专利名称：α-氨基酸酯水解酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明与多肽有关，尤其与来源于大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28a-aeh的a_氨基酸酯水解酶突变体有关。
背景技术：
α-氨基酸酯水解酶(EC 3. 1. 1.43)相比青霉素酰化酶而言，具有诸多优点不受苯甘氨酸的抑制；对D型苯甘氨酸甲酯有构象选择性，工业上可以直接使用消旋混合物，而不必先进行拆分；其最适反应PH比青霉素酰化酶低，也使反应体系中的底物和产物更稳定。长期以来，a-氨基酸酯水解酶的研究受到生物学家和药学家的重视，有关a_氨基酸酯水解酶产酶菌株的分离、酶基因的鉴定及其在生物转化中的应用也有一些报道。虽然a-氨基酸酯水解酶具有一系列优点，但酶的某些性质还需进一步优化以适应工业化的需要。对于一种具有经济吸引力的酶法制备内酰胺抗生素工艺来说，理想的是合成/水解比率(S/H比率)要高。优选地，S/H比率高，且同时酶活性也足够高。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于β-内酰胺抗生素的合成，生产效率高，不对β-内酰胺环有明显水解作用，合成/水解比率高，酶活性也适于合成生产过程的α -氨基酸酯水解酶突变体。本发明是这样实现的
本发明1、α -氨基酸酯水解酶突变体，其特征在于大肠杆菌的a-氨基酸酯水解酶脱氧核糖核酸的碱基序列见序列表中序列1，所编码的多肽的氨基酸序列见序列表中序列2，所述氨基酸序列中的175位上的氨基酸为丙氨酸，所述大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28-aehY175A 的分类命名大肠埃希氏菌，拉丁文名federidia cWi，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No. 4758。保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。应用于β—内酰胺抗生素的合成，合成水解比率为1. 9。其制备方法如下
(1)从大肠杆菌BL21 (DE3) /pET28a-aeh中提取
图1所示重组质粒pEI^8a_aeh，大肠杆菌BL21(DE3)/pET28_aeh的分类命名大肠埃希氏菌，拉丁文名Escherichia coli，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No. 4757，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh的制备方法如下
a将黄单孢菌基因组用PCR方法扩增目的基因aeh，所用载体为pGEM_T，aeh的酶切位点为EcoRI和XholJf EcoRI-aeh-XhoI片段与载体pGEM_T连接，转化入宿主菌JM109，选择白色菌落，得重组质粒pGEM-T-aeh，
b将重组质粒pGEM-T-aeh和载体pET28a双酶切，对线性化后的pET28a载体进行去磷酸化，用连接酶将aeh和载体pET28a连接，转化入宿主菌JM109，得重组质粒pEI^8a-aeh，c从宿主菌JM109中提取重组质粒pET28a-aeh转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞， d培养转化细胞，使重组质粒pET28a-aeh随大肠杆菌BL21 (DE3)细胞一起大量扩增， e从扩增的细胞中筛选出含有重组质粒的pET28a-aeh细胞，即得大肠杆菌BL21 (DE3) / pET28_aeh。(2)设计1种定点突变引物，其核苷酸序列如下 正向引物GCATGATCGGTTCGTCCGCCGAGGGCTTCACCG
反向引物CGGTGAAGCCCTCAGCGGACGAACCGATCATGC
向PCR薄壁反应管中添加如下组分
权利要求
1.α-氨基酸酯水解酶突变体，其特征在于大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aehY175A的 α-氨基酸酯水解酶脱氧核糖核酸的碱基序列见序列表中序列1，所编码的多肽的氨基酸序列见序列表中序列2，所述氨基酸序列中的175位上的氨基酸为丙氨酸，所述大肠杆菌 BL21(DE3)/pET28-aeh Y175A的拉丁文名co/i，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No. 4758。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于应用于β-内酰胺抗生素的合成。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于其制备方法如下(1)从大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh中提取图1所示重组质粒pET28a-aeh，大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aeh的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No. 4757，大肠杆菌BL21 (DE3) /pET28-aeh的制备方法如下a将黄单孢菌基因组用PCR方法扩增目的基因aeh，所用载体为pGEM_T，aeh的酶切位点为EcoRI和XholJf EcoRI-aeh-XhoI片段与载体pGEM_T连接，转化入宿主菌JM109，选择白色菌落，得重组质粒pGEM-T-aeh，b将重组质粒pGEM-T-aeh和载体pET28a双酶切，对线性化后的pET28a载体进行去磷酸化，用连接酶将aeh和载体pET28a连接，转化入宿主菌JM109，得重组质粒pEI^8a-aeh， c从宿主菌JM109中提取重组质粒pET28a-aeh转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞， d培养转化细胞，使重组质粒pET28a-aeh随大肠杆菌BL21 (DE3)细胞一起大量扩增， e从扩增的细胞中筛选出含有重组质粒的pET28a-aeh细胞，即得大肠杆菌BL21 (DE3) / pET28-aeh,(2)设计1种定点突变引物，其核苷酸序列如下 正向 5' GCATGATCGGTTCGTCCGCCGAGGGCTTCACCG3' 反向 5’ CGGTGAAGCCCTCAGCGGACGAACCGATCATGC3，，(3)在PCR仪中热循环扩增质粒DNA， 热循环仪中发生以下步骤.1.94°C2 分钟.2.940C30 秒.3.58 0C30 秒.4.68 0C7. 4 分钟.5.2-4 步X 15 次 72 0C 10 分钟，(4)用限制性内切酶切割PCR仪产物，除去野生型质粒，过程如下向50ulPCR产物中加入2ul 10U/ul的DpnI，混勻，37°C孵育Ih去除野生型质粒，(5)用(4)得到的反应混合物转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，(6)将(5)的培养物制备无细胞裂解液，(7)将无细胞裂解液用亲和柱纯化，即得突变体。
全文摘要
本发明为α-氨基酸酯水解酶突变体，解决已有α-氨基酸酯水解酶在合成抗生素中合成/水解比率不高的问题。大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aehY175A的a-氨基酸酯水解酶脱氧核糖核酸的碱基序列见序列表中序列1，所编码的多肽的氨基酸序列见序列表中序列2，所述氨基酸序列中的175位上的氨基酸为丙氨酸，所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-aehY175A的拉丁文名Escherichiacoli，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCCNo.4758。
文档编号C12N15/70GK102533695SQ20111035590
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者叶丽娟, 李端华, 李进军, 王辂, 赵晨 申请人:中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所