专利名称：新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法。
背景技术：
干细胞具备增殖和分化的特性。体外培养条件下，若不加入相应的抑制因子(如白血细胞生成抑制因子等)，则细胞将很快分化成为不同类型的其它细胞而失去干细胞本身的特性。而其分化过程的调节，即由干细胞向特定的细胞分化的调控，目前仍是科学未能很好解决的问题。如何能使干细胞保持在未分化状态，即仍具备干细胞的基本特征而又使细胞的量得以大量增殖，成为目前该研究领域的一大难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种有效而简便易行的扩增血液和骨髓干细胞的方法，以达到既能使干细胞数量的大量增加，又保持其多潜能分化的特征。为解决上述问题，本发明提供一种新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法， 其方法是以分离出的血液和骨髓干细胞制成悬浮液作新生裸鼠头皮静脉注射进行体内扩
+曰O所述新生裸鼠为出生后彡Mh，所述新生裸鼠的品种为BALB/c-nu。所述分离出的血液和骨髓干细胞是采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分离。所述悬浮液是在血液和骨髓干细胞中加入生理盐水制成。所述悬浮液的浓度为IO6-IO7个干细胞/ml生理盐水，注射剂量为0. 05-0. Iml0所述方法中，将悬浮液作新生裸鼠头皮静脉注射后，是待裸鼠生长15-60天后，再收集裸鼠血液。所述方法中，收集裸鼠血液后，是采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分离干细胞。新生裸鼠由于具有很低的免疫排斥反应，能很好地容纳外来干细胞的生长，而随着动物个体的长大，血液容量的增大，植入其体内的细胞亦随之大量增殖，而又由于动物体内的内环境的支撑和约束，干细胞在增殖的同时，能很好地保持其基本特性。本发明的注射剂量保持在合适剂量内且注射干细胞也维持一定数量，能使血液和骨髓干细胞在裸鼠体内保持持续的增殖，而且收集裸鼠血液的时间在15-60天范围内，既不会因为时间过短干细胞增殖不够，也不会因时间过长导致分化。最终在收集的血液中检测所获干细胞活性> 90% 干细胞纯度彡90%，内毒素检测< 5EU/kg。本发明提供了一种动物体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，达到既保持干细胞基本特性的同时，又能使细胞数量大量增加的目的。该发明可以为临床细胞治疗提供性质稳定的干细胞，亦可为生物医学研究提供可靠的细胞来源，能够有效的缓解细胞供源不足的矛盾。
具体实施例方式本发明所用的实验材料和试剂的厂家、型号如下所示裸鼠出生彡24h的新生鼠，由美国Charles River公司提供，品种为BALB/c-nu。Ficoll 液Sigma 公司产品，型号为 F2637。Diamond⑶34 Isolation Kit 买自德国美天旎生物技术有限公司，产品编号为 130-094-531，包括连接有抗人⑶34抗体的磁力小珠的缓冲液；洗柱缓冲液。Diamond⑶133 Isolation Kit 买自德国美天旎生物技术有限公司，产品编号为 130-094-913，包括连接有抗人⑶133抗体的磁力小珠的缓冲液；洗柱缓冲液。MACs磁力分离系统买自德国美天旎生物技术有限公司，包括磁力分离板；过滤柱。现结合实施例对本发明作进一步详细说明实施例1新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，包括下列步骤(1)制备干细胞采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分离出⑶34阳性的血液干细胞取人新鲜全血10ml，加入50ml 0. 5M的EDTA缓冲液中充分混合，取该混合液38ml加入 50ml的离心管中，再由管底缓慢加入10ml Ficoll液，于室温下2000转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞约10ml，再用0. 5M的EDTA缓冲液IOml洗细胞一次，细胞用连接有抗人CD34抗体的磁力小珠的缓冲液Iml悬浮，在冰上孵化20分钟，将细胞混悬液在磁力分离板形成的磁力场中通过过滤柱，再用5ml缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)8到10ml，细胞计数板计数细胞量以供下一步的注射用。(2)干细胞作新生裸鼠静脉注射取步骤(1)最后所得的干细胞IO5个悬浮在0.05毫升生理盐水里，作刚出生M个小时内的新生裸鼠头皮静脉注射，注射剂量为0. 05ml。(3)收集血液，制备细胞悬液待小鼠生长15天后，共收集裸鼠血液2. 5ml，溶于50ml的0. 5M的EDTA缓冲液中， 4°C下1500转/分钟离心5分钟，去除上清后，再用0. 5M的EDTA缓冲液50ml完全悬浮细胞制成细胞悬液，(4)分离干细胞并检测取上述细胞悬液36ml于加入50毫升的离心管，再由离心管底部缓慢加入IOml的 Ficoll液，室温下2000转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞，并用0. 5M的EDTA 缓冲液IOml洗细胞一次，再用连接有抗人CD34抗体的磁力小珠的缓冲液Iml悬浮细胞， 在冰上孵化20分钟，将所得的细胞混悬液在磁力板形成的磁力场中通过过滤柱，再用5ml 洗柱缓冲液缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)10ml，细胞计数板计数细胞量，测得收获细胞量约为5 X IO6个，经检测干细胞活性大于90 %，干细胞纯度大于90 %，内毒素检测小于5EU/kg。实施例2新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，包括下列步骤
(1)制备干细胞采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分离出⑶34阳性的血液干细胞取人新鲜全血10ml，加入50ml 0. 5M的EDTA缓冲液中充分混合，取该混合液38ml加入 50ml的离心管中，再由管底缓慢加入IOml Ficoll液，于室温下2000转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞约10ml，再用0. 5M的EDTA缓冲液IOml洗细胞一次，细胞用连接有抗人CD34抗体的磁力小珠的缓冲液Iml悬浮，在冰上孵化20分钟，将细胞混悬液在磁力分离板形成的磁力场中通过过滤柱，再用5ml缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)10ml，细胞计数板计数细胞量以供下一步的注射用。(2)干细胞作新生裸鼠静脉注射取步骤(1)最后所得的干细胞IO5个悬浮在0.1毫升生理盐水里，作刚出生M个小时内的新生裸鼠头皮静脉注射，注射剂量为0. Iml0(3)收集血液，制备细胞悬液待小鼠生长30天后，共收集裸鼠血液:3ml，溶于50ml的0. 5M的EDTA缓冲液中， 4°C下1500转/分钟离心5分钟，去除上清后，再用0. 5M的EDTA缓冲液50ml完全悬浮细胞制成细胞悬液。(4)分离干细胞并检测取上述细胞悬液36ml于加入50毫升的离心管，再由离心管底部缓慢加入IOml的 Ficoll液，室温下2000转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞，并用IOml的0. 5M 的EDTA缓冲液洗细胞一次，再用连接有抗人CD34抗体的磁力小珠的缓冲液Iml悬浮细胞， 在冰上孵化20分钟，将所得的细胞混悬液在磁力板形成的磁力场中通过过滤柱，再用洗柱缓冲液5ml缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)10ml，细胞计数板计数细胞量，测得收获细胞量约为1. 5 X IO8个，经检测干细胞活性大于90 %，干细胞纯度大于90 %， 内毒素检测小于5EU/kg。实施例3新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，包括下列步骤(1)制备干细胞采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分离出⑶34阳性的血液干细胞取人新鲜全血10ml，加入50ml 0. 5M的EDTA缓冲液中充分混合，取该混合液38ml加入 50ml的离心管中，再由管底缓慢加入IOml Ficoll液，于室温下2000转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞约10ml，再用0. 5M的EDTA缓冲液IOml洗细胞一次，细胞用连接有抗人CD34抗体的磁力小珠的缓冲液Iml悬浮，在冰上孵化20分钟，将细胞混悬液在磁力分离板形成的磁力场中通过过滤柱，再用5ml缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)10ml，细胞计数板计数细胞量以供下一步的注射用。(2)干细胞作新生裸鼠静脉注射取步骤(1)最后所得的干细胞IO5个悬浮在0. Iml的生理盐水里，作刚出生M个小时内的新生裸鼠头皮静脉注射，注射剂量为0. Iml,(3)收集血液，制备细胞悬液待小鼠生长60天后，共收集裸鼠血液3. 5ml，溶于50ml的0. 5M的EDTA缓冲液中， 4°C下1500转/分钟离心5分钟，去除上清后，再用0. 5M的EDTA缓冲液50ml完全悬浮细胞制成细胞悬液。(4)分离干细胞并检测取上述细胞悬液36ml于加入50毫升的离心管，再由离心管底部缓慢加入IOml的 Ficoll液，室温下2000转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞，并用IOml的0. 5M 的EDTA缓冲液洗细胞一次，再用连接有抗人CD34抗体的磁力小珠的Iml缓冲液悬浮细胞， 在冰上孵化20分钟，将所得的细胞混悬液在磁力板形成的磁力场中通过过滤柱，再用洗柱缓冲液5ml缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)10ml，细胞计数板计数细胞量，测得收获细胞量约为1. 8 X IO8个，经检测干细胞活性大于90 %，干细胞纯度大于90 %， 内毒素检测小于5EU/kg。实施例4新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，包括下列步骤(1)制备干细胞用骨勺刮取收获人新鲜股骨头(外科手术弃用)内骨髓质约50g，置15ml的0. 5M 的EDTA缓冲液中反复剪碎，100 μ m的过滤网滤除大的组织碎片，4°C下1500转/分钟离心 5分钟，去除上清获得细胞，将细胞再悬浮于50ml 0. 5M的EDTA缓冲液中制成细胞悬液，采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分离出CD34阳性的骨髓干细胞取上述细胞悬液38ml加入50ml的离心管中，再由管底缓慢加入IOml Ficoll液，于室温下，2000 转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞约10ml，再用0. 5M的EDTA缓冲液IOml洗细胞一次，细胞用连接有抗人CD34抗体的磁力小珠的缓冲液Iml悬浮，在冰上孵化20分钟， 将细胞混悬液在磁力板形成的磁力场中通过过滤柱，再用5ml缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)10ml，细胞计数板计数细胞量以供下一步的注射用。(2)干细胞作新生裸鼠静脉注射取步骤(1)最后所得的干细胞IO5个悬浮在0. Iml生理盐水里，作刚出生M个小时内的新生裸鼠头皮静脉注射，注射剂量为0. Iml0(3)收集血液，制备细胞悬液待小鼠生长30天后，共收集裸鼠血液2. 5ml，溶于50ml的0. 5M的EDTA缓冲液中， 4°C下1500转/分钟离心5分钟，去除上清后，再用0. 5M的EDTA缓冲液50ml完全悬浮细胞制成细胞悬液。(4)分离干细胞并检测取上述细胞悬液36ml加入50毫升的离心管，再由离心管底部缓慢加入IOml的 Ficoll液，室温下2000转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞，并用IOml的0. 5M 的EDTA缓冲液洗细胞一次，再用连接有抗人CD34抗体的磁力小珠的Iml缓冲液悬浮细胞， 在冰上孵化20分钟，将所得的细胞混悬液在磁力分离板形成的磁力场中通过过滤柱，再用洗柱缓冲液5ml缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)10ml，细胞计数板计数细胞量，测得收获细胞量约为IO8个，经检测干细胞活性大于90%，干细胞纯度大于90 %， 内毒素检测小于5EU/kg。实施例5新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，包括下列步骤(1)制备干细胞
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用骨勺刮取收获人新鲜股骨头(外科手术弃用)内骨髓质50g，置于15ml的0. 5M 的EDTA缓冲液中反复剪碎，100 μ m的过滤网滤除大的组织碎片，4°C下1500转/分钟离心 5分钟，去除上清获得细胞，将细胞再悬浮于50ml 0. 5M的EDTA缓冲液中制成细胞悬液，采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分离出CD133阳性的骨髓干细胞取上述细胞悬液38ml加入50ml的离心管中，再由管底缓慢加入IOml Ficoll液，于室温下，2000 转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞，约获10ml，再用0. 5M的EDTA缓冲液IOml 洗细胞一次，细胞用连接有抗人CD133抗体的磁力小珠的缓冲液Iml悬浮，在冰上孵化20 分钟，将细胞混悬液在磁力板形成的磁力场中通过过滤柱，再用5ml缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)10ml，细胞计数板计数细胞量以供下一步的注射用。(2)干细胞作新生裸鼠静脉注射取步骤(1)最后所得的干细胞IO5个悬浮在0. Iml生理盐水里，作刚出生M个小时内的新生裸鼠头皮静脉注射，注射剂量为0. Iml0(3)收集血液，制备细胞悬液待小鼠生长30天后，共收集裸鼠血液2. 5ml，溶于50ml的0. 5M的EDTA缓冲液中， 4°C下1500转/分钟离心5分钟，去除上清后，再用0. 5M的EDTA缓冲液50ml完全悬浮细胞制成细胞悬液。(4)分离干细胞并检测取上述细胞悬液36ml加入50毫升的离心管，再由离心管底部缓慢加入IOml的 Ficoll液，室温下2000转/分钟离心25分钟，小心吸取分界层的细胞，并用IOml的0. 5M的 EDTA缓冲液洗细胞一次，再用连接有抗人CD133抗体的磁力小珠的Iml缓冲液悬浮细胞，在冰上孵化20分钟，将所得的细胞混悬液在磁力分离板形成的磁力场中通过过滤柱，再用洗柱缓冲液5ml缓冲液洗柱两次，收集洗出液(含有要收获的细胞)9ml，细胞计数板计数细胞量，测得收获细胞量约为8 X IO7个，经检测干细胞活性大于90%，干细胞纯度大于90%，内毒素检测小于5EU/kg。
权利要求
1.新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，其特征在于，其方法是以分离出的血液和骨髓干细胞制成悬浮液作新生裸鼠头皮静脉注射进行体内扩增。
2.根据权利要求1所述的新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，其特征在于， 所述新生裸鼠为出生后彡Mh，所述新生裸鼠的品种为BALB/c-nu。
3.根据权利要求1所述的新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，其特征在于， 所述分离出的血液和骨髓干细胞是采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分1 O
4.根据权利要求1至3中任一项所述的新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法， 其特征在于，所述悬浮液是在血液和骨髓干细胞中加入生理盐水制成。
5.根据权利要求4中所述的新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，其特征在于，所述悬浮液的浓度为IO6-IO7个干细胞/ml生理盐水，注射剂量为0. 05-0. Iml0
6.根据权利要求1至3中任一项所述的新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法， 其特征在于，所述方法中，将悬浮液作新生裸鼠头皮静脉注射后，是待裸鼠生长15-60天后，再收集裸鼠血液。
7.根据权利要求6所述的新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，其特征在于， 所述方法中，收集裸鼠血液后，是采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分离干细胞。
全文摘要
本发明提供了一种新生裸鼠体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，其方法是以分离出的血液和骨髓干细胞制成悬浮液作新生裸鼠头皮静脉注射进行体内扩增。所述新生裸鼠为出生后≤24h，所述新生裸鼠的品种为BALB/c-nu。分离血液和骨髓干细胞是采用Ficoll密度梯度离心法和磁力吸附分离法分步分离，所述悬浮液是在血液和骨髓干细胞中加入生理盐水制成，所述悬浮液的浓度为106-107个干细胞/ml生理盐水，注射剂量为0.05-0.1ml。本发明提供了一种动物体内扩增血液和骨髓干细胞的方法，达到既保持干细胞基本特性的同时，又能使细胞数量大量增加的目的。该发明可以为临床细胞治疗提供性质稳定的干细胞，亦可为生物医学研究提供可靠的细胞来源，能够有效的缓解细胞供源不足的矛盾。
文档编号C12N5/0789GK102424814SQ20111043983
公开日2012年4月25日 申请日期2011年12月25日 优先权日2011年12月25日
发明者杨寅柯, 杨登科, 高红 申请人:杨寅柯, 杨登科, 高红