专利名称：一种可视的多个基因突变位点同时检测的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种可视的多个基因突变位点同时检测的方法。
背景技术：
基因突变是由于DNA分子中发生碱基对的插入、缺失或改变，而引起的基因结构的改变。近年来，对癌症病人进行个性化治疗已经成为一种趋势，它是根据癌症患者药物遗传学和药物基因组学特点，采用特异和最佳的化疗药物方案进行治疗的方法。目前，基因突变分析已经使癌症患者个性化治疗成为可能，用基因突变分析可以为医生提供有力的证据和信息，在实施治疗方案时，可选择对患者最有效的药物治疗方案，不仅提高了疗效，还可以降低化疗的毒副作用，同时提高患者的生存质量。另外，人体内一些基因型的存在会增加人类患某种疾病的风险，这种基因就叫疾病易感基因。通过疾病易感基因突变分析，可向人们提供个性化健康指导服务、个性化用药指导服务和个性化体检指导服务。就可以在疾病发生之前的几年、甚至几十年进行准确的预防，而不是盲目的保健；人们可以通过调整膳食营养、改变生活方式、增加体检频度、接受早期诊治等多种方法，有效地规避疾病发生的环境因素。基因突变分析方法常采用电泳分析和固相杂交的方法，如DNA测序、限制酶切片段长度多态性分析、单链DNA构象多态性分析、异源双链核酸分析、等位基因特异性寡聚核苷酸杂交、错配酶切分析、寡聚核苷酸连接分析等，这些方法需要繁琐的分离或洗涤程序， 增加了检测时间。采用均相检测方法可以避免上述问题，目前的均相检测方法均基于荧光偏振或小分子荧光染料之间的荧光共振能量转移，偏振化荧光的强度大大降低，导致了基于荧光偏振的方法灵敏度不高；基于荧光共振能量转移的方法均要对探针分子进行双修饰，导致成本很高。随着个性化医疗时代的到来，操作简单高灵敏多基因突变位点的均相的同时分析不仅能减少检测成本，简化工作流程，而且还能为患者节省时间，让医生快速准确地制定治疗和预防方案。目前一些已知的基因突变位点检测不太灵敏，如PIK3CA基因(NM_006218)的突变位点 E545K、H1047R、E542K、H1047L, BRCAl 基因(NM_007294)的突变位点 185delAG、 5382insC, BRCA2 基因(NM_000059)的突变位点 6174delT ；Kras 基因(NM_004985)的突变位点;34G > A、38G > A.35G > A, BRAF基因(NM_004333)的突变位点V600E，因此研究一种可以检测这些位点的方法可以为医生快速准确地制定治疗和预防方案奠定基础。EM^(为PIK3CA基因所编码蛋白的第542位E突变为K，PIK3CA基因的第16 位核苷酸G突变为A。E545K为PIK3CA基因所编码蛋白的第545位E突变为K，PIK3CA基因的第1633位核苷酸G突变为A。H1047R为PIK3CA基因所编码蛋白的第1047位H突变为R，PIK3CA基因的第3140位核苷酸A突变为G。H1047L为PIK3CA基因所编码蛋白的第
权利要求
1. 一种检测或辅助检测待测DNA中突变位点的方法，包括以下步骤1)以待测DNA为模板进行多重PCR扩增，得到PCR产物，2)用荧光物质标记步骤1)得到的PCR扩增产物，得到标记荧光物质的产物；3)将步骤幻得到标记荧光物质的产物与式(I)的化合物反应，直接目测观察反应产物的颜色确定所述待测DNA中的目标基因的突变位点； 式(I)中，R代表链端含有四级胺的直链或支链的烷基，所述烷基的主链长为2-12个碳，X代表卤素；所述式(I)化合物的数均分子量为5000-100000。 '
2.如权利要求1所述的方法，其特征为步骤1)中，所述多重PCR扩增的引物为能够扩增所述待测DNA中的目标基因的所有突变位点的引物组；所述引物组由若干个能扩增所述待测DNA中的目标基因的突变位点的引物对组成；步骤2、中，所述用荧光物质标记步骤1)得到的PCR扩增产物包括如下步骤 向步骤1)得到的PCR扩增产物中加入突变型特异性引物和与所述突变型特异性引物对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP，进行单碱基延伸反应，得到标记荧光物质的产物；所述突变型特异性引物与所述突变位点相邻20-2^p的序列互补，且所述突变型特异性引物的3'末端核苷酸与所述突变位点的突变型核苷酸互补；所述突变型特异性引物对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP与所述突变位点相邻的碱基互补；所述突变位点相邻的碱基为位于所述突变型特异性引物延伸方向下游的一个碱基；每一条所述突变型特异性引物及其对应的所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP对应一个突变位点；所述突变型特异引物的条数和所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP的个数均与所述目标基因中的突变位点的个数相同；每一个所述荧光物质标记的dNTP或ddNTP的荧光物质的荧光颜色不同； 步骤幻中，所述将步骤幻得到标记荧光物质的产物与上述式(I)的化合物反应包括如下步骤将步骤幻得到标记荧光物质的产物与上述式(I)的化合物混勻，得到反应产物；所述观察反应产物的颜色确定所述待测DNA中的目标基因的突变位点为 若反应产物的颜色与荧光物质标记的dNTP或ddNTP的荧光物质颜色相同，则所述待测 DNA的目标基因含有或候选含有与所述dNTP或ddNTP互补的碱基相邻的突变位点；若反应产物的颜色与荧光物质标记的dNTP或ddNTP的荧光物质颜色不同，则所述待测DNA的目标基因不含有或候选不含有与所述dNTP或ddNTP互补的碱基相邻的突变位点； 所述荧光物质具体为荧光素、德克萨斯红或Cy3。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征为 步骤1)中，所述引物组为如下的任一一种1)所示的引物组由引物对A和引物对B组成；2)所示的引物组由引物对C、引物对D和引物对E组成；3)所示的引物组由引物对F和引物对G组成； 所述引物对A由引物1和引物2组成，所述引物对B由引物3和引物4组成， 所述引物对C由引物5和引物6组成， 所述引物对D由引物7和引物8组成， 所述引物对E由引物9和引物10组成， 所述引物对F由引物11和引物12组成， 所述引物对G由引物13和引物14组成， 所述引物1-14的核苷酸序列依次为序列表中的1-14 ；步骤2、中，所述突变型特异性引物及其对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP和对应的突变位点分别为如下1)-3)中任一一种1)、所述突变型特异性引物由引物组H和引物组I组成；所述引物组H由引物15和引物16组成；所述引物组I由引物17和引物18组成； 所述引物15对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为德克萨斯红标记的dATP，其对应的突变位点为E545K ；所述引物16对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为荧光素标记的dUTP，其对应的突变位点为H1047R ；所述引物17对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为德克萨斯红标记的dATP，其对应的突变位点为EMI；所述引物18对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为荧光素标记的dUTP，其对应的突变位点为H1047L ；2)所述突变型特异性引物为所述引物组J，所述引物组J由引物19-21组成；所述引物19对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为荧光素标记的ddUTP，其对应的突变位点为185delAG ；所述引物20对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为德克萨斯红标记的ddATP，其对应的突变位点为5382insC ；所述引物21对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为Cy3标记的ddGTP，其对应的突变位点为6174delT ；3)所述突变型特异性引物为所述引物组K和/或所述引物组L，所述引物组K由引物 22和引物23组成；所述引物组L由引物M和引物25组成；所述引物22对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为德克萨斯红标记的dATP，其对应的突变位点为34G > A ；所述引物23对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为荧光素标记的dCTP，其对应的突变位点为38G > A ；所述引物M对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为荧光素标记的dUTP，其对应的突变位点为35G > A ；所述引物25对应的荧光物质标记的dNTP或ddNTP为德克萨斯红标记的dATP，其对应的突变位点为V600E ；所述引物15-25的核苷酸序列为序列表中的序列15-25 ；步骤3)中，所述反应为混勻；所述观察反应产物的颜色是在紫外灯下进行。
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征为 步骤1)所述多重PCR扩增的退火温度均为60°C ； 步骤幻中，所述单碱基延伸反应的退火温度均为60°C ；在步骤1)和步骤2~)之间，还包括如下步骤将步骤1)得到的PCR扩增产物进行核酸外切酶I和磷酸水解酶消化，得到消化产物；在步骤幻和步骤幻之间，还包括如下步骤将步骤幻得到标记荧光物质的产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物。
5.如权利要求1-4中任一所述的方法，其特征为所述待测DNA是癌细胞、癌组织、正常细胞或正常组织的基因组DNA ； 所述癌为结肠癌或乳腺癌。
6.一种检测待测DNA中突变位点的引物，由引物组a、b、c组成；所述引物组a由权利要求3-5中任一所述方法中的所述1)所示的引物组、所述引物组 H和所述引物组I组成；所述引物组b由权利要求3-5中任一所述方法中的所述2、所示的引物组和所述引物组J;所述引物组c由权利要求3-5中任一所述方法中的所述幻所示的引物组、所述引物组 K和所述引物组L组成；所述引物组a、b、c为独立包装。
7.根据权利要求6所述的引物，其特征在于所述待测DNA是癌细胞、癌组织、正常细胞或正常组织的基因组DNA ； 所述癌为结肠癌或乳腺癌。
8.一种检测待测DNA中突变位点的反应试剂，由试剂al-cl和试剂a2_c2组成， 所述试剂al由所述1)所示的引物组、DNA聚合酶、dNTPs和PCR扩增缓冲液组成； 所述试剂bl由所述2、所示的引物组、DNA聚合酶、dNTPs和PCR扩增缓冲液组成； 所述试剂cl由所述幻所示的引物组、DNA聚合酶、dNTPs和PCR扩增缓冲液组成； 所述1)- 所示的引物组中的各条引物在所述试剂al-cl中的终浓度均为200nM ； 所述试剂a2由所述引物组H、荧光素标记的dUTP、德克萨斯红标记的dATP、DNA聚合酶和反应缓冲液组成或由所述引物组I、荧光素标记的dUTP、德克萨斯红标记的dATP、DNA聚合酶和反应缓冲液组成；所述引物组H或所述引物组I中的各条引物在所述试剂a2中的终浓度均为1 μ M ； 所述试剂1^2由所述引物组J、荧光素标记的ddUTP、德克萨斯红标记的ddATP和Cy3标记的ddGTP和反应缓冲液组成；所述引物组J中的各条引物在所述试剂1^2中的终浓度均为1 μ M ；所述试剂c2由所述引物组K、荧光素标记的dUTP、德克萨斯红标记的dATP和反应缓冲液组成或由所述引物组L、荧光素标记的dCTP、德克萨斯红标记的dATP和反应缓冲液组成；所述引物组K或所述引物组L中的各条引物在所述试剂c2中的终浓度均为1 μ M ； 所述待测DNA是癌细胞、癌组织、正常细胞或正常组织的基因组DNA ； 所述癌为结肠癌或乳腺癌。
9.一种检测待测DNA中突变位点的试剂盒，由试剂盒1-3组成； 所述试剂盒1包括所述试剂al和所述试剂a2 ；所述试剂盒2包括所述试剂bl和所述试剂1^2 ； 所述试剂盒3包括所述试剂cl和所述试剂c2 ； 所述试剂盒中的各物质均为独立包装。
10.根据权利要求9所述的试剂，其特征在于所述待测DNA是癌细胞、癌组织、正常细胞或正常组织的基因组DNA ； 所述癌为结肠癌或乳腺癌。
全文摘要
本发明公开了一种可视的多个基因突变位点同时检测的方法。本发明提供了一种检测或辅助检测待测DNA中突变位点的方法，包括以下步骤1)以待测DNA为模板进行多重PCR扩增，得到PCR产物，2)用荧光物质标记步骤1)得到的PCR扩增产物，得到标记荧光物质的产物；3)将步骤2)得到标记荧光物质的产物与上述式(I)的化合物反应，观察反应产物的颜色确定所述待测DNA中的目标基因的突变位点；本发明的实验证明，本发明利用少量DNA就能够检测到多个基因的多个位点的突变情况，对于癌症的用药指导和早期诊断具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK102382892SQ20111036999
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者宋金召, 杨琼, 王树 申请人:中国科学院化学研究所