专利名称：一种可快速解离型三维细胞培养载体及制备方法
一种可快速解离型三维细胞培养载体及制备方法技术领域
本发明属于体外细胞培养技术领域，特别是一种可快速解离型三维细胞培养载体及制备方法。
背景技术：
细胞培养是许多生物工程技术中必不可少的基本过程。目前，细胞培养主要采用基于聚苯乙烯培养板的单层培养，细胞在二维平面内生长。这种技术在整个生物工程技术发展中曾经和正在发挥着巨大的作用。然而，在许多生命科学基础研究中，人们越来越多地发现单层培养技术获得的研究结果与体内真实情况不一致。其主要原因是，与体内细胞所处的三维微环境相比，二维细胞培养方式培养的细胞在性状等方面发生了明显改变，影响了人们对体内细胞行为和功能的正确理解。近年来，伴随组织工程技术而兴起的三维细胞培养技术得到了快速发展，成为弥合二维单层细胞培养和动物/体内实验结果间差异的桥MTTC。
三维细胞培养技术的不断进步不仅极大地推动了组织工程技术的快速发展，而且在细胞/分子生物学、肿瘤发生发展模型、药物筛选、临床药效评价与预测等领域引起科学工作者的极大兴趣，发挥着越来越大的作用[Abbott A. Nature，2003，424 :870]。尤其是在三维肿瘤模型建立方面，更是如此。与二维单层培养相比，三维细胞培养模型在模拟体内细胞生长环境和细胞/环境间相互作用方面优势明显，其培养的细胞在细胞表型、生长行为、 能量代谢等方面更接近体内真实细胞，更具生理学意义。其原因是，二维模型过于简单化， 忽略了细胞-细胞间、细胞外基质-细胞间和整个微环境信号转导等的影响[Fischkich C， Chen R, Matsumoto T,et al. Nat Methods,2007,4 :855]。
三维细胞培养是指将细胞种植于模拟细胞外基质微环境的三维多孔载体材料中， 经共培养实现细胞分化、增殖和生长，形成细胞-载体复合体。在三维细胞培养技术中，多孔载体的理化性质和多孔结构特性至关重要，它们决定着载体内细胞生长、增殖、迁移和生长等过程[Burdett E, Kasper FK, Mikos AG, et al. Tissue Eng =Part B，2010，16 :351]。 传统上，三维细胞培养模型主要有生物凝胶包埋、多细胞球、多层细胞和器官型培养等，它们均在一定程度上体现了体内三维微环境的异质性。其中，不使用三维生物材料的三维模型存在多细胞球直径小、成熟时间长、细胞死亡等问题[Ong S M，Zhao Z Q，Arooz T， et al. Biomaterials, 2010, 31 :1180]。目前，三维培养体系常用材料为生物凝胶，如胶原和Matrigel等，其优点是具有细胞外基质的部分生物学性质，但存在批次差异性大、加工性能和强度差、致病风险等问题，致使研究重现性不够理想。为此，人们正在积极寻找生物凝胶的替代物，这方面的研究主要集中于生物高分子材料，如藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸和聚己内酯等，它们在分子设计灵活性、修饰改性方面表现优异，由其制成的三维多孔载体在空间结构、生物学性质、理化性质和力学性质等方面易调控。
然而，在越来越多的情况下，需要在三维共培养结束时需要将细胞与载体材料分离，便于深入研究载体三维多孔结构和理化性质、培养期间对细胞的人为干预因素对细胞生长行为、基因和蛋白表达情况的影响。如肿瘤学家在利用三维模型研究肿瘤细胞生长微环境与肿瘤表型和定量蛋白表达时，就需要在三维共培养结束时将细胞与载体材料分开， 才能进行蛋白质组学等的研究。然而，目前常用的多孔载体材料降解速度慢，难以满足三维培养结束时细胞和载体材料快速有效分离的实际应用要求。因此，开发能响应各种刺激因素而实现解离的智能型多孔载体材料就成为当务之急。如采用对温度敏感的可逆胶凝体系——聚己内酯-聚(聚乙二醇乙醚甲基丙烯酸酯)微粒，可在细胞培养后实现细胞与材料的有效分离[Ghanami RCA, Saunders B R, Bosquillon C, et al. Soft Matter, 2010, 6，5037]。在天津大学申请的中国发明专利(尹玉姬，等.壳聚糖修饰的海藻酸盐水凝胶三维多孔载体及其制备方法.申请号201010116334.7)中，发明人利用含二硫键的二元胺为交联剂制成了海藻酸盐水凝胶，具有响应还原剂而解离的能力，但这种水凝胶力学性能不够理想，需要壳聚糖强化处理。
此外，动物模型作为最高级三维模型，存在伦理争议、昂贵、不可预知因素、时间限制等不足，尤其是难以单独研究控制细胞行为和功能的各种信号转导通路。而基于多孔载体材料的三维细胞培养模型可有效克服上述问题，将逐渐成为动物模型的替代模型。发明内容
针对现有技术存在的上述不足和生物医学领域新的应用需求，本发明的目的在于提供一种适于三维细胞培养和培养结束后细胞-载体材料快速有效分离的可快速解离型三维细胞培养载体及制备方法。
为达到上述目的，本发明可快速解离型三维细胞培养载体，以壳聚糖衍生物—— 羧甲基壳聚糖为原料，溶解于pH = 5 8的缓冲液后，加入碳二亚胺活化的交联剂二硫代二元酸酯，经酰胺化反应形成水凝胶，再经冷冻干燥得到。
所述的用于羧甲基壳聚糖交联的交联剂二硫代二元酸酯中的二硫键在相应还原剂作用下快速断裂，使多孔载体在水相中解离而溶解为溶液。
所述的二硫键还原剂为谷胱甘肽、2-巯基乙胺、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦。
本发明可快速解离型三维细胞培养载体的制备方法包括以下步骤
1)壳聚糖羧甲基化改性将壳聚糖分散于质量分数为60%氢氧化钠水溶液和异丙醇混合物中，于60°C搅拌回流1小时后加入壳聚糖质量0. 5 2. 5倍的氯乙酸，继续反应 4小时，反应体系经无乙醇沉淀、乙醇-水混合物洗涤后在50°C真空干燥得黄色粉状产物， 即为羧甲基壳聚糖；
其中壳聚糖氢氧化钠水溶液异丙醇的质量比为1:4:8;
将羧甲基壳聚糖溶于0. 02mol/L 0. lmol/L、pH = 5 8的磷酸盐缓冲液或 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中制成质量百分比浓度为2% 5%的羧甲基壳聚糖溶液；
2)交联剂活化将交联剂二硫代二元酸溶于无水有机溶剂中制成质量浓度为 5% 15%的交联剂溶液，再向其中依次加入碳二亚胺型活化剂N，N’ - 二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应30 60分钟，得到活化的交联剂二硫代二元酸酯；
其二硫代二元酸N，N’ - 二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺的功能基团摩尔比为 1 1. 5 1. 5 ；
3)化学交联在室温搅拌条件下，将活化的交联剂二硫代二元酸酯在20分钟内滴加入羧甲基壳聚糖溶液中搅拌均勻后转移至M孔培养板中，室温反应M 36小时形成水凝胶，然后将其在蒸馏水中浸泡M小时，每4小时置换一次蒸馏水；
其中活化的交联剂中的羧基与羧甲基壳聚糖中氨基间的摩尔比为2% 10% ；
4)冷冻干燥将步骤3)中得到的水凝胶在零下40°C冷冻干燥3天，得到壳聚糖基水凝胶即三维细胞培养载体。
所述的步骤1)乙醇-水混合物中乙醇水的体积比为4:1。
所述的壳聚糖为脱乙酰度为55% 95%、分子量为10 50万。
所述的交联剂二硫代二元酸为2，2’ - 二硫代二乙酸、3，3’ - 二硫代二丙酸或4， 4’ - 二硫代二丁酸。
所述的无水有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
本发明采用生物相容性优异、广泛应用的天然高分子材料壳聚糖为原料，经羧甲基化改性后，与碳二亚胺活化的交联剂二硫代二元酸发生化学交联反应，制备出壳聚糖基水凝胶，再经冷冻干燥后获得三维多孔载体。该载体具有良好的力学性能和细胞相容性以及特异性的快速解离行为，与细胞体外共培养后形成细胞/载体材料复合物，此时可通过向培养体系加入一定浓度的还原剂使交联桥中的二硫键断裂，致使多孔载体快速解离成为水溶性羧甲基壳聚糖而溶解于细胞培养液中，细胞经离心过程从培养体系中分离出来，用于后续细胞功能和行为的研究。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。所用原料和试剂均为市售商品。
实施例1
1)壳聚糖羧甲基化改性将壳聚糖分散于质量分数为60%氢氧化钠水溶液和异丙醇混合物中，于60°C搅拌回流1小时后加入壳聚糖质量2倍的氯乙酸，继续反应4小时， 反应体系经无乙醇沉淀、乙醇水的体积比为4 1的乙醇溶液洗涤后在50°C真空干燥得黄色粉状产物，即为羧甲基壳聚糖；
其中壳聚糖为脱乙酰度为55% 95%、分子量为10 50万；壳聚糖氢氧化钠水溶液异丙醇的质量比为1:4:8;
将羧甲基壳聚糖溶于0. 05mol/L、pH = 6. 5的2_(N_吗啉代)乙磺酸缓冲液中制成质量百分比浓度为2%的羧甲基壳聚糖溶液；
2)交联剂活化将交联剂3，3’ - 二硫代二丙酸溶于无水乙醇中制成质量浓度为 5%的交联剂溶液，再向其中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与 N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应30 60分钟，得到活化的交联剂3，3’ - 二硫代二元酸酯；
其交联剂3，3’ - 二硫代二丙酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐N-羟基琥珀酰亚胺的功能基团摩尔比为1 1.5 1.5；
3)化学交联在室温搅拌条件下，将活化的交联剂3，3’_ 二硫代二元酸酯在20分钟内滴加入羧甲基壳聚糖溶液中搅拌均勻后转移至M孔培养板中，室温反应M 36小时形成水凝胶，然后将其在蒸馏水中浸泡M小时，每4小时置换一次蒸馏水；
其中活化的交联剂中的羧基与羧甲基壳聚糖中氨基间的摩尔比为2% ；
4)冷冻干燥将步骤幻中得到的水凝胶在零下40°C冷冻干燥3天，得到壳聚糖基水凝胶即三维细胞培养载体。
实施例2
1)壳聚糖羧甲基化改性将壳聚糖分散于质量分数为60%氢氧化钠水溶液和异丙醇混合物中，于60°C搅拌回流1小时后加入壳聚糖质量1倍的氯乙酸，继续反应4小时， 反应体系经无乙醇沉淀、乙醇水的体积比为4 1的乙醇溶液洗涤后在50°C真空干燥得黄色粉状产物，即为羧甲基壳聚糖；
其中壳聚糖为脱乙酰度为55% 95%、分子量为10 50万；壳聚糖氢氧化钠水溶液异丙醇的质量比为1:4:8;
将羧甲基壳聚糖溶于0. lmol/L、pH=7.4的磷酸盐缓冲液中制成质量百分比浓度为4%的羧甲基壳聚糖溶液；
2)交联剂活化将交联剂2，2’_ 二硫代二乙酸溶于无水二甲基亚砜中制成质量浓度为12%的交联剂溶液，再向其中依次加入N，N’ - 二环己基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应30 60分钟，得到活化的交联剂2，2’ - 二硫代二元酸酯；
其交联剂2，2’-二硫代二乙酸N，N’_ 二环己基碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺的功能基团摩尔比为1 1.5 1.5;
3)化学交联在室温搅拌条件下，将活化的交联剂2，2’_ 二硫代二元酸酯在20分钟内滴加入羧甲基壳聚糖溶液中搅拌均勻后转移至M孔培养板中，室温反应M 36小时形成水凝胶，然后将其在蒸馏水中浸泡M小时，每4小时置换一次蒸馏水；
其中活化的交联剂中的羧基与羧甲基壳聚糖中氨基间的摩尔比为5% ；
4)冷冻干燥将步骤3)中得到的水凝胶在零下40°C冷冻干燥3天，得到壳聚糖基水凝胶即三维细胞培养载体。
实施例3
1)壳聚糖羧甲基化改性将壳聚糖分散于质量分数为60%氢氧化钠水溶液和异丙醇混合物中，于60°C搅拌回流1小时后加入壳聚糖质量0. 5倍的氯乙酸，继续反应4小时，反应体系经无乙醇沉淀、乙醇水的体积比为4 1的乙醇溶液洗涤后在50°C真空干燥得黄色粉状产物，即为羧甲基壳聚糖；
其中壳聚糖为脱乙酰度为55% 95%、分子量为10 50万；壳聚糖氢氧化钠水溶液异丙醇的质量比为1:4:8;
将羧甲基壳聚糖溶于0. 03mol/L、pH = 8的磷酸盐缓冲液中制成质量百分比浓度为3%的羧甲基壳聚糖溶液；
2)交联剂活化将交联剂4，4’ - 二硫代二丁酸溶于无水甲醇中制成质量浓度为 8%的交联剂溶液，再向其中依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与 N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应30 60分钟，得到活化的交联剂4，4’ - 二硫代二元酸酯；
其交联剂4，4’ - 二硫代二丁酸1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐N-羟基硫代琥珀酰亚胺的功能基团摩尔比为1 1.5 1.5；
3)化学交联在室温搅拌条件下，将活化的交联剂4，4’_ 二硫代二元酸酯在20分钟内滴加入羧甲基壳聚糖溶液中搅拌均勻后转移至M孔培养板中，室温反应M 36小时形成水凝胶，然后将其在蒸馏水中浸泡M小时，每4小时置换一次蒸馏水；
其中活化的交联剂中的羧基与羧甲基壳聚糖中氨基间的摩尔比为8% ；
4)冷冻干燥将步骤幻中得到的水凝胶在零下40°C冷冻干燥3天，得到壳聚糖基水凝胶即三维细胞培养载体。
实施例4
1)壳聚糖羧甲基化改性将壳聚糖分散于质量分数为60%氢氧化钠水溶液和异丙醇混合物中，于60°C搅拌回流1小时后加入壳聚糖质量2. 5倍的氯乙酸，继续反应4小时，反应体系经无乙醇沉淀、乙醇水的体积比为4 1的乙醇溶液洗涤后在50°C真空干燥得黄色粉状产物，即为羧甲基壳聚糖；
其中壳聚糖为脱乙酰度为55% 95%、分子量为10 50万；壳聚糖氢氧化钠水溶液异丙醇的质量比为1:4:8;
将羧甲基壳聚糖溶于0. 02mol/L、pH = 5的2_(N_吗啉代)乙磺酸缓冲液中制成质量百分比浓度为5%的羧甲基壳聚糖溶液；
2)交联剂活化将交联剂3，3’_ 二硫代二丙酸溶于无水二甲基甲酰胺中制成质量浓度为15%的交联剂溶液，再向其中依次加入N，N’ - 二环己基碳二亚胺与N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应30 60分钟，得到活化的交联剂3，3’ - 二硫代二元酸酯；
其交联剂3，3’-二硫代二丙酸N，N’_ 二环己基碳二亚胺N-羟基硫代琥珀酰亚胺的功能基团摩尔比为1 1.5 1.5;
3)化学交联在室温搅拌条件下，将活化的交联剂3，3’_ 二硫代二元酸酯在20分钟内滴加入羧甲基壳聚糖溶液中搅拌均勻后转移至M孔培养板中，室温反应M 36小时形成水凝胶，然后将其在蒸馏水中浸泡M小时，每4小时置换一次蒸馏水；
其中活化的交联剂中的羧基与羧甲基壳聚糖中氨基间的摩尔比为10% ；
4)冷冻干燥将步骤幻中得到的水凝胶在零下40°C冷冻干燥3天，得到壳聚糖基水凝胶即三维细胞培养载体。
本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果
(1)以壳聚糖衍生物——羧甲基壳聚糖为原料，利用冷冻干燥法制备多孔载体，既保证了载体生物相容性和多孔性，又具有良好的力学性能和降解性能。
(2)采用条件温和的化学交联方法，即以二硫键二元酸作为交联剂，经碳二亚胺活化后实现水溶性羧甲基壳聚糖交联，制备的水凝胶载体可特异性响应谷胱甘肽等还原剂而快速解离，并溶解于培养液中。
(3)本发明的化学交联过程、多孔载体还原解离与溶解均是在中性或接近中性条件下进行的，与细胞培养液的PH范围一致，不会对细胞造成不利影响。
(4)作为载体原料的羧甲基壳聚糖，其中含有的羧基可用于直接修饰生物因子或蛋白质以提高生物学性能，也可作为仿生矿化的诱导活性点，适用于多种三维细胞培养和组织工程技术。
(5)本发明中虽然用到了有机溶剂，但它们均是与水混溶的溶剂，在多孔载体制备过程中均已除去，不会残留于最终的多孔载体中，不对细胞生长造成任何有害影响。
权利要求
1.一种可快速解离型三维细胞培养载体，其特征在于以壳聚糖衍生物——羧甲基壳聚糖为原料，溶解于PH = 5 8的缓冲液后，加入碳二亚胺活化的交联剂二硫代二元酸酯， 经酰胺化反应形成水凝胶，再经冷冻干燥得到。
2.根据权利要求1所述的可快速解离型三维细胞培养载体，其特征在于所述的用于羧甲基壳聚糖交联的交联剂二硫代二元酸酯中的二硫键在相应还原剂作用下快速断裂，使多孔载体在水相中解离而溶解为溶液。
3.根据权利要求要求2所述的可快速解离型三维细胞培养载体的制备方法，其特征在于所述的二硫键还原剂为谷胱甘肽、2-巯基乙胺、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦。
4.一种可快速解离型三维细胞培养载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)壳聚糖羧甲基化改性将壳聚糖分散于质量分数为60%氢氧化钠水溶液和异丙醇混合物中，于60°C搅拌回流1小时后加入壳聚糖质量0. 5 2. 5倍的氯乙酸，继续反应4小时，反应体系经无乙醇沉淀、乙醇-水混合物洗涤后在50°C真空干燥得黄色粉状产物，即为羧甲基壳聚糖；其中壳聚糖氢氧化钠水溶液异丙醇的质量比为1:4:8;将羧甲基壳聚糖溶于0. 02mol/L 0. lmol/L、pH = 5 8的磷酸盐缓冲液或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中制成质量百分比浓度为2% 5%的羧甲基壳聚糖溶液；2)交联剂活化将交联剂二硫代二元酸溶于无水有机溶剂中制成质量浓度为5% 15%的交联剂溶液，再向其中依次加入碳二亚胺型活化剂N，N’ - 二环己基碳二亚胺或 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温反应30 60分钟，得到活化的交联剂二硫代二元酸酯；其二硫代二元酸N，N’ - 二环己基碳二亚胺或1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺的功能基团摩尔比为 1 1. 5 1. 5 ；3)化学交联在室温搅拌条件下，将活化的交联剂二硫代二元酸酯在20分钟内滴加入羧甲基壳聚糖溶液中搅拌均勻后转移至M孔培养板中，室温反应M 36小时形成水凝胶，然后将其在蒸馏水中浸泡M小时，每4小时置换一次蒸馏水；其中活化的交联剂中的羧基与羧甲基壳聚糖中氨基间的摩尔比为2% 10% ；4)冷冻干燥将步骤幻中得到的水凝胶在零下40°C冷冻干燥3天，得到壳聚糖基水凝胶即三维细胞培养载体。
5.根据权利要求要求4所述的可快速解离型三维细胞培养载体的制备方法，其特征在于所述的步骤1)乙醇-水混合物中乙醇水的体积比为4:1。
6.根据权利要求要求4所述的可快速解离型三维细胞培养载体的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖为脱乙酰度为 95%、分子量为10 50万。
7.根据权利要求要求4所述的可快速解离型三维细胞培养载体的制备方法，其特征在于所述的交联剂二硫代二元酸为2，2’ - 二硫代二乙酸、3，3’ - 二硫代二丙酸或4，4’ - 二硫代二丁酸。
8.根据权利要求要求4所述的可快速解离型三维细胞培养载体的制备方法，其特征在于所述的无水有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
全文摘要
一种可快速解离型三维细胞培养载体及制备方法。是以羧甲基改性的壳聚糖为原料，将其溶解于pH＝5～8的磷酸盐或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，然后加入碳二亚胺活化的二硫代二元酸交联剂，通过羧甲基壳聚糖中氨基与交联剂中羧基间的酰胺化反应形成三维化学交联的水凝胶，最后通过冷冻干燥得到三维多孔载体。该载体材料中的二硫键可被其还原剂迅速还原断裂，实现多孔载体快速解离而溶解，能满足多种体外三维细胞培养和培养结束后需要细胞-载体材料有效分离的特殊需求。本发明的壳聚糖基水凝胶三维细胞培养载体具有原料易得、工艺简单、易生物活性改性，以及载体理化性质、力学性能和降解速率可控等优点，在各种三维细胞培养中具有良好的应用前景。
文档编号C12M3/00GK102517211SQ20111040695
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者徐明辉, 金欣霞, 钱军民, 锁爱莉 申请人:西安交通大学