专利名称：基于环介导等温扩增检测南方根结线虫的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于环介导等温扩增检测南方根结线虫的试剂盒及其应用。
背景技术：
南方根结线虫(Meloidogyne incognita)是一种植物内寄生性的地下害虫，可危害3000多种植物，其危害约占全部根结线虫属的90%以上。准确鉴定根结线虫的种类，有助于监控其传播分布，研究其种群动态和遗传变异，并制定针对性的防治措施。传统的根结线虫种的鉴定主要依靠接种鉴别寄主植物、形态显微观察等常规方法，以及差异蛋白及同功酶电泳为主的生化分析方法。近年来，基于核基因组、线粒体和核糖体DNA及其间隔区(Internal transcribed spacer, ITS)多态性的分子鉴定方法迅速发展，以Southern和点杂交为主的分子杂交技术，以PCR为基础的AFLP、PCR-RFLP、RAPD等技术以及特异性SCAR标记被分别应用于根结线虫多样性分析和种群鉴定，该类分子标记已部分应用于植物检疫和病害诊断中。但上述方法因为周期长、专业性强、成本高、灵敏度低等不同原因，难易直接服务于生产，尤其不能为基层植保工作者使用。因此，需要开发新型的实用型的根结线虫检测手段。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification，简称LAMP)技术是一种新的恒温核酸扩增技术，利用能识别靶序列上6个位点的4个特殊设计的引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下，该技术在1小时内扩增效率可达到IO9-IOKI 个数量级，扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的 DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小区带组成的阶梯式图谱。该方法仅需恒温装置，且扩增产生大量产物和焦磷酸镁沉淀，结果可经肉眼直接判断，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点，已经应用于食品安全、环境微生物、农业病害及医学诊断等领域。目前尚未见采用环介导等温扩增方法检测南方根结线虫的试剂盒及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增检测南方根结线虫的试剂盒及其应用。本发明提供的辅助鉴定南方根结线虫的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成。所述专用引物可用于制备试剂盒中；所述试剂盒用于辅助鉴定南方根结线虫和/ 或检测待测样本是否含有南方根结线虫。本发明还保护一种含有所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定南方根结线虫和/或检测待测样本是否含有南方根结线虫。所述试剂盒还可含有Bst DNA聚合酶。 所述试剂盒还可含有10倍LAMP反应液和/或样品预处理液和/或荧光染料STOR GreenI。所述10倍LAMP反应液具体可由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述 10倍LAMP反应液中的浓度如下IOmM dNTP、200mM Tris-盐酸(pH 8. 8)、IOOmM氯化钾、 IOOmM硫酸铵、40mM硫酸镁、(体积比)曲拉通X-100和4M甜菜碱。所述样品预处理液具体可由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下50mM 氯化钾、IOmM iTris (pH8. 2)、2. 5mM 氯化镁、60 μ g/mL 蛋白酶 Κ、0· 45% (体积比) 吐温 20 和 0.01% (g/100mL)明胶。 所述试剂盒还可包括阳性对照质粒；所述性对照质粒为将序列表的序列6所示的 DNA插入PGEM-T easy质粒的NcoI和NotI酶切位点之间得到的重组质粒。
所述专用弓I物可用于辅助鉴定南方根结线虫。所述专用弓ι物可用于检测待测样本是否含有南方根结线虫。本发明还保护一种辅助鉴定南方根结线虫的方法，是用所述专用引物对待测线虫的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下⑴和/或(2)和/或(3)(I)WASTOR Green I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非南方根结线虫；(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的南方根结线虫， 如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非南方根结线虫；(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非南方根结线虫。所述待测线虫具体可为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、大豆胞囊线虫、禾谷胞囊线虫、甘薯腐烂茎线虫、松材线虫、拟松材线虫或象耳豆跟结线虫。本发明还保护一种辅助鉴定待测样本中是否感染南方根结线虫的方法，是用所述专用引物对待测样本的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和 /或⑶(1)加入STOR Green I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测样本中疑似含有南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测样本中疑似不含有南方根结线虫；(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测样本中疑似含有南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测样本中疑似不含有南方根结线虫；(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测样本中疑似含有南方根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测样本中疑似不含有南方根结线虫。以上任一所述的方法中，所述环介导等温扩增的反应体系具体可为所述基因组 DNA 5μ 1，LAMP 引物母液 1μ 1，10倍LAMP反应液2. 5μ l，Bst DNA聚合酶(8υ/μ1)1μ1，双蒸水15. 5μ 1。所述LAMP引物母液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下Mi-F3 10μΜ、Μ -Β3 ΙΟμΜ,Μ -FIP 80yM、Mi_BIP 80 μ M 和 Mi-LP 40 μ Μ。
以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的条件具体可为63°C水浴50分钟， 然后80°C加热5分钟终止反应。本发明与现有技术相比，优点如下(1)操作简单LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要水浴锅或金属模块即可，产物检测用肉眼观察、琼脂糖凝胶电泳或浊度仪检测即可判断，不需要特殊的试剂及仪器。(2)快速高效因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。样品检测全程可在1. 5小时内均可完成，本发明添加了环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在 20-30分钟均可检测到扩增产物，且产物可以扩增至IO9倍，达0.5mg/ml。应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。(3)高特异性由于本发明是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，引物的延伸端有着高度的序列选择性，与其他近缘线虫相应序列不匹配，不能进行核酸扩增。故其特异性极高。(4)高灵敏度扩增模板可达fg级，比PCR高出数量级的差异。(5)适用性强，成本低、技术依赖性小本试剂盒可采用不同方法进行结果判读，各使用单位可以根据自身条件，灵活选择一种或结合使用，特别适合基层农技人员使用。本发明设计特异性的引物并优化反应条件，提供了一种辅助鉴定南方根结线虫的试剂盒，应用该试剂盒可使检测达到种间水平，解决常规分子检测成本高、效率低、难以服务于基层农业生产的问题。
图1为电泳检测环介导的等温扩增结果。图2为STOR Green I染色后，分别在可见光与紫外光下观察结果(不同线虫)。图3为STOR Green I染色后，分别在可见光与紫外光下观察结果(南方根结线虫的不同地理种群)。图4为实施例3的琼脂糖凝胶电泳图；A =LAMP反应产物；B =PCR反应产物。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实验样本见表1。表1实验样本
权利要求
1.辅助鉴定南方根结线虫的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成。
2.权利要求1所述专用引物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于辅助鉴定南方根结线虫和/或检测待测样本是否含有南方根结线虫。
3.一种含有权利要求1所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定南方根结线虫和/或检测待测样本是否含有南方根结线虫。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还含有BstDNA聚合酶。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还含有10倍LAMP反应液和/或样品预处理液和/或荧光染料STOR Green I ；所述10倍LAMP反应液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述10倍 LAMP反应液中的浓度如下IOmM dNTP、pH 8.8 200mM Tris-盐酸、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、40mM硫酸镁、1 % (体积比)曲拉通X-100和4M甜菜碱；所述样品预处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下50mM氯化钾、pH8. 2 IOmM Tris、2. 5mM氯化镁、60 μ g/mL蛋白酶K、 0. 45% (体积比)吐温20和0. 01%明胶。
6.权利要求1所述专用引物在辅助鉴定南方根结线虫中的应用。
7.权利要求1所述专用引物在检测待测样本是否含有南方根结线虫中的应用。
8.一种辅助鉴定南方根结线虫的方法，是用权利要求1所述专用引物对待测线虫的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下⑴和/或⑵和/或(3)(1)WASTORGreen I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非南方根结线虫；(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非南方根结线虫；(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的南方根结线虫， 如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非南方根结线虫。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述待测线虫为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、大豆胞囊线虫、禾谷胞囊线虫、甘薯腐烂茎线虫、松材线虫、拟松材线虫或象耳豆跟结线虫。
10.一种辅助鉴定待测样本中是否感染南方根结线虫的方法，是用权利要求1所述专用引物对待测样本的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/ 或⑶(1)WASTORGreen I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测样本中疑似含有南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测样本中疑似不含有南方根结线虫；(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测样本中疑似含有南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测样本中疑似不含有南方根结线虫；(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测样本中疑似含有南方根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测样本中疑似不含有南方根结线虫。
全文摘要
本发明公开了一种基于环介导等温扩增检测南方根结线虫的试剂盒及其应用。本发明提供了辅助鉴定南方根结线虫的专用引物，由序列表的序列1至5所示DNA组成。本发明提供的试剂盒含有所述专用引物。本发明设计特异性的引物并优化反应条件，提供了一种辅助鉴定南方根结线虫的试剂盒，应用该试剂盒可使检测达到种间水平，解决常规分子检测成本高、效率低、难以服务于基层农业生产的问题。
文档编号C12N15/11GK102321747SQ20111022818
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月10日 优先权日2011年8月10日
发明者刘倩, 杨丹, 牛俊海, 简恒, 郭全新, 陈昌龙 申请人:中国农业大学