专利名称：培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法
技术领域：
本发明涉及一种四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生产方法，尤其是一种培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法。
背景技术：
四氢嘧啶是一种嗜盐微生物为了抵御外界高盐浓度的体内合成的一种相容性溶质，并且一些嗜盐微生物能够合成四氢嘧啶的衍生物-羟基四氢嘧啶。四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶与其他已知的相容性溶质相比，其对细胞、核酸、酶、蛋白等在射线、干燥、冷冻、高温、高盐等极端条件下具有更好的保护作用。由于其特殊的结构，截至目前还不能够人工合成四氢嘧啶或者羟基四氢嘧啶，只能通过微生物胞内合成获得。目前据公开文献报道，四氢嘧啶的合成主要是采用细菌挤奶法进行生产，以及进行高密度发酵。普通发酵方法是对于四氢嘧啶的生产，种子培养同上述1，2步骤，然后150ml种子菌液接种到3L发酵培养基，30°C培养，pH控制在7. 0-7. 2，。发酵培养基中氯化钠浓度为3M，其它同上。培养42h离心收集菌体，酒精提取四氢嘧唆，浓缩，膜过滤，结晶得到产物。 对于羟基四氢嘧啶的生产，种子培养同上述1，2步骤，然后150ml种子菌液接种到3L发酵培养基，30°C培养20h后42°C培养，pH控制在7. 0-7. 2。发酵培养基中氯化钠浓度控制在 3M，继续培养31h后离心收集菌体，酒精提取四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶，浓缩，膜过滤，结晶得到产物。由于嗜盐菌的最适生长的盐浓度和能够达到高产四氢嘧啶的盐浓度不一致，影响了四氢嘧啶的合成效率，例如中度嗜盐菌Halomonas ventosae DL7，其最适生长盐浓度为 1M，但是最优合成四氢嘧啶的盐浓度为3M。羟基四氢嘧啶作为四氢嘧啶的衍生物其合成受到热刺激的诱导，在嗜盐菌的最优生长温度下只有少量合成，通常要提高生长温度才能够较多量的合成，例如Halomonas ventosae DL7在营养培养基试管中摇床培养，培养温度从 30°C提高到37°C或者42°C，但是提高生长温度严重抑制了其生长，又导致了四氢嘧啶合成量的严重下降，也从而影响了羟基四氢嘧啶的产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种以合理成本提高四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的合成效率的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法。实现本发明目的之一的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶的方法，包括如下步骤(1)菌种活化，将嗜盐菌种放入盛有营养液的试管中，在摇床上进行培养活化；(2)种子培养，将活化后的菌种放入盛有培养液和嗜盐菌种的三角瓶中，在摇床上进行培养；(3)发酵阶段，发酵在嗜盐菌的最优生长盐分下培养，将细胞增殖到最高浓度；
(4)通过补料将培养基的盐浓度迅速提高到3 3. 5M，然后继续培养3 8h，使四氢嘧啶的合成量大大提高。所述步骤(1)中的菌种活化是在温度30°C，摇床培养18 Mh。所述步骤O)中的种子培养是在温度30°C，摇床培养18 Mh。所述步骤(3)中的最优生长盐分是1 2M NaCl，培养18 Mh，达到最高浓度。所述步骤中的补料提高盐浓度的时间为1 池。实现本发明目的之二的培养嗜盐微生物生产羟基四氢嘧啶的方法，包括如下步骤(1)菌种活化，将嗜盐菌种放入盛有营养液的试管中，在摇床上进行培养活化；(2)种子培养，将活化后的菌种放入盛有培养液和嗜盐菌种的三角瓶中，在摇床上进行培养；(3)发酵阶段，发酵在嗜盐菌的最优生长盐分下培养，将细胞增殖到最高浓度；(4)通过补料将培养基的盐浓度迅速提高到3 3. 5M，然后继续培养3-他，使四氢嘧啶的合成量大大提高；(5)将培养温度从最优生长温度提高到较高温度，继续培养3 10h，获得较高的羟基四氢嘧啶合成量。所述步骤(1)中的菌种活化是在温度30°C，摇床培养18 24h ；所述步骤O)中的种子培养是在温度30°C，摇床培养18 Mh。所述步骤(3)中的最优生长盐分是1 2M NaCl，培养18 Mh，达到最高浓度。所述步骤(4)中的补料提高盐浓度的时间为1 池。所述步骤(5)中的最优生长温度是30 32°C;提高温度的时间是1 池；所述较高温度是37 42 °C。本发明的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法的有益效果如下本发明的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法，在发酵过程中通过渗透压冲击(即在较短时间内通过迅速提高环境渗透压，例如Ih内将过化钠浓度从IM 提高到3M，使菌细胞外部渗透压迅速提高。)和热冲击方法(即在短时间内迅速提高环境温度，例如Ih内将培养温度从30°C提高到42°C，使菌细胞外部热压迅速提高。)培植发酵接种菌株，以合理成本大大提高了生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶合成率。
具体实施例方式实施例11、取一个接种环在超净工作台上将Halomonas ventosae DL7菌株接到含有6ml 液体营养培养基的试管中在240rpm的摇床中30°C下培养20h活化。2、在装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，接入活化的上述菌液2. 5ml，在 MOrpm的摇床上30°C培养Mh，共平行培养3瓶。种子培养基(IL):葡萄糖10g，氯化钠 58. 4g，氯化铵2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾0. 6g，酵母膏lg，蛋白胨lg。3、在装有3L发酵培养基的5L发酵罐中接入150ml种子菌液，800转/分，pH控制在7. 0-7. 2，通气量为0. 2-0. 4v/v. min (每分钟每体积培养基通无菌空气的体积比)，发酵IOh后开始补料，使葡萄糖浓度维持在20g/l左右，在30°C下培养18h，18h后Ih内加入
4NaCl至3M，继续培养他。如果生产四氢嘧啶为主，发酵到此结束，随后离心回收菌体，释放胞内四氢嘧啶产物，然后浓缩，膜过滤，结晶得到四氢嘧啶产物。生产羟基四氢嘧啶转入步骤4。发酵培养基(IL):葡萄糖20g，氯化钠58.4g，氯化铵2g，硫酸镁2g，磷酸氢二钾0.6g， 硫酸亚铁O.Olg，酵母膏lg，蛋白胨lg，谷氨酸钠5g。补料培养基(IL):葡萄糖500g，氯化钠按照需要波动，氯化铵20g，硫酸镁20g，磷酸氢二钾6g，硫酸亚铁0. 02g,酵母膏20g，蛋白胨 20g。4、将上述培养24h的发酵液Ih内提高培养温度到42°C，继续培养8h，培养过程中通过补充3M的NaOH保持pH在7. 0-7. 2的范围内。培养结束后通过离心回收菌体，酒精提取释放胞内四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶产物，然后浓缩，膜过滤，结晶得到四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶。本实施例的发酵方法和常用发酵方法的产率比较如下
权利要求
1.一种培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶的方法，包括如下步骤(1)菌种活化，将嗜盐菌种放入盛有营养液的试管中，在摇床上进行培养活化；(2)种子培养，将活化后的菌种放入盛有培养液和嗜盐菌种的三角瓶中，在摇床上进行培养；(3)发酵阶段，发酵在嗜盐菌的最优生长盐分下培养，将细胞增殖到最高浓度；(4)通过补料将培养基的盐浓度迅速提高到3 3.5M，然后继续培养3 他。
2.根据权利要求1所述的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶的方法，其特征在于所述步骤(1)中的菌种活化是在温度30°C，摇床培养18 Mh。
3.根据权利要求1所述的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶的方法，其特征在于所述步骤O)中的种子培养是在温度30°C，摇床培养18 Mh。
4.根据权利要求1所述的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶的方法，其特征在于所述步骤(3)中的最优生长盐分是1 2M NaCl，培养18 24h，达到最高浓度。
5.根据权利要求1所述的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶的方法，其特征在于所述步骤中的补料提高盐浓度的时间为1 池。
6.一种培养嗜盐微生物生产羟基四氢嘧啶的方法，包括如下步骤(1)菌种活化，将嗜盐菌种放入盛有营养液的试管中，在摇床上进行培养活化；(2)种子培养，将活化后的菌种放入盛有培养液和嗜盐菌种的三角瓶中，在摇床上进行培养；(3)发酵阶段，发酵在嗜盐菌的最优生长盐分下培养，将细胞增殖到最高浓度；(4)通过补料将培养基的盐浓度迅速提高到3 3.5M，然后继续培养3- ；(5)将培养温度从最优生长温度提高到较高温度，继续培养3 10h。
7.根据权利要求6所述的培养嗜盐微生物生产羟基四氢嘧啶的方法，其特征在于所述步骤(1)中的菌种活化是在温度30°C，摇床培养18 Mh ；所述步骤O)中的种子培养是在温度30°C，摇床培养18 Mh。
8.根据权利要求6所述的培养嗜盐微生物生产羟基四氢嘧啶的方法，其特征在于所述步骤(3)中的最优生长盐分是1 2M NaCl，培养18 Mh，达到最高浓度。
9.根据权利要求6所述的培养嗜盐微生物生产羟基四氢嘧啶的方法，其特征在于所述步骤中的补料提高盐浓度的时间为1 》1。
10.根据权利要求6所述的培养嗜盐微生物生产羟基四氢嘧啶的方法，其特征在于所述步骤(5)中的最优生长温度是30 32°C ；提高温度的时间是1 池；所述较高温度是 37 42°C。
全文摘要
本发明的目的是提供一种以合理成本提高四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的合成效率的培养嗜盐微生物生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的方法。本发明的培养嗜盐微生物生产羟基四氢嘧啶的方法，包括如下步骤(1)菌种活化；(2)种子培养；(3)发酵阶段；(4)通过补料将培养基的盐浓度迅速提高到3～3.5M，然后继续培养3～8h，使四氢嘧啶的合成量大大提高；(5)将培养温度从最优生长温度提高到较高温度，继续培养3～10h，获得较高的羟基四氢嘧啶合成量。本发明在发酵过程中通过渗透压冲击和热冲击方法培植发酵接种菌株，以合理成本大大提高了生产四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶合成率。
文档编号C12R1/01GK102286564SQ20111025609
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者吴建, 朱道辰, 王成栋, 陈华友, 陈焱 申请人:朱道辰