专利名称：一种蛇足石杉内生真菌及其产石杉碱甲的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及蛇足石杉内生真菌及其产石杉碱甲的应用。
背景技术：
老年痴呆症是一种严重的、退行性脑疾患，由于其发病率高，至残率高，给社会和家庭造成了严重的危害和巨大的负担；治疗老年痴呆症是摆在当前社会的一大难题。石杉碱甲于1994年上市、是我国拥有自主知识产权的一种高效、安全的治疗老年痴呆症的药物，与国外开发的同类药物相比，具有不良反应少，价格低、服用量小等优点，具有广阔的应用前景。目前，石杉碱甲主要来源于野生植物蛇足石杉全草，而蛇足石杉生长缓慢，生物量小，分布范围较窄，石杉碱甲含量极低，在植物中仅含万分之几。由于植物原料来源的限制，每年只有30公斤的产量，使石杉碱甲自问世以来，其资源危机便形影不离。中国是石杉碱甲原料唯一出口国，资源已成为制约石杉碱甲临床应用的瓶颈。由于石杉碱甲的结构特殊，其骨架中的桥环结构难以人工合成，目前所有化学合成方法均步骤复杂、合成条件苛刻、试剂昂贵、产率很低、很难实现工业化，而具有光学活性的石杉碱甲合成更为复杂；植物组织培养因无法消除其内在的微生物污染，同时由于该植物生长条件十分苛刻，所以至今都未能走出实验室。植物内生真菌是一个多样性十分丰富的微生物类群，它们寄生于健康植物组织内而不产生外在感染症状，并与宿主植物协同进化。内生真菌产生的代谢产物有很多是应用前景广阔的新型生物活性产物。自从1993年Strobel等发现从短叶红豆杉中分离出的内生真菌能够合成抗癌成分紫杉醇以来，人们希望通过采用内生真菌发酵合成药用成分。真菌具有易于培养，生长快的特点以及由于现代发酵工业和微生物育种技术的成熟，采用微生物工业化发酵生产石杉碱甲具有最大的可能性。目前已有报道，从蛇足石杉植物中分离到产石杉碱甲及其类似物的内生真菌，如专利CN 101195804A(黎万奎，专利申请号:200610119149.7，内生枝顶孢霉)、CN101240304A(吴东才，专利申请号:200710003519.5，枝孢霉菌)、CN 101265451A(张晶等，专利申请号:200710086540.6，木霉菌)、CN 101942393A(朱笃等，专利申请号:200910186852.3，竹黄菌)等；以及龚玉霞(《蛇足石杉内生真菌的分离及生物活性初步研究》，安徽师范大学，硕士论文，2007，茎点霉)等。以上所有研究都表明，可以利用蛇足石杉内生真菌发酵生产石杉碱甲，但目前所分离到的产石杉碱甲菌株，都因产量太低，只有ng级，远远达不到mg级，而且存在菌种退化等问题，以至于无法实现大规模生产石杉碱甲，使得石杉碱甲的短缺问题仍然无法解决。本发明首次发现炭疽菌(Colletotrichum sp.)可以产石杉碱甲，希望通过进一步的研究如微生物育种学和发酵过程优化等手段，能够得到产量高、稳定性好等要求的高产菌株，以达到工业化生产，进而通过工业化发酵生产技术来解决石杉碱甲药源紧缺的问题，为石杉碱甲的临床应用及研究提供有力的保证
发明内容
本发明的目的是提供一种供发酵生产石杉碱甲药物的蛇足石杉内生真菌。为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一株蛇足石杉内生真菌，命名为炭疽菌(Colletotrichum sp.) SY-1,其保藏单位、保藏号和保藏日期为:中国普通微生物菌种保藏管理中心:CGMCC5289,2011年9月23日；中国典型培养物保藏中心:CCTCC M 2011293，2011年08月19日。上述蛇足石杉内生真菌其基因组ITS特征碱基序列为SEQ ID NO:1。上述蛇足石杉内生真菌它的固体培养菌落特征为PDA培养基28°C培养，7天菌落直径700X730mm，菌落正面呈同心圆状，中央淡灰色，外层灰黑色，边缘白色，绒毛状，背面中央灰白色，外层灰黑色，边缘灰白相间，呈放射状，10天布满整个平板，菌落呈一致的深灰色，背面灰黑色。上述蛇足石杉内生真菌它的显微形态为:菌丝有隔，分支，分生孢子无色，单孢，圆筒形，两端钝圆，有1-2个油球，附着孢褐色，倒梨形。
上述蛇足石杉内生真菌菌株的培养及石杉碱甲提取分离方法:a、在无菌条件下，取少量菌丝，接入已灭菌的PDA固体培养基试管，于26°C 30 V活化培养72小时； b、取步骤a活化培养好的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的PDA固体培养基平板上，在26°C 30°C下培养10天；C、取培养好的如权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌的菌丝体及其培养基切碎，放入具塞三角瓶中，加2%酒石酸浸泡24小时，超声波处理I小时，过滤，滤液用2 4倍量的氯仿萃取2 5次,取酸水液用氨水调pH值到9 11，用3倍量的氯仿萃取2 5次，浓缩至干，用甲醇溶解，吹干，用磷酸盐缓冲液水溶液溶解，加入C18固相萃取小柱分离，得石杉碱甲粗提物。本发明的有益效果为本发明所述的一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌-是从石杉科植物蛇足石杉活体中分离纯化到的丝状真菌，经过固体发酵，经HPLC、LC/MS检测实验证明该菌能够产生与寄主植物相同的化合物石杉碱甲，是寻找石杉碱甲新药源的一种重要的微生物，有较大的应用价值。该蛇足石杉内生真菌可在普通条件下培养，可以利用该微生物的特点以及现代发酵技术，达到工业化生产石杉碱甲，以解决石杉碱甲开发的瓶颈问题，同时可以挽救濒临灭绝的石杉碱甲自然资源。
图1:为本发明的蛇足石杉内生真菌在40X10倍显微镜下观察到的菌丝和孢子形态菌株显微形态特征图；图2:为本发明所述的蛇足石杉内生真菌的菌落形态；图3:本发明的蛇足石杉内生真菌生物碱成分色谱图；图4:石杉碱甲标准品色谱图；图5:为本发明所述的蛇足石杉内生真菌生物碱目标组分质谱图，其分子离子峰分别为 m/z244.2/243.2/226.2 ；图6:与石杉碱甲标准品质谱扫描图，其分子离子峰分别为m/z244.2/243.2/226.2。
具体实施例方式为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。 本发明所述的蛇足石杉内生真菌是从蕨类植物蛇足石杉(huperziaserrata)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经分类学鉴定为炭疽菌(Colletotrichum sp.)。该菌株命名为炭疽菌(Colletotrichum sp) SY-1,其保藏单位、保藏号和保藏日期为:中国普通微生物菌种保藏管理中心:CGMCC5289，2011年9月23日；中国典型培养物保藏中心:CCTCC M 2011293,2011年08月19日。实施例1a、请参阅图1，为本发明菌株显微形态特征图，取本发明的产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌菌株，在无菌条件下，用竹签挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA固体培养基试管，于28 °C活化培养72小时；b、取步骤a活化培养好的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的PDA固体培养基平板上，在28°C下培养10天；C、取培养好的菌丝体及其培养基切碎，放入具塞三角瓶中，加2%酒石酸浸泡24h，超声一小时，过滤，取滤液用2-4倍量的氯仿萃取2-5次,取酸水液用氨水调pH值到9-11，用3倍量的氯仿萃取2-5次，浓缩至干，用甲醇溶解，吹干，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，加入C18固相小柱进行分离，得石杉碱甲粗提物，加甲醇溶解。PDA培养基制备:取马铃薯200g (去皮)切成小块，放入IOOOml水中煮沸30min，过滤弃去马铃薯，滤液加水补至I升，加入葡萄糖20g琼脂12g，pH值自然，高压灭菌待用。HPLC 和 LC/MS 分析1、HPLC (高效液相色谱)条件:色谱柱:BDSHypersil C18 (4.6 X 250mm, 5um),流动相:甲醇:0.1% 甲酸水溶液(14: 86)，流速:lml/min，检测波长:310nm ;柱温:30°C，进样量:20ul。2、LC/MS (液质联用色谱)条件:色谱条件:色谱柱=XTerraMS C18 (2.1 X 50mm 5um)流动相:甲醇:0.1%甲酸，梯度洗脱:[time (min): D (methanal) ] =
-[5.00: 40.0]-[10.00: 100.0]-[15.0: 100.0]-[15.00: 10.0];流速:0.3ml/min ;柱温:30°C ;进样量:20ul ;质谱条件:离子源:ESI ;检测方式:正离子检测；采集方式:MS Scan ;检测对象:石杉碱甲，m/z 243.2/244.2/226.2 ;毛细管电压:2.71KV，锥孔电压:42V，离子源温度:120°C，脱溶剂温度:200°C，脱溶剂气流量:900L/hr。3、经过以上HPLC、LC/MS检测，本发明中的蛇足石杉内生真菌通过发酵可以产石杉碱甲化合物，请参阅图3、图4、图5、图6。本发明所述的蛇足石杉内生真菌生物碱成分色谱图如图3所示，图中所示的30.602min,是目标峰出峰时间与石杉碱甲标准品色谱图如图4,图中所示的30.7min,是目标峰出峰时间， 两者有一致的出峰时间。图5为本发明所述的蛇足石杉内生真菌生物碱目标组分质谱图，其分子离子峰分别为m/z244.2/243.2/226.2与石杉碱甲标准品质谱扫描图如图6，其分子离子峰分别为m/z244.2/243.2/226.2，可以认定两者是同一组分为石杉碱甲。本发明所述的产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌-炭疽菌(Colletotrichum sp.)SY-1是从石杉科植物蛇足石杉活体中分离纯化到的丝状真菌，经过固体发酵，经HPLC、LC/MS检测实验证明该菌能够产生与寄主植物相同的化合物石杉碱甲，是寻找石杉碱甲新药源的一种重要的微生物，有较大的应用价值。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在 本发明的专利保护范围内。
权利要求
1.一种蛇足石杉内生真菌，命名为炭疽菌(Colletotrichum sp.) SY-1,其保藏单位和保藏号为:中国典型培养物保藏中心，CCTCC M2011293。
2.如权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，它的基因组ITS特征碱基序列为:ACCCTTTGTGACATACCTATAACTGTTGCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGTGACCCTCCCGGCCTCCCGCCCCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAGGATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGAGTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACGGCTGACGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGAAAAo
3.如权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，它的固体培养菌落特征为PDA培养基28°C培养，7天菌落直径700X 730mm，菌落正面呈同心圆状，中央淡灰色，外层灰黑色，边缘白色，绒毛状，背面中央灰白色，外层灰黑色，边缘灰白相间，呈放射状，10天布满整个平板，菌落呈一致的深灰色，背面灰黑色。
4.如权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌，其特征在于，它的显微形态为:菌丝有隔，分支，分生孢子无色，单孢，圆筒形，两端钝圆，有1-2个油球，附着孢褐色，倒梨形。
5.如权利要求1所述的`蛇足石杉内生真菌提取石杉碱甲的方法:取培养好的菌丝体及其培养基切碎，放入具塞三角瓶中，加2%酒石酸浸泡24h，超声一小时，过滤，取滤液用2-4倍量的氯仿萃取2-5次，取酸水液用氨水调pH值到9-11，用3倍量的氯仿萃取2-5次，浓缩至干，用甲醇溶解，吹干，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，加入C18固相小柱进行分离，得石杉碱甲粗提物。
6.如权利要求1所述的蛇足石杉内生真菌产石杉碱甲，制备石杉碱甲的应用。
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及蛇足石杉内生真菌及其产石杉碱甲的应用。本发明提供一种蛇足石杉内生真菌，其分类命名为炭疽菌(Colletotrichum sp.)SY-1，其保藏单位、保藏号和保藏日期为中国典型培养物保藏中心CCTCC M 2011293，2011年08月19日。该蛇足石杉内生真菌通过发酵，可以产生石杉碱甲化合物，利用该微生物产石杉碱甲的特点以及现代发酵育种技术，达到工业化生产石杉碱甲，以解决石杉碱甲开发的瓶颈问题，同时可以挽救濒临灭绝的石杉碱甲自然资源。
文档编号C12P17/12GK103103134SQ20111035588
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者吴水生, 王明兹, 刘海元 申请人:吴水生