专利名称：抑制hiv-1的双长发卡结构rna表达原件的构建及功能检测的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域。
背景技术：
艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)，由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染引起，是最严重的流行病之一。而抑制HIV-I的复制可以有效改善艾滋病病人的生命状况，同时也是HIV-I 相关研究的必要实验手段。目前，抑制HIV-I的方法包括通过逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、受体类似物以及RNA干扰等方法。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是通过在基因转录水平抑制HIV-1的基因表达的方法。实现RNAi的方法包括化学合成小的siRNA片段直接进行RNAi，或通过基因载体表达人工RNAi诱导前体进行RNAi。化学合成siRNA由于成本较高，难于广泛使用。通过基因载体表达人工RNAi诱导前体进行RNAi，通常是通过DNA依赖的RNA聚合酶III (Pol III， TO或Hl启动子)转录表达的短RNA折叠而成的发卡结构，称为短发卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)。目前已报道针对HIV-I的近两百条已通过实验检测效果的siRNA或shRNA序列，为HIV-I的RNAi靶位点的选取提供大量信息和参考依据。但同时由于HIV-I复制迅速、突变率高的特点，使单一的RNAi没有有效的抑制效果。数学模型以及相关的实验数据显示，至少需要4个不同的靶位点的siRNA才可以有效抑制HIV-I产生逃逸突变。对HIV-I 的RNAi基因治疗应采用多靶位RNAi的方式。如果采用多个单独的shRNA表达原件进行多个独立抑制，往往会对正常的细胞RNA干扰通路进行干扰，因此可以采用多个RNAi通过单一启动子进行实现。本发明采用单一启动子表达RNA，形成特殊的双长发卡结构，对HIV-I 的多个基因进行RNAi抑制。
发明内容
本发明的目的是为了实现对多个HIV-I的基因进行抑制，设计针对HIV-I不同靶基因区域的siRNA序列，通过Two-St印PCR的方法构建针对HIV-I的dlhRNA_VGTE的表达原件，并构建于载体质粒。建立体外实验研究其抑制HIV基因融合EGFP表达质粒系统的效果，在体外实验细胞水平中通过显微荧光及流式细胞分析检测其抑制HIV-I基因表达的效果。实现单一表达原件对多个HIV-I基因的表达抑制。本发明首先提供了抑制HIV-I的双长发卡结构RNA表达原件(dlhRNA_VGTE)的基因序列，该序列是序列表SEQ ID No. 1所示的序列，序列标注见附图
4;该表达原件在真核细胞中，通过聚合酶的作用，转录成RNA，折叠成为dlhRNA的二级结构，在核酸酶Dicer的作用下，被切割成为四个独立的siRNA (19nt)分别行使RNA干扰作用。本发明根据HIV-I序列保守性和RNAi靶序列特点，分别选择了 HIV的4个基因2 个结构基因env，gag和2个调节基因vpu，tat作为抑制靶点，设计选取权利要求1所述序列靶向HIV-I的如下四个RNAi靶序列
权利要求
1.抑制Hiv-I的双长发卡结构RNA表达原件(dlhRNA-VGTE)的基因序列，是序列表SEQ ID No. 1所示的序列；该表达原件在真核细胞中，通过聚合酶的作用，转录成RNA，折叠成为 dlhRNA的二级结构，在核酸酶Dicer的作用下，被切割成为四个独立的siRNA(19nt)分别行使RNA干扰作用。
2.如权利要求1所述的序列，其特征在于，根据HIV-I序列保守性和RNAi靶序列特点， 分别选择了 HIV的4个基因2个结构基因env，gag和2个调节基因vpu，tat作为抑制靶点，设计选取权利要求1所述序列靶向HIV-I的如下四个RNAi靶序列GeneSense strandAnti-sense strandenvGTTGGAGAAGTGAATTATATATATATAATTCACTTCTCCAACgagGGGAGCCACCCCACAAGATTTAAATCTTGTGGGGTGGCTCCCvpuGGAGCAGAAGACAGTGGCAATATTGCCACTGTCTTCTGCTCCtatGGCATCTCCTATGGCAGGAAGCTTCCTGCCATAGGAGATGCC上述序列用Blast在线进行同源分析证实为HIV-I保守序列。
3.如权利要求1所述双长发卡结构RNA表达原件(dlhRNA-VGTE)序列的构建方法，其特征在于，过Two-st印PCR法获得(long hairpin RNA, IhRNA)长发卡RNA表达原件，再以 IhRNA 为模板经过 Two-st印 PCR 法获得(double long hairpin RNA, dlhRNA)双长发卡 RNA表达原件；最终构建含有dlhRNA-VGTE表达原件的质粒pGMT-dlhRNA_VGTE。
4.检测如权利要求1所述双长发卡结构RNA表达原件(dlhRNA-VGTE)序列功能所需的 HIV 基因 EGFP 融合蛋白表达质粒 pfeig-EGFP/pEnv-EGFP/pI^at-EGFP/pVpu-EGFP。
全文摘要
抑制HIV-1的双长发卡结构RNA表达原件构建及功能检测，本发明属基因工程技术领域。本发明根据siRNA的设计原理以及HIV-1序列保守性分析，选择HIV-1的衣壳蛋白gag基因(532－552)，包膜蛋白env基因(1428－1448)，非结构蛋白tat基因(131－151)和vpu基因(143－161)，设计相应siRNA序列，通过两次Two-stepPCR的方法，最终构建双长发卡结构RNA表达原件(序列表SEQIDNo.1所示)，通过显微荧光观测以及流式细胞分析定量检测双长发卡结构RNA表达原件对HIV基因EGFP融合蛋白真核表达的抑制效果。实验证实dlhRNA表达原件可以有效抑制HIV多个基因的表达。
文档编号C12Q1/68GK102352360SQ20111035748
公开日2012年2月15日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者刁丹红, 刘畅, 孔晓红, 梁之聘, 袁青 申请人:南开大学