专利名称：鸭ⅰ型肝炎病毒lamp检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及鸭I型肝炎病毒检测领域，尤其是一种鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒。
背景技术：
鸭I型肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus type I)是一种针对雏鸭的高度致死性病毒性传染病的病原。该病主要侵害4周龄以内的雏鸭，死亡率高达90%以上，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。鸭I型肝炎病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。目前，虽已建立起鸭I型肝炎病毒PCR检测方法和荧光定量PCR检测方法，其检测敏感性也比较高，但是常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，荧光定量PCR则需要使用更加昂贵的荧光定量PCR仪和试剂等，因而难以适应基层现场检测需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒，以满足基层现场快速检测鸭I型肝炎病
毒的需要。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒，试剂盒含有以下试剂反应液A 含有 IOX 等温反应缓存液、5U/ul AMV、40U/ul inhibitor、Bst DNA 聚合酶8U/ul、IOmM dNTPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物1、20uM的内引物2、20uM的外引物1、 20uM的外引物2、20uM的环引物l、20uM的环引物2、5M甜菜碱、625 μ M钙黄绿素和12. 5mM 氯化锰；10 X等温反应缓存液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM 氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通X-100 ；内引物 1 序列为 CWTGTGGCACAGCTCCAAAGGGGTTTTAGTGTTGTGGGA，内引物 2 序列为 CTTGACAGTGCTGTYAGAAACTGCAACTAATACCTAAACAATCATGG，外引物1 序列为 GTACCATAAACCTGTTTTTCCT，外引物2 序列为 GGTCTTTATATCACCAAATGTCTT，环引物1 序列为 TGTTTTACGTGTACTCCTGGGTA，环引物2 序列为 TAGGCTAAAACTAATCAATTTAC。反应液A每管24yL，其组成为2. 5ul IOX等温反应缓存液、Iul 5U/ul AMV, Iul 40U/ulinhibitor、l. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、 0. 25ul20uM的内引物1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物l、lul 20uM的环引物2、0. 5ul 5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素和 Iul 12. 5mM氯化锰和Iul双蒸水。
本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据鸭I型肝炎病毒共有的基因保守区(见序列表SEQ. ID. No. 1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物，由此发明了用于快速检测鸭I型肝炎病毒的鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒。应用本发明的LAMP检测试剂盒建立鸭I型肝炎病毒检测方法，仅需通过对组织样品进行RNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出鸭I型肝炎病毒。该法无需昂贵的PCR仪只需普通水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而快速， 特别适用于基层现场检测。另外，常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入SYBR Green I或Gene Finder染料来显色，容易造成假阳性一方面，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境造成假阳性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料还会由于引物二聚体而引起假阳性。因此，本发明使用内加钙黄绿素+氯化锰替代了外加的SYBR Green I和Gene Finder 染料，即在配置LAMP反应液时就加入反应液中而无需LAMP反应后再开盖加入；而且，钙黄绿素+氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现绿色，避免了 SYBR Green I和Gene Finder染料带来的假阳性问题，所以具有更好的特异性。
图1是应用本发明鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图。图1中1鸭I型肝炎病毒AV2111株，2鸭I型肝炎病毒DHV/GX/91株，3鸭I型肝炎病毒DHV/GX/11株，4禽流感H9亚型，5鸭细小病毒，6鸭圆环病毒，7鸭副粘病毒，8小鹅瘟病毒，9鸭瘟病毒，10阴性对照。图2是应用本发明鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验结果图。图2中1-8分别为以下不同浓度的鸭I型肝炎病毒RNA Ing/管，IOOpg/管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。图3是PCR方法检测鸭I型肝炎病毒敏感性试验结果图。图3中M为IOObp DNA ladder, 1-8分别为以下不同浓度的鸭I型肝炎病毒RNA Ing/ 管，IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。
具体实施例方式一、鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒的配制反应液A:每管24yL，其组成为2. 5ul IOX等温反应缓存液、Iul 5U/ul AMV, lul40U/ul inhibitor、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、 0. 25ul 20uM的内引物1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物l、lul 20uM的环引物2、0. 5ul 5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素和 Iul 12. 5mM氯化锰和Iul双蒸水。其中，IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1 %曲拉通X-100。内引物 1 序列为 CWTGTGGCACAGCTCCAAAGGGGTTTTAGTGTTGTGGGA (见序列表 SEQ.ID. No. 2)，内引物 2 序列为 CTTGACAGTGCTGTYAGAAACTGCAACTAATACCTAAACAATCATGG (见序列表 SEQ. ID. No. 3)，外引物1 序列为 GTACCATAAACCTGTTTTTCCT (见序列表 SEQ. ID. No. 4)，外引物2 序列为 GGTCTTTATATCACCAAATGTCTT (见序列表 SEQ. ID. No. 5)，环引物1 序列为 TGTTTTACGTGTACTCCTGGGTA(见序列表 SEQ. ID. No. 6)，
环引物 2 序列为 TAGGCTAAAACTAATCAATTTAC(见序列表 SEQ. ID. No. 7)。二、应用本发明鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒检测鸭I型肝炎病毒的方法(以下简称LAMP检测法)1.组织样品中RNA的提取A.取肝组织5g，用碾磨磨碎后加入，反复冻融3次，10000转离心5分钟，收集 IOOul上清液，加入900ul Trizol液后，剧烈混勻，室温放置IOmin ；B.加入200ul氯仿，剧烈混勻，室温放置5min ；C. 12000 X g 离心 15min ；D.收集500ul上清，加入500ul异丙醇，混勻，室温放置IOmin ；E. 12000 Xg 离心 15min，去上清，加入 IOOOul 75% 乙醇，12000 X g 离心 15min，去
上清；F.在超净台内用自然干燥IOmin后加入20ul DEPC H2O溶解，即为待检RAN，_20°C
保持备用。2.鸭I型肝炎病毒LAMP反应以提取的鸭I型肝炎病毒RNA为模板，在装有24 μ L反应液A管中加入1 μ L待检 RNA构成25ul反应体系；LAMP反应程序如下63°C 60min，然后80°C 5min。直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有鸭I型肝炎病毒；如果颜色为桔红色，说明待检样品不含有鸭I型肝炎病毒。三、LAMP检测法的特异性和敏感性试验1.特异性试验分别以鸭I型肝炎病毒AV2111株、鸭I型肝炎病毒DHV/GX/91株、鸭I型肝炎病毒DHV/GX/11株、禽流感H9亚型、鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭副粘病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病的核酸为模板，以健康禽组织提取的RNA为阴性对照，按照前述鸭I型肝炎病毒LAMP反应体系和条件进行反应。结果见图1，对鸭I型肝炎病毒AV2111株、DHV/GX/91株和DHV/GX/11株的检测为阳性结果(显示绿色)，而对禽流感H9亚型、鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭副粘病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒的检测均为阴性(显示桔红色)。2.敏感性试验将鸭I型肝炎病毒RNA按10倍递增稀释成lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、10fg、
lfg、0. Ifgo鸭I型肝炎病毒LAMP检测方法检出限与RT-PCR方法对比鸭I型肝炎病毒LAMP检测方法反应体系和条件前述进行。鸭I型肝炎病毒RT-PCR反应组成如下在50ul的反应体系中含25mM MgCl2
52. 5ul, 10XPCR buffer 5ul, IOmM dNTPs 2ul，Taq 聚合酶(5U)0. 5ul，AMV(5U) 1 μ L， RI (40U) 1 μ L，上游引物 5-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3 和下游引物 5-GGAGGTGGTGCTGAAA-3 各 Iul，鸭I型肝炎病毒RNA模板lul，35ul双蒸水。扩增程序为42V 45分钟，94°C变性2分钟，然后进入94°C变性1分钟，57°C退火1分钟，72°C延伸1分钟的循环，共进行35个循环， 最后再经72°C延伸10分钟。 鸭I型肝炎病毒LAMP检测方法通过肉眼直接观察结果，结果见图2。将RT-PCR 产物在琼脂糖凝胶中进行电泳，然后进行溴化乙锭染色，结果见图3。鸭I型肝炎病毒 LAMP检测方法的检测限为IOfg，而常规RT-PCR的检测限为lpg，可见，LAMP方法敏感性比常规RT-PCR高100倍。
权利要求
1.一种鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂 反应液A 含有IOX等温反应缓存液、5U/ul AMV、40U/ul inhibitor、Bst DNA聚合酶8U/uIUOmM dNTPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物l、20uM的内引物2、20uM的外引物l、20uM 的外引物2、20uM的环引物l、20uM的环引物2、5M甜菜碱、625 μ M钙黄绿素和12. 5mM氯化锰；所述IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、 IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1 %曲拉通X-100 ；所述内引物 1 序列为 CWTGTGGCACAGCTCCAAAGGGGTTTTAGTGTTGTGGGA， 所述内引物 2 序列为 CTTGACAGTGCTGTYAGAAACTGCAACTAATACCTAAACAATCATGG， 所述外引物1序列为GTACCATAAACCTGTTTTTCCT, 所述外引物 2 序列为 GGTCTTTATATCACCAAATGTCTT， 所述环引物 1 序列为 TGTTTTACGTGTACTCCTGGGTA， 所述环引物 2 序列为 TAGGCTAAAACTAATCAATTTAC。
2.根据权利要求1所述的鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于所述反应液A每管24yL，其组成为2. 5ul IOX等温反应缓存液、Iul 5U/ul AMV, Iul 40U/ulinhibitor、l. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3. 5ul IOmM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、 0. 25ul20uM的内引物1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物l、lul 20uM的环引物2、0. 5ul 5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素和 Iul 12. 5mM氯化锰和Iul双蒸水。
全文摘要
本发明公开了一种鸭I型肝炎病毒LAMP检测试剂盒，采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据鸭I型肝炎病毒共有的基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物。应用本发明及其建立的检测方法，解决了现有技术检测时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷。本发明具有特异性强、敏感性高、快速且成本低、操作方法更简单，特别适于基层现场快速检测鸭I型肝炎病毒的需要。
文档编号C12R1/93GK102344973SQ20111035650
公开日2012年2月8日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者刘加波, 庞耀珊, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所