发酵液中加入破壁剂苯扎溴铵及前体物质0. 15%盐酸半胱氨酸、0. 07%泛酸钙、0.2%三磷酸腺苷二钠，各组分按重量百分比，1次加入所需前体物质，搅拌均勻。酶反应温度控制在30 35°C，空气流量1 0. 5，时间22小时，反应液检测效价，效价在500 600u/ml之间，反应液酸化压滤，得压滤清液。(三)大孔树脂吸附压滤清液上已处理好的CAD型大孔树脂吸附，流速控制在1/4装柱体积/小时，得吸附饱和树脂，用0. 03mol/l稀硝酸洗涤除杂质，流速控制在1/4装柱体积/小时。用氨-乙醇液解析洗脱辅酶A，流速控制在1/4装柱体积/小时，收集pH2. 0 7. 0的解析液，得到分离液，洗脱液真空浓缩得浓缩液，浓缩液效价控制在> 3000u/ml，体积为解析液的1/12，得浓缩液。(四)氧化亚铜提纯向浓缩液中加入盐酸半胱氨酸，硫酸调节pH，加入氧化亚铜，使辅酶A反应形成巯醇盐微量沉淀，反应完成后水化沉淀，离心得辅酶A酮盐沉淀。用稀酸和纯化水洗涤沉淀， 加入浓缩液体积的纯化水制成混悬液，调pH 3. 0 3. 5，用硫化氢脱除铜5 8小时，离心后上清液真空浓缩，浓缩液效价控制在> 25000u/ml，浓缩后体积为原体积的1/10，得浓缩液。(五)葡聚糖凝胶层析浓缩液上已处理好的G-25型葡聚糖凝胶树脂进行分离纯化，上柱流速控制在1/4 装柱体积/小时，然后用注射用水作为展层液进行分离，使用紫外分析检测仪和薄层层析进行检测，在260nm 280nm波长范围检测，收集辅酶A的有效成份。再次浓缩，浓缩后体积为原体积的1/12，浓缩液效价控制在> 60000u/ml，浓缩液过滤除沉淀。(六)还原沉淀浓缩滤液用饱和的氢氧化锂溶液调节pH值到4. 5 5. 0，按单位的15%加入巯基乙醇为还原剂，摇勻后放入恒温箱中，30 35°C还原14小时，真空浓缩得浓缩液，浓缩液效价控制在> 120000u/ml，浓缩液过滤除沉淀。浓缩液使用pH3. 0的硝酸冷丙酮沉淀辅酶A， 温度控制< 5°C，过滤得辅酶A湿品，沉淀湿品用冷丙酮洗涤二次，过滤至干，变色硅胶作干燥剂进行真空干燥，温度控制35 40°C，时间48 72小时，球磨粉碎得辅酶A成品。送样检验。
实施例2(一 )微生物发酵将培养基按规定配比葡萄糖10% ；玉米浆1. 3% ；牛骨蛋白胨1. 6% ；硫酸镁 1.0%;氯化钙0. 02%，尿素1.0%;余量为水，各组分按重量百分比，投入发酵罐内，搅拌均勻，流通蒸汽消毒灭菌。然后将培养好的辅酶A产氨短杆菌种按接种量6%移入发酵罐培养，培养温度控制在30 35°C，空气流量1 0. 8，时间22小时，培养终点控制；pH值应为 6. 0 6. 5、OD值为1. 5 2. 0、镜检无杂菌、残留糖量4% 6%。( 二 )酶促合成向发酵液中加入破壁剂苯扎溴铵及前体物质0. 2%盐酸半胱氨酸、0. 075%泛酸钙、0. 3%三磷酸腺苷二钠，各组分按重量百分比，将总量前体物质平均分配，分别在0小时起始、3小时、6小时补加前体物质，分1次，2次，3次加入所需前体物质，搅拌均勻。酶反应温度控制在30 35°C，空气流量1 0. 5，时间22小时，反应液检测效价，效价为500 600u/ml，反应液酸化压滤，得压滤清液。发酵液取样检验辅酶A效价，其具体检测结果如下表1所示表 1
样品1次加入样品2次加入样品3次加入样品发酵液单位(u/ml)717708402 根据实验数据可知，酶促反应阶段一次加入全量的前体物质，可以提高辅酶A的效价单位，显著优于分三次加入前体物质。(三)大孔树脂吸附压滤清液上已处理好的CAD型大孔树脂吸附，流速控制在1/4装柱体积/小时，得吸附饱和树脂，用0. 03mol/l稀硝酸洗涤除杂质，流速控制在1/4装柱体积/小时。用氨-乙醇液解析洗脱辅酶A，流速控制在1/4装柱体积/小时，收集pH2. 0 7. 0的解析液，得到分离液，洗脱液真空浓缩得浓缩液，浓缩液效价控制在> 3000u/ml，体积为解析液的1/12，得浓缩液。(四)氧化亚铜提纯向浓缩液中加入盐酸半胱氨酸，硫酸调节pH，加入氧化亚铜，使辅酶A反应形成巯醇盐微量沉淀，反应完成后水化沉淀，离心得辅酶A酮盐沉淀。用稀酸和纯化水洗涤沉淀， 加入浓缩液体积的纯化水制成混悬液，调pH 3. 0 3. 5，用硫化氢脱除铜5 8小时，离心后上清液真空浓缩，浓缩液效价控制在> 25000u/ml，浓缩后体积为原体积的1/10，得浓缩液。(五)葡聚糖凝胶层析浓缩液上已处理好的G-25型葡聚糖凝胶树脂进行分离纯化，上柱流速控制在1/4 装柱体积/小时，然后用注射用水作为展层液进行分离，使用紫外分析检测仪和薄层层析进行检测，在260nm 280nm波长范围检测，收集辅酶A的有效成份。再次浓缩，浓缩后体积为原体积的1/12，浓缩液效价控制在> 60000u/ml，浓缩液过滤除沉淀。
(六)还原沉淀浓缩滤液用饱和的氢氧化锂溶液调节pH值到4. 5 5. 0，按单位的15%加入巯基乙醇为还原剂，摇勻后放入恒温箱中，30 35°C还原14小时，真空浓缩得浓缩液，浓缩液效价控制在> 120000u/ml，浓缩液过滤除沉淀。浓缩液使用pH3. 0的硝酸冷丙酮沉淀辅酶A， 温度控制< 5°C，过滤得辅酶A湿品，沉淀湿品用冷丙酮洗涤二次，过滤至干，变色硅胶作干燥剂进行真空干燥，温度控制35 40°C，时间48 72小时，球磨粉碎得辅酶A成品。送样检验。实施例3(一 )微生物发酵将培养基按规定配比葡萄糖10% ；玉米浆1.4% ；鱼蛋白胨1.5% ；硫酸镁 1.0%;氯化钙0. 01%，尿素0.8%;余量为水，各组分按重量百分比，投入发酵罐内，搅拌均勻，流通蒸汽消毒灭菌。然后将培养好的辅酶A产氨短杆菌种按接种量6%移入发酵罐培养，培养温度控制在30 35°C，空气流量1 0. 8，时间22小时，培养终点控制；pH值应为 6. 0 6. 5、OD值为1. 5 2. 0、镜检无杂菌、残留糖量4% 6%。( 二 )酶促合成向发酵液中加入破壁剂苯扎溴铵及前体物质0. 2%盐酸半胱氨酸、0. 07%泛酸钙、 0. 2%三磷酸腺苷二钠，1次加入所需前提物质，搅拌均勻。酶反应温度控制在30 35°C， 空气流量1 0. 5，时间22小时，反应液检测效价，效价为500 600u/ml，反应液酸化压滤，
得压滤清液。(三)大孔树脂吸附压滤清液上已处理好的CAD型大孔树脂吸附，流速控制在1/4装柱体积/小时，得吸附饱和树脂，用0. 03mol/l稀硝酸洗涤除杂质，流速控制在1/4装柱体积/小时。用氨-乙醇液解析洗脱辅酶A，流速控制在1/4装柱体积/小时，收集pH2. 0 7. 0的解析液，得到分离液，洗脱液真空浓缩得浓缩液，浓缩液效价控制在> 3000u/ml，体积为解析液的1/12，得浓缩液。(四)氧化亚铜提纯向浓缩液中加入盐酸半胱氨酸，硫酸调节pH，加入氧化亚铜，使辅酶A反应形成巯醇盐微量沉淀，反应完成后水化沉淀，离心得辅酶A酮盐沉淀。用稀酸和纯化水洗涤沉淀， 加入浓缩液体积的纯化水制成混悬液，调pH 3. 0 3. 5，用硫化氢脱除铜5 8小时，离心后上清液真空浓缩，浓缩液效价控制在> 25000u/ml，浓缩后体积为原体积的1/10，得浓缩液。(五)葡聚糖凝胶层析浓缩液上已处理好的G-25型葡聚糖凝胶树脂进行分离纯化，上柱流速控制在1/4 装柱体积/小时，然后用注射用水作为展层液进行分离，使用紫外分析检测仪和薄层层析进行检测，在260nm 280nm波长范围检测，收集辅酶A的有效成份。再次浓缩，浓缩后体积为原体积的1/12，浓缩液效价控制在> 60000u/ml，浓缩液过滤除沉淀。(六)还原沉淀浓缩滤液用饱和的氢氧化锂溶液调节pH值到4. 5 5. 0，按单位的15%加入巯基乙醇为还原剂，摇勻后放入恒温箱中，30 35°C还原14小时，真空浓缩得浓缩液，浓缩液效价控制在≥ 120000u/ml，浓缩液过滤除沉淀。浓缩液使用pH3. 0的硝酸冷丙酮沉淀辅酶A， 温度控制< 5°C，过滤得辅酶A湿品，沉淀湿品用冷丙酮洗涤二次，过滤至干，变色硅胶作干燥剂进行真空干燥，温度控制35 40°C，时间48 72小时，球磨粉碎得辅酶A成品。送样检验。按辅酶A法定标准检测发酵后酶促反应液每Iml含辅酶A的效价单位同时计算各步收率及总收率，结果如表2所示。本发明与前公开专利CN101230374A比较，本发明在菌种选育阶段，选用产氨短杆菌。本发明与前公开专利CN101230374A比较，本发明采用优选的培养基配方，在菌体发酵阶段镜检无杂菌，其OD值控制在1. 5 2. 0，使产辅酶A的产氨短杆菌最富集。本发明与前公开专利CN101230374A比较，本发明在培养基配方优选中，选用牛骨蛋白胨或鱼蛋白胨，为产氨短杆菌菌体生长提供最丰富的营养物质。本发明与前公开专利CN101230374A比较，本发明在酶促反应阶段破壁后，1次全量加入前体物质，在产氨短杆菌菌体酶系的起始阶段进行辅酶A的酶生物合成，依据酶反应速度起始最快并呈线性速率的原理，在起始阶段提供足够量的底物，使辅酶A的酶生物合成速率达到最大转化率。本发明与前公开专利CN101230374A比较，本发明在酶促反应阶段，提供了足够量的前体物质，使辅酶A的酶反应向正反应方向进行，合成的辅酶A达到最大量。上述步骤(三) (六)均为公知技术，本发明对此无改进，在此不再详述。由于发酵液发酵单位达到600u/ml，减少了发酵液的杂质，为后续分离纯化提供了有利条件；因此提高了最终的收率使每吨发酵液的平均收率由原来的0. 51亿单位提高至0. 79亿单位以上。表权利要求
1.一种辅酶A的制备工艺，包括微生物发酵、酶促合成、大孔树脂吸附、氧化亚铜提纯、 葡聚糖凝胶层析和还原沉淀六部分，其中，微生物发酵包括菌种选育、菌种发酵两个阶段， 其特征在于所述菌种发酵阶段，所采用的培养基的配方组成如下葡萄糖8% 10% ；玉米浆1. 3% 1.5% ；牛骨或鱼蛋白胨1. 5% 1.8% ；硫酸镁1.0% 1.2% ；氯化钙 0. 01% 0. 02%，尿素0. 8% 1. 0%，余量为水，各组分按重量百分比。
2.根据权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于，所述养基的配方组成如下葡萄糖10% ；玉米浆1. 4% ；牛骨蛋白胨1. 5% ；硫酸镁1. 0% ；氯化钙0. 01%，尿素 0.8%，余量为水。
3.根据权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于所述菌种发酵阶段，发酵条件为温度30 35°C，空气流量1 (0. 6 1.0)，时间20 沈小时，发酵完成后，检测PH值、OD值、残留糖量并镜检有无杂菌。
4.根据权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于所述菌种选育阶段，选用产氨短杆菌。
5.根据权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于在所述酶促合成部分， 向酶反应液中分次加入1次、2次或3次前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙和三磷酸腺苷二钠。
6.根据权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于在所述酶促合成部分， 向酶反应液中分1次加入前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙和三磷酸腺苷二钠。
7.根据权利要求5或6所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于所述前体物质盐酸半胱氨酸、泛酸钙和三磷酸腺苷二钠的添加量分别为0. 0. 2%盐酸半胱氨酸、 0. 07% 0. 08%泛酸钙、0. 2% 0. 3%三磷酸腺苷二钠，按重量百分比。
8.根据权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于所述酶促合成部分，酶反应温度30 35°C，空气流量1 (0. 3 0.6)，时间20 M小时，反应过程中不断地搅拌；反应后，得反应液，反应液酸化压滤，得压滤清液。
全文摘要
本发明公开了一种辅酶A的制备工艺，包括微生物发酵、酶促合成、大孔树脂吸附、氧化亚铜提纯、葡聚糖凝胶层析和还原沉淀六部分，其中，微生物发酵包括菌种选育、菌种发酵两个阶段；菌种发酵阶段，所采用的培养基的配方组成如下葡萄糖8％～10％；玉米浆1.3％～1.5％；牛骨或鱼蛋白胨1.5％～1.8％；硫酸镁1.0％～1.2％；氯化钙0.01％～0.02％，尿素0.8％～1.0％，余量为水。本发明的工艺制备得到的辅酶A，活力测定达到500～600u/ml，最高批次可达717u/ml；与现有技术相比，提高了辅酶A发酵表达量，使单位体积的酶活力提高1/3，最高表达单位717u/ml；减少了发酵液的杂质，为后续分离纯化提供了有利条件；提高了最终的收率每吨发酵液的平均收率由原来的0.51亿单位提高至0.79亿单位。
文档编号C12P19/40GK102321708SQ20111022592
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月8日 优先权日2011年8月8日
发明者刘盛儒, 孙岩, 张梅村, 王基伟, 王增鑫, 迟创成, 隗青 申请人:济南维尔康生化制药有限公司