专利名称：牡蛎单孢子虫lamp检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及牡蛎单孢子虫检测领域，尤其是一种牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒。
背景技术：
单孢子虫(Haplospori dium sp)对牡蛎养殖的危害较大，主要感染牡蛎血细胞、 结蒂组织和消化道上皮，可引起牡蛎较高的死亡率，在美洲、大洋洲和亚洲等国家的感染普遍存在。单孢子虫的传统检测方法有电镜观察、组织细胞学检查、原位杂交等，这些方法费时费力，缺乏专一性，在实际工作中具有一定的局限性。目前，虽已建立起单孢子虫PCR和荧光定量PCR检测方法，其检测敏感性也比较高，但是常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，荧光定量PCR则需要使用更加昂贵的荧光定量PCR仪和试剂等，，因而难以适应基层现场检测需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，以满足基层现场快速检测牡蛎单孢子虫的需要。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂反应液A 含有IOX等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物l、20uM的内引物2、20uM的外引物l、20uM的外引物2、20uM的环引物
1、20碰的环引物2、511甜菜碱、6251^钙黄绿素和12.5mM氯化锰；IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通X-100 ；内引物 1 序列为 AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG，内引物 2 序列为 GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG，外引物1 序列为 GACGATCAGATACCGTCG，外引物2 序列为 TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA，环引物1 序列为 GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG，环引物2 序列为 ACGGAAGGGCACCACCAGAT。反应液A每管Mul，其组成为2. 5ul IOX等温反应缓存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul IOmM dNTPs,3ul 25mM硫酸镁、0. 25ul 20uM的内引物 1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物1、Iul 20uM的环引物
2、0.5ul5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素和Iul 12. 5mM氯化锰和5. 5ul双蒸水。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据牡蛎单孢子虫共有的基因保守区(见序列表SEQ. ID. No. 1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物，由此发明了用于快速检测牡蛎单孢子虫的牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒。应用本发明的LAMP检测试剂盒建立牡蛎单孢子虫检测方法，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎单孢子虫。该法无需昂贵的PCR仪只需普通水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而快速，特别适用于基层现场检测。另外，常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入STOR Green I或Gene Finder染料来显色，容易造成假阳性一方面，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境造成假阳性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料还会由于引物二聚体而引起假阳性。因此，本发明使用内加钙黄绿素+氯化锰替代了外加的STOR Green I和Gene Finder 染料，即在配置LAMP反应液时就加入反应液中而无需LAMP反应后再开盖加入；而且，钙黄绿素+氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现绿色，避免了 STOR Green I和Gene Finder染料带来的假阳性问题，所以具有更好的特异性。
图1是应用本发明牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图。图1中1单孢子虫，2折光马尔太虫，3副溶血弧菌，4派琴虫，5溶藻弧菌，6河弧菌，7拟态弧菌，8牡蛎组织。图2是应用本发明牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验结果图。图2中1-8分别为以下不同浓度的牡蛎单孢子虫DNA Ing/管，IOOpg/管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。图3是PCR方法检测牡蛎单孢子虫敏感性试验结果图。图3中M为IOObp DNA ladder, 1-8分别为以下不同浓度的牡蛎单孢子虫DNA Ing/ 管，IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。
具体实施例方式一、牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒的配制反应液A 每管Mul，其组成为2. 5ul IOX等温反应缓存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul IOmM dNTPs,3ul 25mM硫酸镁、0. 25ul 20uM的内引物 1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物1、Iul 20uM的环引物 2、0.5ul 5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素和Iul 12. 5mM氯化锰和5. 5ul双蒸水。其中，IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1 %曲拉通X-100。内引物 1 序列为 AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG (见序列表 SEQ. ID. No. 2)，内引物 2 序列为 GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG (见序列表 SEQ. ID. No. 3)，外引物1 序列为 GACGATCAGATACCGTCG(见序列表 SEQ. ID. No. 4)，外引物2 序列为 TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA(见序列表 SEQ. ID. No. 4)，环引物1 序列为 GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG(见序列表 SEQ. ID. No. 6)，
环引物 2 序列为 ACGGAAGGGCACCACCAGAT (见序列表 SEQ. ID. No. 7)。二、应用本发明牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒检测牡蛎单孢子虫的方法(以下简称LAMP检测法)1、组织样品中DNA的提取使用北京天跟生物工程公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(商品名海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，型号DP3M-0;3)提取组织DNA，浓度能达到20ng/ul。2、牡蛎单孢子虫LAMP反应以提取的牡蛎单孢子虫DNA为模板，在装有MyL反应液A管中加入1 μ L待检 DNA构成25ul反应体系；LAMP反应程序如下62°C 60min，然后80°C 5min。直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有牡蛎单孢子虫；如果颜色为桔红色，说明待检样品不含有牡蛎单孢子虫。三、LAMP检测法的特异性和敏感性试验1.特异性试验分别以单孢子虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌、拟态弧菌和牡蛎组织的核酸为模板，按照前述牡蛎单孢子虫LAMP反应体系和条件进行反应。结果见图1，对牡蛎单孢子虫的检测为阳性结果(显示绿色)，而对折光马尔太虫、 副溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌、拟态弧菌和牡蛎组织的检测均为阴性(显示桔红色)。2.敏感性试验将牡蛎单孢子虫DNA按 10 倍递增稀释成 lng、lOOpg、IOp g、lpg、IOOfg、IOfg、lfg、 0. lfg。牡蛎单孢子虫LAMP检测方法检出限与PCR对比牡蛎单孢子虫LAMP检测方法反应体系和条件按前述进行。牡蛎单孢子虫PCR反应组成如下在25ul的反应体系中含10XPCR Buffer 2. 5μ L,2. 5mmol/L dNTP 2 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0. 5 μ 1，牡蛎样品模板 DNA 1 μ L, 25 μ mol/L 的上、下游引物(上游引物为 MSX-A :5，-CGACTTTGGCATTAGGTTTCAGACC-3，；下游引物为 MSX-B :5，-ATGTGTTGGTGACGCTAACCG-3，，)各 0. 5 μ 1，dd H2O 补足 25 μ L。扩增程序为94°C变性5分钟，然后进入94°C变性1分钟，55°C退火1分钟，72°C延伸1分钟的循环， 共进行35个循环，最后再经72°C延伸10分钟。牡蛎单孢子虫LAMP检测方法通过肉眼直接观察结果，结果见图2。将PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，然后进行溴化乙锭染色，结果见图3。牡蛎单孢子虫LAMP检测
方法的检测限为lfg，而常规PCR的检测限为100fg，LAMP方法敏感性比常规PCR高100倍。
权利要求
1.一种牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂 反应液A 含有IOX等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物1、20uM的内引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的环引物1、 20碰的环引物2、511甜菜碱、625 4 11钙黄绿素和12. 5mM氯化锰；所述IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM 硫酸镁和曲拉通X-100 ；所述内引物 1 序列为 AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG， 所述内引物 2 序列为 GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG， 所述外引物1序列为GACGATCAGATACCGTCG， 所述外引物2序列为TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA， 所述环引物 1 序列为 GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG， 所述环引物2序列为ACGGAAGGGCACCACCAGAT。
2.根据权利要求1所述的牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于所述反应液A每管Mul，其组成为2.5ul IOX等温反应缓存液、l.Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul IOmM dNTPs,3ul 25mM硫酸镁、0. 25ul 20uM的内引物 1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物1、Iul 20uM的环引物 2、0.5ul 5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素和Iul 12. 5mM氯化锰和5. 5ul双蒸水。
全文摘要
本发明公开了一种牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，它采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据牡蛎单孢子虫共有的基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物。应用本发明的LAMP检测试剂盒，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎单孢子虫，解决了现有技术检测时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷，具有特异性强、敏感性高、快速且成本低、操作方法更简单，特别适于基层现场快速检测牡蛎单孢子虫的需要。
文档编号C12Q1/68GK102363810SQ20111035650
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者刘加波, 庞耀珊, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所