专利名称：一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种用微生物转化生产甘草次酸的技术。
背景技术：
甘草为我国传统中药材，素有“国老”之称，味甘、性平。归心、肺、脾、胃。补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药。用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒。可缓解药物毒性、烈性。甘草广泛应用于医药、烟草、食品等领域。甘草酸和甘草次酸是甘草的主要有效成分，甘草酸经胃酸水解或经肝中葡萄糖醛酸酶分解形成甘草次酸，甘草酸的药理作用实质上是甘草次酸的效用。甘草次酸(Glycyrrhetinic Acid)的分子式为C3tlH46O4,分子量470. 64KD，为白色结晶性粉末，熔点为288-297°C，结构式如
图1。本品在吡啶中易溶，在乙醇或氯仿中溶解， 在汽油或乙醚中微溶，在水中不溶。近年随着现代中药的发展，各国学者在中医理论的基础上，对甘草有效成分—— 甘草次酸的药理作用进行了深入研究，以寻找高效低毒的新有效成分应用于临床。研究发现甘草次酸不仅具有抗炎、抗溃疡、抗病毒、降血脂、镇咳、平喘及祛痰等作用，还可用于防治病毒性肝炎、高血脂症和癌症等疾病，是有效的干扰素诱生剂及细胞免疫调节剂。将甘草酸类药物与生物碱、抗生素、氨基酸等复配或制成其金属化合物，还可增加药物的稳定性， 提高生物利用度，降低毒副作用。伴随甘草次酸临床应用价值的深入研究，甘草次酸的开发利用也越来越受到国内外医药界的关注。甘草次酸的制备未见化学合成法。目前多以天然豆科植物甘草经加工提取来生产，即植物提取法。植物提取法以甘草为原料提取甘草酸，再通过酸水解法水解甘草酸制取甘草次酸。
权利要求
1.一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，所述的微生物为黄曲霉 Aspergillus flavus, CGMCC No. 5144。
2.如权利要求1所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，包括以下步骤步骤一、将黄曲霉Aspergillus flavus,CGMCC No. 5144接入固体PDA斜面培养基中培养，然后从斜面上按的接种量接种至新鲜种子培养基中进行培养；步骤二、将处于生长期中的经种子培养基培养的菌种按照30%的接种量接种至含新鲜发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵产生含甘草次酸的发酵液。
3.如权利要求1所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其特征是，在步骤二之后还包括步骤三然后从发酵液中分离出甘草次酸粗品，并进行纯化。
4.如权利要求2所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤一中种子培养基的质量百分组成为玉米糖化液0. 5 1. 5%，麸皮汁4. 5 5. 5%，酵母膏0. 5 0.7%，硫酸铵0. 05 0. 15 %，硫酸镁0. 04 0. 06 %，磷酸二氢钾0. 09 0. 11 %，甘草酸粗品0. 09 0. 11%，其余为水。
5.如权利要求4所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤一中种子培养基培养条件为菌株放置到锥形瓶中于转速200rpm的摇床上振摇培养，通气量0. 2m3/h, 培养时间M小时。
6.如权利要求2所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤二中发酵培养基的质量百分组成为甘草酸0. 8 1. 2%，硫酸铵0. 8 1. 0%，硫酸镁0. 03 0. 05%， 磷酸氢二钾0. 6 0. 8 %，磷酸二氢钾0. 7 0. 9 %，其余为水，初始pH4 5。
7.如权利要求6所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，步骤二中发酵罐中发酵培养条件为发酵培养基50 70L，发酵温度20 40°C，通气量0. 3 0. 5m3/h，搅拌速度为130 170rmp，发酵2 4d。
8.如权利要求3所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，甘草次酸的分离包含以下步骤通过滤布过滤，收集滤液1，然后将所得滤液1通过超滤膜PES-20，截流粒径在IOnm以上，分子量在500 500000范围内的物质，收集滤液2 ；采用纳滤膜NF-270过滤上步骤所得滤液2，截流分子量在200 1000左右的低分子物质，收集滤液3。
9.如权利要求3所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，甘草次酸的纯化包含以下步骤先通过大孔吸附树脂H103对所述滤液3进行分离纯化，得到甘草次酸粗品；然后将所得甘草次酸的粗品制成样品胶后水平安置于硅胶柱表面，先用纯石油醚通柱，再用石油醚乙酸乙酯=2 1(体积比)的流动相每次20目洗脱甘草次酸，收集滤液并进行喷雾干燥、分步收集，最后得到甘草次酸纯品。
10.如权利要求1所述的微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，黄曲霉 Aspergillus flavus,CGMCC No. 5144为通过紫外线和Licl复合诱变处理葡萄糖醛酸的曲霉属黄曲霉获得。
全文摘要
本发明提供了一种微生物发酵转化生产甘草次酸的方法，其中，包括以下步骤将黄曲霉Aspergillus flavus，CGMCC No 5144接入固体PDA斜面培养基中培养，然后从斜面上按1％的接种量接种至含新鲜种子培养基中进行培养；将种子培养基所得菌株按照30％的接种量接种至含新鲜发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，得到含甘草次酸的发酵液；采用膜分离联用工艺从发酵液中分离出甘草次酸粗品，再通过纯化工艺得到高纯甘草次酸。通过本发明最后获得甘草次酸的发酵量达到4.38g/L，产品纯度≥98％、转化率≥90％，达到了工艺规模化水平。
文档编号C12P7/42GK102363796SQ20111035587
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者张桐, 徐莉, 王福清 申请人:中科医药行业生产力促进中心有限公司