一种检测细胞凋亡信号通路的试剂及其pcr检测方法

专利名称：一种检测细胞凋亡信号通路的试剂及其pcr检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测细胞凋亡信号通路的试剂及其 PCR检测方法。
背景技术：
细胞凋亡本质上是一种由死亡信号诱发的受调节的细胞程序性死亡过程，是细胞生理性死亡的普遍形式。是机体在生理或病理条件下，启动自身内部机制，经过多途径的信号传递，结束其自身生命的过程。细胞凋亡具有特征性的形态学及生物化学改变。凋亡早期主要表现为胞质空泡，染色质浓缩并沿核膜排列；凋亡细胞与细胞外基质或周围细胞分离。 随着凋亡过程的进展，胞质空泡与胞膜融合，导致膜发泡，随后空泡与细胞分离，引起水分丢失，细胞皱缩，同时染色质进行性固缩，并碎裂成块状结构，最后细胞也碎裂成凋亡小体。 目前诱导肿瘤细胞的凋亡已经成为治疗肿瘤的一种关键手段。但是细胞凋亡具有复杂的信号途径，如何能从庞杂的细胞凋亡信号途径中，找出明确的凋亡信号途径从而开发肿瘤相关药物，以便于进一步诱导肿瘤细胞的凋亡，现在已经成为肿瘤药物研发领域的急需解决的重要问题。

发明内容
本发明针对现有技术中诱导肿瘤细胞凋亡遇到的困难，提供了一种检测细胞凋亡信号通路的试剂及其PCR检测方法，本发明将涉及细胞凋亡的信号分子集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞的生存状态，探讨引起细胞凋亡的可能途径，为研究关键蛋白的凋亡信号通路提供最直接的证据。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现 一种检测细胞凋亡信号通路的试剂，它包括以下引物
(1)检测BAX基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5’-GGGTGGTTGGGTGAGACTC-3’ ；
5’-AGACACGTAAGGAAAACGCATTA-3’ ；
(2)检测ANGPTL4基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5’-GTCCACCGACCTCCCGTTA-3’ ；
5’-CCTCATGGTCTAGGTGCTTGT-3’ ；
(3)检测ILlA基因的的PCR反应引物，其引物序列如下 5，-ATCATGTAAGCTATGGCCCACT-3'；
5，-CTTCCCGTTGGTTGCTACTAC-3，；
(4)检测MYBL2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下 5’-ATCGCCAAGATGTTGCCAGG-3’ ；
5’-GGACTCGCTCAAGAAGCCT-3’ ；
(5)检测PEA15基因的的PCR反应引物，其引物序列如下
45’-CCTGACCTACTCACTATGGTGG-3’ ； 5’-GCTGCCGGATAATGTCTTTGTA-3’ ；
(6)检测PRKAAl基因的的PCR反应引物，其引物序列如下 5’-GCGACAAGCCCACCTGATT-3’ ；
5' -TGTTTCAGCAACCAAGAATGGTA-3'；
(7)检测BIRC5基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5' -AGGACCACCGCATCTCTACAT-3'；
5'-AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG-3'；
(8)检测CASPl基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5'-TCCAATAATGGACAAGTCAAGCC-3'；
5' -GCTGTACCCCAGATTTTGTAGCA-3'；
(9)检测DAPK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5'-TCACTACCTGCACTCTAAGCG-3'；
5，-TTCCCCGCCTCGATCTTGT-3，；
(10)检测NUDT2基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5' -GCCTTGAGAGCATGTGGCTT-3'；
5'-ATGAATGCCATCTGATGCCTG-3'；
(11)检测内参GAPDH控制基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5'-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3'；
5' -GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。本发明还提供了用所述检测试剂检测细胞凋亡信号通路的PCR检测方法，所述 PCR检测方法为实时荧光定量PCR方法。对上述技术方案的进一步改进所述实时荧光定量PCR的反应体系为Taq聚合酶反应混合液20 μ 1，上游引物0. 1-0. 5 μ mol，下游引物0. 1-0. 5 μ mol，cDNA模板50_200ng， 灭菌蒸馏水补足到40 μ 1。对上述技术方案的进一步改进所述Taq聚合酶为2 X STOR Premix Ex Taq聚合酶。对上述技术方案的进一步改进所述实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性，5分钟；98°C变性，10秒，550C，20秒，72°C、15秒，进行40个循环。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是本发明提供了检测细胞凋亡信号通路的试剂，借助于所述检测试剂可以通过实时荧光定量PCR在转录水平快速检测出与细胞凋亡相关的基因，在此基础上分析研究肿瘤相关药物的作用机理过程，从而快速准确的找到肿瘤相关药物的凋亡信号通路，为抗癌药物筛选、新靶向药物的机制探讨等提供了有力的工具。同时本发明还提供了检测的PCR方法，所述实验体系可以在任何一台实时荧光定量PCR仪器上进行，实验操作简便，费用低廉，结果重复性好，有利于减少下游不必要的检测，是研究肿瘤相关药物作用机理的一种重要手段。结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清林疋。


图1表明了本发明利用Ad5. TRAIL腺病毒研究目的基因TRAIL引起肺癌细胞系 A549凋亡的相关基因的表达水平的变化。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例1
本发明通过用TRAIL基因诱导非小细胞肺癌的凋亡来阐述检测细胞凋亡的试剂， TRAIL中文名称为肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体，它是一种细胞凋亡诱导配体。本发明中所用的限制性内切酶购于宝生物工程(大连)有限公司和NEB公司，腺病毒穿梭载体pAd5-Track-CMV、骨架载体pAdEasy-Ι购自于美国Agilent公司。T4 DNA连接酶购自美国promega公司。HEK293细胞、A549细胞和BJ5183菌株均购买于中科院上海细胞库(http://WWW. cellbank. org. cn/mulu. asp)。质粒提取试剂盒购自上海华舜公司。琼脂糖胶回收试剂盒购自于北京博大泰克公司。利用本发明所述试剂检测细胞凋亡信号通路包括以下具体步骤 一、构建含目的基因TRAIL的腺病毒穿梭载体
1、酶切
将腺病毒穿梭载体pAd5-Track-CMV和质粒载体pGEMT/TRAIL按照下列体系进行双酶
切
成分pAc^-I^ack-CMVpGEMT/TRAIL
IOXbuffer K7. 5 μ 7. 5 μ
DNA2 Pg5 Pg
Sail2 μ 2 μ
HindIII2 μ 2 μ
去离子水补足至50 μ 50 μ 轻轻混勻后于37 °C温育2 h。
2、回收
将酶切后的样品全量上样于1.0%琼脂糖凝胶电泳，按照北京博大泰克公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，具体步骤如下 a取Eppendorf管，称重，标记；
b割取尽量小的含目的DNA的琼脂糖块，放入管中，再次称重，求得琼脂糖质量； c每100 mg琼脂糖加入300 μ 溶胶液；
d 50 °C水浴7 min，每2 min颠倒混勻一次，使琼脂糖完全溶化； e将溶化后混合液移入吸附柱，12，000 g离心30 s，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中；
f在吸附柱中加入650 μ 洗涤液，静置2 min后，12，000 g离心30 s，倒掉收集管中的液体；
g再将吸附柱放入同一收集管中，重复上一步骤；h将吸附柱重新放入收集管中，离心2 min；
i将吸附柱放入一干净的Eppendorf管中，在吸附膜中央加入30 PL洗脱液，室温静置 2 min 后，12，000 g 离心 1 min ；
j 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收的片段，将回收得到的DNA于-20 °C保存。
3、连接
应用T4 DNA连接酶进行连接反应，体系如下
2 X Rapid连接缓冲液5 μ
pAd5-Track-CMV vector(50 ng) 1 μ
Τ4 DNA连接酶1 μ
TRAIL 基因(300 ng)2 μ
总体积至10 μ
置于4°C连接16 h以上。
4、转化
pAd5-Track-CMV与TRAIL基因的连接产物转化DH5 α感受态步骤如下
(1)取100μ 的DH5 α感受态细胞置于冰浴上融化；
(2)将10PL连接产物加入100 PL的DH5a感受态细胞中，轻轻旋转混勻内容物，在冰浴上放置40 min ；
(3)置于42°C水浴中90 s，勿摇动；
(4)迅速将离心管转移到冰浴中，放置2min;
(5)加入400μ 的液体LB培养基，置于37 °C摇床，100 rpm培养45 min ；
(6)将菌液吸到含有30mg · L-I的卡那的LB固体培养基平皿上，用无菌弯头玻璃棒轻轻地将菌液均勻涂开；
(7)封口膜将平皿封口，倒置，37°C，烘箱过夜培养16 h。5、转化重组载体后的DH5 α单菌落培养和质粒的提取
从转化平皿上随机挑取白色单菌落，接种到含有卡那抗生素(30 mg/L)的10 mL LB液体培养基的三角锥形瓶中，将每管进行编号，置于37 °C摇床，180 rpm培养10 h ；对呈混浊的菌液用质粒提取(小量)试剂盒(上海华舜)抽提质粒，剩余菌液取800 μ 加15%甘油200 PL，保存于-70 °C冰箱。将提取后的质粒进行酶切和测序验证，证明目的基因TRAIL已转入质粒中，将测序正确的质粒命名为pAd5-Track-CMV-TRAIL。二、pAd5. TRAIL 载体的构建
1、pAd5-Track-CMV-TRAIL 载体用 PmeI 线性化 pAd5-Track-CMV-TRAIL载体按照下列体系进行单酶切 IOXbuffer 45 μ
DNA2 Pg
PmeI2 μ
去离子水补足至50 μ 轻轻混勻后于37 °C温育2 h，每管全量上样于1.0%琼脂糖凝胶电泳，按照上述回收步骤进行回收。2、电击转入
a将PmeI线性化的pAd5-Track-CMV_TRAIL用15 μ L的去离子水溶解并混合均勻； b启动电穿孔仪，并设原核细胞的工作状态，设置程序为U=1650 V、T=4 ms，并准备1 mL 琼脂培养基于离心管中；
c将腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι转入BJ5183菌株中，再将含有pAdEasy-Ι的BJ5183制成感受态细胞，取BJ5183感受态细胞50 μ L，在冰中约融化4_5 min ；
d吸取1 μ L的RneI线性化的pAd5-Track-CMV_TRAIL，加入已融化的BJ5183中，并混勻加入电穿孔杯中，将电穿孔杯外周擦拭干净后，放入电穿孔仪中，按START键，开始细胞的电穿孔反应；
e吸取1 mL的LB培养基加入电穿孔杯中冲洗步骤d的电穿孔反应体系，将混合液再吸回离心管中；
f将此菌液于37 V，225 rpm条件下摇菌1_1. 5 h ；
g分别吸取100 μ L、200 μ L的上述菌液涂LB平板(此LB平板含卡那霉素30 mg/L), 37 °C培养过夜；
h第二天，观察菌斑生长状况，挑取单克隆菌落。经卡那霉素筛选出阳性菌落，提取阳性质粒，该质粒经EcoRI酶切鉴定，以及送样测序正确后命名为pAd5. TRAIL, pAd5. TRAIL即为线性化pAd5-Track-CMV_TRAIL与骨架载体pAdEasy-Ι经同源重组形成的腺病毒载体。三、制备腺病毒Ad5. TRAIL 和 Ad5. eGFP 1、用 PacI 线性化 pAd5. TRAIL
将I^cI按照下列体系进行线性化 IOXbuffer 45 μ
DNA10 Pg
PacI2 μ
去离子水补足至50 μ
按照上述方法进行DNA酶切产物的电泳并回收。
2、用线性化的pAd5. TRAIL转染HEK293细胞
回收的线性化pAd5. TRAIL按照invitrogen公司的脂质体2000步骤转染70%贴壁的 HEK293细胞(购买自中科院上海细胞库)，转染后更换为含10% FBS的DMEM培养基，隔2_3 天换一次培养液，继续培养10-14天，第3飞天在荧光显微镜下观察荧光。待细胞有噬斑病变(Cytopathic effect, CPE)时收集细胞悬液，2000 r/min离心5 min，细胞沉淀用无菌 PBS洗涤2 3次后，将细胞悬液在_80°C -37°C间反复冻融3次，释放出病毒，2000r/min离心5min，取上清，经多轮感染后获得高滴度重组腺病毒Ad5. TRAIL，该病毒同时含有eGFP基因和TRAIL基因(因其中pAd5-Track-CMV载体本身含有eGFP的表达，所以同源重组后形成的腺病毒载体加入目的基因后，也会同时表达eGFP和目的基因)，通过0拟60 nm测得病毒滴度(pt/mL)为5. 5X IO120对照病毒即只含有eGFP基因的病毒命名为Ad5. eGFP, eGFP为CN 6/12 页
增强型绿色荧光蛋白的缩写，于_80°C冻存该病毒。四、Ad5. TRAIL 和 Ad5. eGFP 感染 A549 细胞
UA549细胞的培养将A549细胞置于10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37°C CO2孵箱中培养；待细胞密度长至70-80%时，传代培养。2、接种细胞取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞(AM9)，0. 1%胰酶消化后接种于25cm2的培养瓶中，37°C，5% C02孵箱孵育M小时。细胞数约为IX 103。3、病毒处理将Ad5. TRAIL和Ad5. eGFP分别感染A549细胞，48小时后，收集细胞进行下游检测。五、总RNA提取和逆转录反应 1、提取总RNA
a取CO2孵箱中处于对数生长期60 mm平皿的细胞一盘，吸掉培养液后，用无菌IXPBS 清洗2次后，在细胞表面加1 mL Trizol，用枪头反复抽吸均勻，转入无菌管中。b室温培育5 min，以溶解核蛋白。加0. 2 mL酚/氯仿(1 1 )，剧烈振荡15 sec, 室温孵育2-3 min。c 4 "C, 12000 g离心15 min，细胞会产生分层。d将上层液体转至无RNase的离心管中，加入0. 5 mL异丙醇，颠倒混勻3次，室温培育10 min。e 4°C, 12000 g 离心 10 min, RNA 形成底部沉淀。f弃上清，用无RNase的75%乙醇1 mL洗涤沉淀。4 °C，7000 g离心5 min。g空气中干燥RNA约5-10 min。不宜太干。h 用 30-50 μ L DEPC 水溶解 RNA。2、cDNA 的合成
a在预冷的试管中加入下列反应混合物 总 RNA1-5 μ g
oligo(dT) (0. 5 μ g/μ 1)IyL
用RNase-free水定容至 12 μ L。b 混勻，离心 3-5 sec。c 70 °C作用 5 min 后冰浴 30 sec，离心 3-5 sec。
d将试管冰浴，再加入如下组分
5X反应缓冲液4 yL
Rnase Inhibiter (20 U/μ L) IyL dNTP mix (10 mM)2 μ L
e轻轻混勻，离心3-5 sec。f 37°C7jC浴5 min,力口 1 μ L 的M—MuLV Reverse Transcriptase (20 U/μ L)，混勾。g 37°C作用60 min。70 °C孵育10 min结束反应，置冰上进行下游试验。六、实时荧光定量PCR反应检测细胞凋亡信号通路
本发明通过用检测细胞凋亡信号通路的试剂结合实时荧光定量PCR来检测，所述检测试剂包括一组检测抗细胞凋亡基因的核苷酸序列、一组检测半胱氨酸和天冬氨酸酶活性基因的核苷酸序列、一组检测诱导细胞凋亡基因的核苷酸序列和一个检测内参GAPDH控制基因的核苷酸序列。所述抗细胞凋亡基因的核苷酸序列可以检测抗细胞凋亡的基因的表达； 半胱氨酸酶和天冬氨酸酶是细胞凋亡最后的表达产物，所述半胱氨酸和天冬氨酸酶活性基因的核苷酸序列可以检测细胞凋亡下游基因的表达；所述诱导细胞凋亡基因的核苷酸序列可以检测激活细胞凋亡相关基因的表达。本实验共分两组，即Ad5. TRAIL和Ad5. eGFP组。每组分别设置36个孔，其中12 孔为独立样本，每个样本各有3个重复。每组11个孔中分别加入BAX基因、ANGPTL4基因、 ILlA 基因、MYBL2 基因、PEA15 基因、PRKAAl 基因、BIRC5 基因、CASPl 基因、DAPK3 基因、NUDT2 基因和内参GAPDH控制基因的引物，另一孔加入水作为对照。1、一组用于实时荧光定量PCR检测抗细胞凋亡基因的核苷酸序列
(1) BAX基因，SPBCL2家族相关X蛋白(BCL2-associated X protein)基因，使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下 BAX 正向引物 5，-GGGTGGTTGGGTGAGACTC-3，(SEQ ID No: 1) BAX 反向引物 5，-AGACACGTAAGGAAAACGCATTA-3，(SEQ ID No:2) 扩增出BAX基因，Genbank登录号为NM_004324，片段长度为191bp。(2) ANGPTL4基因，即血管生成素相似蛋白4 (angiopoietin-like4)基因， 使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下 ANGPTL4 正向引物 5，-GTCCACCGACCTCCCGTTA (SEQ ID No: 3)
ANGPTL4 反向引物 5，-CCTCATGGTCTAGGTGCTTGT (SEQ ID No:4)
扩增出ANGPTL4基因，Genbank登录号为NM_001039667，扩增片段长度为2Ubp。(3) ILlA基因，即白介素1A，使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下
ATCATGTAAGCTATGGCCCACT (SEQ ID No:5) CTTCCCGTTGGTTGCTACTAC (SEQ ID No:6)
扩增出ILlA基因，Genbank登录号为NM_000575，扩增片段长度为131bp。(4) MYBL2基因，即ν-myb禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物样2，使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下
ATCGCCAAGATGTTGCCAGG (SEQ ID No:7) GGACTCGCTCAAGAAGCCT (SEQ ID No:8)
扩增出MYBL2基因，Genbank登录号为NM_002466，扩增片段长度为102bp。(5) PEA15基因，即星形胶质细胞丰富磷蛋白15，使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下
CCTGACCTACTCACTATGGTGG (SEQ ID No:9) GCTGCCGGATAATGTCTTTGTA (SEQ ID No:10)
扩增出PEA15基因，Genbank登录号为NM_003768，扩增片段长度为127bp。(6) PRKAAl基因，即AMP激活的蛋白激酶阿尔法1催化亚基，使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下
GCGACAAGCCCACCTGATT (SEQ ID No:11) TGTTTCAGCAACCAAGAATGGTA (SEQ ID No:12)
扩增出PRKAAl基因，Genbank登录号为NM_006251，扩增片段长度为87bp。
2、一组实时荧光定量PCR检测半胱氨酸和天冬氨酸酶活性基因的核苷酸序列
(1) BIRC5基因，即杆状病毒IAP重复区域5，使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下
AGGACCACCGCATCTCTACAT (SEQ ID No:13) AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG (SEQ ID No:14)
扩增出BIRC5基因，Genbank登录号为NM_001012270，扩增片段长度为118bp。(2) CASPl基因，即半胱氨酸天冬氨酸酶1，使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下
TCCAATAATGGACAAGTCAAGCC (SEQ ID No:15) GCTGTACCCCAGATTTTGTAGCA (SEQ ID No:16)
扩增出CASPl基因，Genbank登录号为NM_001223，扩增片段长度为139bp。3、一组实时荧光定量PCR反应检测诱导细胞凋亡基因的核苷酸序列
(1) DAPK3基因，即死亡相关蛋白激酶3，使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下
TCACTACCTGCACTCTAAGCG (SEQ ID No:17) TTCCCCGCCTCGATCTTGT (SEQ ID No:18)
扩增出DAPK3基因，Genbank登录号为NM_001348，扩增片段长度为13^p。(2) NUDT2基因，即核苷二磷酸连接的X成份型基元2，使用人工设计的一对聚合酶链式反应引物，进行扩增，其核苷酸序列如下
GCCTTGAGAGCATGTGGCTT (SEQ ID No:19) ATGAATGCCATCTGATGCCTG (SEQ ID No:20)
扩增出NUDT2基因，Genbank登录号为NM_147173，扩增片段长度为l(^bp。4、一组实时荧光定量PCR反应检测内参GAPDH控制基因(甘油醛_3_磷酸脱氢酶) 的核苷酸序列
TCATGGGTGTGAACCATGAGAA (SEQ ID No:21) GGCATGGACTGTGGTCATGAG (SEQ ID No:22)
扩增出内参GAPDH控制基因，Genbank登录号为NM_002046，扩增片段长度为146bp。用上述引物进行实时荧光定量聚合酶链式反应，其反应体系如下2XSTOR Premix Ex Taq聚合酶反应混合液20 μ 1，上游引物0. 2 μ mol，下游引物0. 2 μ mol，cDNA模板50ng，灭菌蒸馏水补足到40 μ 1。混勻后进行如下反应程序95°C、5分钟，一个循环；98 °C、10秒，55 °C、20秒， 72 °C、15秒，40个循环。溶解曲线分析程序95 °C、0秒，65 °C、15秒。该聚合酶链式反应在实时荧光定量聚合酶链式反应仪的运行。将各种基因的表达量做成图1，其中高于2的为高表达，低于0. 5的为低表达，图1 中表明了 BAX基因、ANGPTL4基因和MYBL2基因为高表达，ILlA基因、PEA15基因、PRKAAl 基因、BIRC5基因、CASPl基因和NUDT2基因均为中表达，DAPK3基因为低表达。本发明将表达载体pAd5-Track-CMV用Mil和HindIII双酶切后获得载体，带有目的基因TRAIL的pGEMT/TRAIL质粒经MlI与HindIII双酶切后回收目的片段，连接转化获得阳性克隆命名为 PAds-jTrack-CMv-TRAlI^pAds-jTrack-CMv-TRAIL 经RneI 酶切后，电转
11入BJ5183中，经卡那筛选出阳性质粒，命名为pAd5. TRAIL。将I3acI线性化的pAd5. TRAIL 转染HEK293细胞，7-10天后胞核增大，细胞变圆，随着时间的延长，因表达eGFP而出现大量绿色荧光，并出现细胞病变现象(Cytopathic effect, CPE)，说明同源重组成功并已存在感染性腺病毒粒子。继续对腺病毒进行扩增、纯化得到病毒原液Ad5. TRAIL，通过0拟60 nm 测得病毒滴度(pt/mL)分为5. 5X 1012。对照质粒命名为Ad5. eGFP。将Ad5. TRAIL和Ad5. eGFP感染A549细胞后，提取总RNA和逆转录反应，利用本发明提供的检测细胞凋亡信号通路的试剂通过荧光定量PCR可以扩增获得特异信号通路基因的图谱，为研究目的基因的凋亡信号通路提供了最直接的证据。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。SEQUENCE LISTING
<110>青岛大学医学院附属医院
<120> 一种检测细胞凋亡信号通路的试剂和PCR检测方法 <160> 22
<170> PatentIn version 3. 3
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<212> DNA
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gggtggttgg gtgagactc19
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<212> DNA
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<210> 4
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cctcatggtc taggtgcttg t21
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cttcccgttg gttgctacta c21
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<400> 20
atgaatgcca tctgatgcct g21
<210> 21 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <400> 21
tcatgggtgt gaaccatgag aa22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 22
ggcatggact gtggtcatga g2权利要求
1.一种检测细胞凋亡信号通路的试剂，其特征在于它包括以下引物(1)检测BAX基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5’-GGGTGGTTGGGTGAGACTC-3’ ；5’-AGACACGTAAGGAAAACGCATTA-3’ ；(2)检测ANGPTL4基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5’-GTCCACCGACCTCCCGTTA-3’ ；5’-CCTCATGGTCTAGGTGCTTGT-3’ ；(3)检测ILlA基因的的PCR反应引物，其引物序列如下 5，-ATCATGTAAGCTATGGCCCACT-3'；5，-CTTCCCGTTGGTTGCTACTAC-3，；(4)检测MYBL2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下 5’-ATCGCCAAGATGTTGCCAGG-3’ ；5’-GGACTCGCTCAAGAAGCCT-3’ ；(5)检测PEA15基因的的PCR反应引物，其引物序列如下 5’-CCTGACCTACTCACTATGGTGG-3’ ；5’-GCTGCCGGATAATGTCTTTGTA-3’ ；(6)检测PRKAAl基因的的PCR反应引物，其引物序列如下 5’-GCGACAAGCCCACCTGATT-3’ ；5' -TGTTTCAGCAACCAAGAATGGTA-3'；(7)检测BIRC5基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5' -AGGACCACCGCATCTCTACAT-3'；5'-AAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG-3'；(8)检测CASPl基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5'-TCCAATAATGGACAAGTCAAGCC-3'；5' -GCTGTACCCCAGATTTTGTAGCA-3'；(9)检测DAPK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5'-TCACTACCTGCACTCTAAGCG-3'；5，-TTCCCCGCCTCGATCTTGT-3，；(10)检测NUDT2基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5' -GCCTTGAGAGCATGTGGCTT-3'；5'-ATGAATGCCATCTGATGCCTG-3'；(11)检测内参GAPDH控制基因的PCR反应引物，其引物序列如下 5'-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3'；5' -GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。
2.一种用权利要求书1所述试剂检测细胞凋亡信号通路的PCR检测方法，其特征在于， 所述PCR检测方法为实时荧光定量PCR方法。
3.根据权利要求书2所述的一种检测细胞凋亡信号通路的PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系为Taq聚合酶反应混合液20 μ 1，上游引物 0. 1-0. 5 μ mol，下游引物0. 1-0. 5ymol, cDNA模板50_200ng，灭菌蒸馏水补足到40 μ 1。
4.根据权利要求书3所述的一种检测细胞凋亡信号通路的PCR检测方法，其特征在于， 所述Taq聚合酶为2XSTOR Premix Ex Taq聚合酶。
5.根据权利要求书3所述的一种检测细胞凋亡信号通路的PCR检测方法，其特征在于， 所述实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性，5分钟；98°C变性，10秒，55°C，20秒， 72 °C、15秒，进行40个循环。
全文摘要
本发明提供了一种检测细胞凋亡信号通路的试剂及其PCR检测方法，本发明所述检测试剂包括检测BAX基因、ANGPTL4基因、IL1A基因、MYBL2基因、PEA15基因、PRKAA1基因、BIRC5基因、CASP1基因、DAPK3基因、NUDT2基因和内参GAPDH控制基因表达的PCR反应引物。本发明将涉及细胞凋亡的信号分子集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞的生存状态，探讨引起细胞凋亡的可能途径，为研究关键蛋白的凋亡信号通路提供最直接的证据；本发明从转录水平快速准确的找到相关凋亡信号通路，为抗癌药物筛选、新靶向药物的机制探讨等提供了有力的工具。
文档编号C12N15/11GK102251050SQ20111022820
公开日2011年11月23日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者刘世海, 刘相萍, 姚如永, 杨堃, 隋爱华 申请人:青岛大学医学院附属医院