专利名称：一种定量测定rna和dna浓度及其比值的方法
技术领域：
本发明是一种用于定量测定微生物、动植物组织和活体细胞中RNA浓度和DNA浓度及其比值的新方法，特别是使用荧光染料GelRed测定RNA浓度和DNA浓度及其比值的方法。该方法可用于环境生物样品的分析测定。
背景技术：
对生物样品微量双链DNA进行定量在各种生物学研究中非常重要，如核酸提取过程中的DNA和RNA定量、逆转录过程中RNA和cDNA浓度控制、建立cDNA文库过程中RNA浓度和质量控制、用于判断生物营养健康状态的RNA和DNA比值以及药物研发过程中对植物组织样品中DNA定量等。目前，测定生物组织DNA浓度和RNA浓度的方法主要采用光吸收法(紫外分光光度法)和染料法(荧光染料)。其中，紫外分光光度法快速便捷，对仪器没有特殊要求并且对环境无污染，使用较广。如最常用的检测核酸浓度的方法就是检测核酸在260nm(A26CI)处的光吸收。但这种方法缺点在于单链核苷酸和单核苷酸会对吸光度产生干扰信号，并且核酸样品中的蛋白等杂质也会影响光吸收。另外，光吸收不能区分DNA和RNA，灵敏度也相对较低(用Icm的比色杯在A26tl值为0. 1时对应的双链DNA浓度为5 μ g/ml)。这在一定程度上限制了该方法在高灵敏度样品测试中的应用。染料法即利用某些荧光染料与DNA或RNA结合后发出的荧光强度来分析样品中的 DNA浓度和RNA浓度水平。溴化乙啶(EB)是目前使用最广泛的核酸凝胶染色试剂，能够在多数应用中提供可以接受的灵敏度(纳克级)，但它是一种高诱变性的化学物质，对分析测试人员和环境具有致突变的毒害作用。并且EB染色后具有较高的背景荧光信号，对准确定量样品中DNA浓度具有不利影响。而STOR Green I染料虽然也具有较高的灵敏性，但这种染料在分析测试过程中的稳定性较差，导致与DNA或RNA结合稳定而影响分析结果。而近年在市场上新出现的染料如Hoechst染料和PicoGreen染料，虽然也具有非常高的灵敏度， 但价格昂贵，造成分析测试的高成本，为一般实验室难以承受。因此，需要开发一种对环境无污染且简便、高效、灵敏检测生物样品中RNA浓度与DNA浓度及其比值的新方法。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的不足而提供的一种定量测定RNA浓度和DNA浓度及其比值的方法，能够灵敏、快速地同时测定生物组织或细胞中RNA浓度和DNA浓度及其比值。为实现本发明目的而提供的一种定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，包括以下步骤a)配制DNA标准溶液、RNA标准溶液、GelRed染料溶液，并制备待测样品溶液；b)将获得的DNA标准溶液、RNA标准溶液和待测样品溶液分别与GelRed染料溶液混合；
c)将与GelRed染料溶液混合后的DNA标准溶液、RNA标准溶液、待测样品溶液分别加入酶标板中；d)分别测定所述酶标板中DNA标准溶液、RNA标准溶液和待测样品溶液的荧光值；e)根据所述DNA标准溶液、RNA标准溶液的荧光值制作荧光值-浓度的标准曲线， 所建标准曲线的线性回归方程为y = ax+b，确定a，b值；f)根据标准曲线计算所述待测样品DNA浓度和RNA浓度。本发明还提供了一种灵敏、快速地测定生物组织或细胞中RNA和DNA比值的方法， 所述方法包括(1)采用本发明所述的方法测定RNA的浓度和DNA的浓度；(2)确定RNA的浓度和DNA的浓度之间的比值。本发明测定生物组织与细胞中RNA浓度和DNA浓度及其比值的方法，充分利用 GelRed染料能够与dSDNA、SSDNA或RNA结合，同时高灵敏度、低毒性并且稳定性的特性，简便、高效、灵敏地检测生物样品RNA与DNA比值。与其它方法相比，该方法废弃物可直接倒入下水道而不会造成环境污染，并且对实验操作人没有任何毒害作用；染料用量少，简单经济；方法灵敏度高，可以检测生物样品中ng级的RNA和DNA，对样品的需要量少，从而大大降低了分析成本并提高了分析效率。本发明的方法为生物学相关研究提供了重要的分析技术，在生物、环境等领域研究具有广泛的应用前景。本发明的分析方法还可以用于分析环境生物体内RNA和DNA比值判断生物体健康状况和营养条件以及环境污染对生态可能造成的影响。下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为测定样品DNA的标准曲线。图2为测定样品RNA的标准曲线。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式
详述本发明定量测定RNA浓度和DNA浓度及其比值的方法。应当理解，此处所描述的具体实施方式
仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。作为一种可实施方式，本发明实施例提供的一种定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，包括以下步骤a)配制DNA标准溶液、RNA标准溶液、GelRed染料溶液，并制备待测样品溶液；b)将步骤a)中获得的DNA标准溶液、RNA标准溶液、待测样品溶液分别与GelRed 染料溶液混合；c)将与GelRed染料溶液混合后的DNA标准溶液、RNA标准溶液、待测样品溶液分别加入酶标板中；d)分别测定酶标板中DNA标准溶液、RNA标准溶液和待测样品溶液的荧光值；e)根据DNA标准溶液、RNA标准溶液的荧光值制作荧光值-浓度的标准曲线，所建标准曲线的线性回归方程为y = ax+b，确定a，b值；f)根据标准曲线计算所述待测样品DNA浓度和RNA浓度。较佳地，作为一种可实施方式，其中所述的DNA标准溶液是使用0. 的STEB稀释 DNA标准品至适当浓度，所述的RNA标准溶液是使用0. 1 %的STEB稀释RNA标准品至适当浓度。较佳地，作为一种可实施方式，其中所述的待测样品是使用0. 的STEB缓冲液稀释样品至适当浓度。较佳地，作为一种可实施方式，其中当所述的待测样品溶液的荧光值处于所述的标准溶液的荧光值范围之外时，进一步稀释所述待测样品溶液使其荧光值在所述标准溶液的荧光值范围内。较佳地，作为一种可实施方式，其中所述的GelRed染料溶液使用0. 1% STEB缓冲液稀释GelRed染料5000倍得到的。较佳地，作为一种可实施方式，其中测定所述溶液荧光值时所使用的波长激发光的波长为250-270nm ；发射光的波长为570_600nm。较佳地，作为一种可实施方式，其中所述的激发光波长为260nm ；发射光的波长为 590nmo较佳地，作为一种可实施方式，其中所述的与GelRed染料溶液的混合包括吸取预设体积的样品或DNA标准溶液或RNA标准溶液和等体积GelRed染料溶液至离心管中，充分混勻。较佳地，作为一种可实施方式，其中所述的酶标板是黑色不透光，96孔不可拆或可拆酶标板。较佳地，作为一种可实施方式，其中所述的待测样品溶液或DNA标准溶液或RNA标准溶液和GelRed染料溶液混合后加入酶标板中的加样方法为
权利要求
1.一种定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)配制DNA标准溶液、RNA标准溶液、GelRed染料溶液，并制备待测样品溶液；b)将步骤a)中获得的DNA标准溶液、RNA标准溶液、待测样品溶液分别与GelRed染料溶液混合；c)将与GelRed染料溶液混合后的DNA标准溶液、RNA标准溶液、待测样品溶液分别加入酶标板中；d)分别测定所述酶标板中DNA标准溶液、RNA标准溶液和待测样品溶液的荧光值；e)根据所述DNA标准溶液、RNA标准溶液的荧光值制作荧光值-浓度标准曲线，所建标准曲线的线性回归方程为y = ax+b，确定a，b值；f)根据标准曲线计算所述待测样品的DNA浓度和RNA浓度。
2.根据权利要求1所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述的 DNA标准溶液是使用0. 1 %的STEB稀释DNA标准品至适当浓度，所述的RNA标准溶液是使用0. 1 %的STEB稀释RNA标准品至适当浓度。
3.根据权利要求1所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述的待测样品溶液是使用0. 的STEB缓冲液稀释样品至适当浓度。
4.根据权利要求3所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，当所述的待测样品溶液的荧光值处于所述的标准溶液的荧光值范围之外时，进一步稀释所述待测样品溶液使其荧光值在所述标准溶液的荧光值范围内。
5.根据权利要求1所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述的 GelRed染料溶液是使用0. 1% STEB缓冲液稀释GelRed染料5000倍得到的。
6.根据权利要求1所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，测定所述溶液荧光值时所使用的波长激发光的波长为250-270nm ；发射光的波长为570-600nm。
7.根据权利要求6所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述激发光的波长为260nm ；发射光的波长为590nm。
8.根据权利要求1所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述的与GelRed染料溶液的混合包括吸取预设体积的样品或DNA标准溶液或RNA标准溶液和等体积GelRed染料溶液至离心管中，充分混勻。
9.根据权利要求1所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述的酶标板是黑色不透光，96孔不可拆或可拆酶标板。
10.根据权利要求9所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述的待测样品溶液或DNA标准溶液或RNA标准溶液和GelRed染料溶液混合后加入酶标板中的加样方式为
11.根据权利要求1所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述的测定DNA标准溶液、RNA标准溶液和待测样品溶液的荧光值的步骤是按下述步骤进行的1)读取酶标板上每个孔的荧光值并记为Fl；2)向每个孔中加入10μ 1的RNase A工作液，然后继续振荡20-30min ；3)再次读取酶标板上每个孔的荧光信号值，记为F2； 则DNA的荧光值Fdna = F2 RNA 的荧光值 Fkna = F1-F2以DNA标准溶液，RNA标准溶液的浓度为横坐标，所测得的荧光值为纵坐标，绘制标准曲线，DNA线性回归方程、RNA线性回归方程分别为 DNA 含量=[(FDNA-b) /a] X 稀释因子 X 1. 5， 其中a为线性回归方程的斜率，b为线性回归方程的截距； RNA 含量=[(FENA-b) /a] X 稀释因子 X 1. 5 其中a为线性回归方程的斜率，b为线性回归方程的截距。
12.根据权利要求11所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，在读取荧光值F2之后，再向每个孔中加入10 μ 1的DNase I工作液，在37度条件下温浴1-1. 5 小时；然后在室温下放置20-30min至室温；再次读取荧光信号值，记为F3 ； 则DNA 的荧光值 Fdna = F2-F3 RNA 的荧光值 Fkna = F1-F2以DNA标准溶液，RNA标准溶液的浓度为横坐标，所测得的荧光值为纵坐标，绘制标准曲线，DNA线性方程、RNA线性回归方程分别为DNA含量=[(FDNA-b)/a] X稀释因子X 1.5，其中a为线性回归方程的斜率，b为线性回归方程的截距；RNA含量=[(Fm-b)/a] X稀释因子X 1.5，其中a为线性回归方程的斜率，b为线性回归方程的截距。
13.根据权利要求12所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于， 所述的DNA标准曲线y = 14242x+630. 06,相关系数R2 = 0.9994 ；RNA标准曲线y = 3562. 9x+518. 75，相关系数 R2 = 0. 9998。
14.根据权利要求1至13中任一项权利要求所述的定量测定RNA浓度和DNA浓度的方法，其特征在于，所述方法的线性范围DNA的线性范围在0. 015-2. 2μ g/ml之间，RNA的线性范围在0. 04-3. 66 μ g/ml之间。
15.一种测定RNA和DNA比值的方法，所述方法包括(1)采用权利要求1-14中任一项所述的方法测定RNA的浓度和DNA的浓度；(2)确定RNA的浓度和DNA的浓度之间的比值。
全文摘要
本发明涉及一种定量测定微生物、动植物组织和活体细胞中RNA和DNA浓度及其比值的新方法，特别是使用GelRed染料测定RNA浓度和DNA浓度及其比值的方法。该方法可用于环境生物样品的分析测定。本发明在保证高灵敏度的前提下，提高了分析过程中的生物安全性并降低了废弃物对环境可能造成的污染。同时本发明方法降低了对样品的需求量，提高了检测实用效率，为开展生物学研究和环境生物健康调查提供了可靠分析技术手段。
文档编号C12Q1/68GK102559879SQ201110435760
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者安立会, 宋双双, 张雷, 赵兴茹, 郑丙辉, 陈浩 申请人:中国环境科学研究院