专利名称：一种用于登革病毒分型的芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种用于登革病毒分型的芯片。
背景技术：
登革病毒(dengue virus)属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群，形态结构与乙脑病毒相似，但体积较小，约17 25nm。登革病毒基因组RNA约含有11000个核苷酸， 其5'端为I型帽子结构，3'端缺乏poly(A)尾，基因组的5'端和3'端均有一段非编码区。基因组只有一个开放读码框，其5'端1/4编码病毒3个结构蛋白0:、PrM和E)，3'端 3/4编码7个非结构蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b*NS5)。根据病毒包膜蛋白E 的抗原性不同，登革病毒分为1 4个血清型(I、II、III、IV)。各型病毒之间抗原性有交叉，但与黄病毒科的其它抗原群无交叉性。病毒包膜蛋白E的抗原决定簇既可以诱导宿主产生保护性的中和抗体和血凝抑制抗体，还可能参与登革出血热(DHF)和登革休克综合征 (DSS)的发生。目前对于登革病毒的检测主要有病毒分离、血清学诊断和病毒核酸检测。目前广泛应用的主要是RT-PCR方法，该方法具有操作简便、快捷；敏感性高；特异性强；对起始材料质量要求低的特点，但存在假阳性高的缺点，基于TaqMan探针的荧光定量PCR方法解决了这一问题，但仍然存在通量低的缺点。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种用于登革病毒分型的芯片。本实用新型提供的用于检测登革病毒血清型的芯片，包括固体基质和设置在所述固体基质上的探针包被层。其中，所述探针包被层在所述固体基质上的分布呈方阵阵列。所述方阵阵列的列间距为10. 8mm。本实用新型的芯片可同时对多个样品进行检测，实现了样品的高通量检测，节省了大量劳动成本，解决了现有技术通量低的问题。因此，本实用新型具有重要意义。本实用新型芯片可以将登革病毒分类直接鉴定为登革病毒、I型登革病毒、II型登革病毒、III型登革病毒和IV型登革病毒，实验证明，该芯片取得了很好的效果，真阳性率达100%，真阴性率为100%。鉴别四型登革病毒的准确率达到100%。
图1为芯片的结构示意图。图中标记如下1表示固体基质，2表示探针包被层。图2为每个方阵上探针层的排布方式。图3为芯片使用检测原理。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0013]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、芯片的结构芯片的结构如图1所示。该芯片包括固体基质1和设置在固体基质1上的探针包被层2。并且，探针包被层 2在固体基质1上的分布呈方阵阵列，方阵阵列的列间距为10. 8mm。实施例2、芯片的应用以本实施例为例，说明该芯片的具体应用方法。一、芯片上探针的种类探针层包括如下检测探针层、阳性质控探针层(PC)、阴性质控探针层(NC)和磁标层；所述检测探针层为如下所示1)、用于检测登革病毒的通用探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 5所示；2)、用于检测I型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO=I所示，3)、用于检测II型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 2所示，4)、用于检测III型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 3所示，5)、用于检测IV型登革病毒的探针，其核心杂交序列为SEQ ID NO 4所示。阳性质控探针的核心杂交序列为SEQ ID NO 16所示阴性质控探针的核心杂交序列为SEQ ID NO 17所示；磁标的序列为SEQ ID NO 18所示；在每个探针的核心杂交序列的5'端连接有由15个T连接而成的直链DNA片段， 且在和每个检测探针的核心杂交序列的5'端连接一个伯氨基。检测探针、阳性质控探针、阴性质控探针和磁标分别通过其5'端的伯氨基与片基上的醛基形成共价键，从而使其固定在片基上。每个方阵上探针层的排布方式如图2所示。图中I为检测登革病毒I型的探针 DEN-1P，II为检测登革病毒II型的探针DEN-2P，III为检测登革病毒III型的探针DEN-3P， IV为检测登革病毒IV型的探针DEN-4P，T为通用探针。PC为杂交阳性质控探针，NC为杂交阴性质控探针，B为磁标。固体基质为醛基化的玻片片基，购自博奥生物有限公司(货号420022)。二、制备方法将合成好的步骤一中的探针分别先溶解在双蒸水中，得到各种探针溶液，分别转 5μ L上述探针溶液到384孔板或96孔板中，分别加入5μ L 2Χ晶芯@基因芯片点样液(博奥生物，产品目录号440010)，并用移液器充分混合后，即可用于基因芯片点样。杂交阳性质控(PC)探针和杂交阴性质控(NC)探针和磁标按照也先分别溶解在双蒸水中至终浓度均为40 μ M，用于基因芯片点样。将上述检测登革病毒的通用及分型探针，同时设置杂交阳性质控(PC)探针、杂交阴性质控(NC)探针和磁标(Biotin)由博奥生物有限公司生产的晶芯 ^martArrayei^lS 微阵列芯片点样系统按点样步骤点样到醛基片基上。点好样的片基在37°C水盒过夜，去离子水清洗2遍，将芯片放入硼酸盐溶液(1. Og NaBH4+300ml PBS+100ml无水乙醇)中孵育5分钟，去离子水清洗2遍，空气中干燥后，即得到检测登革病毒通用探针及分型探针的基因芯片。每1升PH7. 4的PBS缓冲液按照如下方法制备在 IOOOml 水中加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4，用 HCl 或 NaOH 调PH为7. 4，得到pH 7. 4的PBS缓冲液。制备完成后的芯片经晶芯 LuxScan 10K微阵列芯片扫描仪在PMT/Power = 90/900的扫描参数下扫描，在同一张芯片内，同一根针点样，点直径偏差小于20%。点阵整齐，无明显连点现象，即证明芯片是合格的。结果表明步骤A制备的基因芯片合格。三、应用(一)使用到的试剂如下1、扩增样品中目的条带的引物对组合物，如I至V所示I、SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9所示引物对；该引物对I型登革病毒的扩增产物可与探针DEN-I杂交。II、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示引物对；该引物对II型登革病毒的扩增产物可与探针DEN-2杂交。III、SEQ ID N0:12和SEQ ID NO 13所示引物对；该引物对III型登革病毒的扩增产物可与探针DEN-3杂交。IV、SEQ ID NO 14和SEQ ID NO 15所示引物对；该引物对IV型登革病毒的扩增产物可与探针DEN-4杂交。V,SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示引物对；该引物对登革病毒基因组3’非转录区域(UTR)的扩增产物可与探针DEN-T杂交。上述引物对的上游引物5’端用生物素(Biotin)标记。在正向引物的5'端都加上了 I^stI的酶识别位点(CTGCAG)，反向引物的5'端加上了 McI酶识别位点(GAGCTC)，并都在酶切位点5'端加上了保护碱基。加上酶切位点和保护碱基可以提高PCR反应扩增效率。2、链霉亲和素包被的磁珠购自北京思尔成生物(112-06D)。3、杂交液含有3 X SSC，0.2% (质量百分含量)SDS，25% (质量百分含量)甲酰胺，5XDenhardt' s的溶液。SSC为含有0. 15M氯化钠以及0. 015M柠檬酸钠的缓冲液； Denhardt' s溶液为含有0.02% (质量百分含量)聚蔗糖、0.02% (质量百分含量)聚乙烯吡咯烷酮以及0. 02% (质量百分含量)BSA的混合溶液。聚蔗糖的数均分子量(或重均分子量)为4X 105。4、芯片清洗液芯片清洗液洗液I 含2XSSC，0.2% (质量百分含量)SDS的水溶液；洗液II 0. 2 X SSC的水溶液。5、信号反应缓冲液由羊血清、TEN缓冲液和(质量百分含量)BSA-PBS溶液按照4 10 1的体积比混合而成的溶液。每1升TEN缓冲液按照如下方法制备将10mM、 ρΗ7· 5 的 Tris-HCl 缓冲液、Im mol EDTA 和 2. Omol NaCl 混合，用 10mM、pH7. 5 的 Tris-HCl 缓冲液补足体积。每1升(质量百分含量)BSA-PBS溶液按照如下方法制备将Ig BSA 溶于PH 7. 4的PBS缓冲液中，用PBS缓冲液补足体积。PBS缓冲液(pH 7.4)按照如下方法制备在 IOOOml 水中加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4，用 HCl 或 NaOH 调 PH为7. 4，得到PBS缓冲液。[0056]6、杂交阳性对照样品其核苷酸序列具体为SEQ ID NO 18所示，且该DNA片段的 5’端生物素标记。用去离子水调定浓度为lug/ul。(二)应用原理如图3所示，具体过程是用生物素标记的引物对样品进行扩增，如果该样品中含有登革病毒，则其相应的引物可扩增得到生物素标记的相应型别的登革病毒基因片段，将扩增得到的产物与芯片杂交，然后用链霉亲和素包被的磁珠进行标记，如果探针跟扩增产物可以杂交结合，则结合上的生物素标记的扩增产物可被链霉亲和素包被的磁珠标记，反应结果可以直接肉眼观察，或采用普通光学照相装置照相成像观察结果，也可以用晶芯 LuxScan 10K/A微阵列芯片扫描仪在Power/PMT = 90/800下进行扫描图像。如果在相应的位置有成像反应点则可确定该样品中是否含有该探针检测的登革病毒并可以对其进行分型；反之，则没有。(三)应用II型登革病毒阳性样本感染I型登革病毒而未感染其他型别登革病毒的人的血清标本，取自深圳市疾病预防控制中心，均经过患者的同意；鉴定方法参见KR Gurukumar, D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal,2009,1, 23 :1-8)。II型登革病毒阳性样本感染II型登革病毒而未感染其他型别病毒的人的血清标本，取自广东省疾病预防控制中心，均经过患者的同意；鉴定方法参见KR Gurukumar, D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal, 2009,1, 23 :1-8)·具体步骤如下1、病毒RNA提取及PCR扩增目标基因1)病毒总RNA提取分别取5份I型登革病毒阳性样本和5份II型登革病毒阳性样本，每份分别取 IOOul，加入200ul TRIzol试剂，剧烈振荡60秒，加入IOOul氯仿，剧烈振荡15秒，室温防治5分钟，然后于12000g离心15分钟，将水相转移到新离心管内，加入500ul异丙醇，4°C， 12000g离心10分钟，弃上清，用70%乙醇洗涤RNA沉淀，然后12000g离心2分钟，干燥10 分钟，将沉淀溶于DEPC水中。2)反转录采用Omniscript RT kit试剂盒(北京华美生科生物技术有限公司，货号Qiagen-205111)进行反转录，具体方法为将随机引物2 μ L，dNTP Mix(IOmM)(各 2. 5mM) 1 μ L，样品总RNA(lng至5 μ g)6 μ L混勻，65°C加热变性5分钟，冰浴5分钟；然后加入 10 X First-Strand Buffer 2 μ L, MgCL2 (25mM) 4 μ L，DTT (0· 1M) 2 μ L, RNaout 1 μ L,混勻，25°C加热 anin，然后加入 superscript II 反转录酶(5U/uL) 1 μ L，混勻，25°C IOmin, 42°C 50min,70°C 15min，得到反转录的 cDNA。3)PCR扩增通用型登革病毒基因片段和四型登革病毒基因片段以上述步骤2)得到的cDNA为模板，用引物对进行PCR扩增反应。PCR 反应体系为10 X PCR Buffer 2μ L,25mM MgCL22 μ L, 2. 5mM dNTP mix 1.6 μ L，登革病毒基因片段通用扩增引物的下游引物(5μΜ)和四型登革病毒基因片段扩增引物的下游引物(5 μ M) 0.5 μ L，登革病毒基因片段通用扩增引物的上游引物(生物素标记40 μ Μ)和四型登革病毒基因片段扩增引物的上游引物(生物素标记40 μ Μ) 0. 5 μ L，登革病毒阳性样本反转录得到的 CDNA 2 μ L，LA-TagE (5U/ML) 0. 2 μ L, H2O 11. 2 μ L。PCR扩增程序为先 94°C IOmin ；然后 94°C 30sec，51°C 30sec，72°C 30sec，40 个循环；最后 72 °C 5min。2、PCR产物芯片杂交根据碱基互补配对的原则，在适当的反应条件下，带有生物素标记的PCR产物与芯片上的互补探针结合形成稳定的双链，再与链霉亲和素包被的磁珠反应，通过链霉亲和素与生物素的亲和作用，对芯片上的杂交结果进行磁珠标记后，得到检测分析结果。具体方法如下所述1)芯片杂交将基因芯片放到杂交盒中，取7.8ul杂交液，0.2ul杂交阳性对照样品，分别和7ul 步骤2得到通用及分型登革病毒阳性样本PCR产物混合，用移液器混勻后3000rpm离心 30s，95°C热变性:3min (在PCR仪中)。冰浴骤冷lmin。然后用移液器通过杂交盒的盖片上的小孔注到基因芯片的点阵上，使其覆盖芯片上的点阵。确认杂交液覆盖芯片上的点阵后， 盖紧杂交盒盖，放入42°C恒温水浴锅中，杂交2小时，使样品与探针充分反应。注杂交细菌PCR产物时，需两体系PCR产物混合后杂交。每个点阵15yL。一张芯片共4个点阵，可杂交四份样本。2)芯片清洗芯片清洗使用不同离子强度的溶液依次漂洗芯片，以除去游离的及非特异性结合的样品。将步骤2)杂交结束后的芯片，快速从杂交盒中拿出(盖片可以重复利用)，将芯片转移到盛放预热至42°C的洗液I的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗％iin，以洗去没有与探针特异结合的样品。在洗液I中清洗结束后，迅速用镊子将芯片转移到盛放预热至42°C的洗液II的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗^iin。然后，将芯片放在50mL锥形离心管中 1500rpm离心1分钟。3、信号反应1)将步骤2经杂交后的芯片每个点阵点12 μ L羊血清，37 °C孵育30分钟，然后用 lXPBS(pH 7. 4)(配方为在 1000ml 水中分别加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4,用HCl或NaOH调PH为7. 4)清洗2次，1500rpm离心1分钟。2)信号反应链霉亲和素标记取清洗后的链霉亲和素包被的磁珠与链霉亲和素杂交缓冲液以 1 3的体积比混合，然后点到步骤1)处理过的芯片上，点样量为12ul/点阵，37°C杂交10 分钟。然后用 IXPBS(1000ml 水中分别加入 8. 5g NaCl,2. 2g Na2HPO4 以及 0. 2g NaH2PO4, 用HCl或NaOH调PH为7. 4得到的溶液)清洗2次，1500rpm离心1分钟，即得到全部反应完毕的芯片。4、结果分析芯片杂交结果可以用肉眼直接辨别，达到了直观可视化检测要求。结果也可以采用直接光学成像设备照相，如CCD照片、普通相机照片等显示。结果表明，5份I型登革病毒阳性样本的结果均为I型登革病毒阳性；5份II型登革病毒阳性样本的检测结果均为II 型登革病毒阳性。(四)、应用II按照步骤(三)的方法对I型登革病毒阳性样本(感染I型登革病毒而未感染其他型登革病毒的人的血清标本)，平行四次同时检测，比较四次检测结果，考察芯片检测方法是否稳定，结果显示，检测结果都为I型登革病毒阳性其他型登革病毒阴性，四次结果之间并无显著性差异，证明芯片检测方法相当稳定。(五)、应用III以DNA模板起始量为基准对该芯片的检测灵敏度进行了初步研究。取I型登革病毒阳性样品，提取病毒RNA经反转录后，将cDNA依次进行梯度稀释(100ng，50ng，25ng， IOng)，按步骤一的方法用试剂盒进行杂交检测。cDNA量检测结果显示，荧光信号检测灵敏度为模板量25ng，本发明的芯片检测当模板量降至25ng时缺失一个位点，检测灵敏度为模板量50ng。结果表明本发明的方法可视化芯片检测灵敏度为cDNA模板量50ng。(六)、应用IV取临床检测样本25例(人血清样品，由广东省疾控中心提供，均经过患者同意)，用试剂盒检测，操作同步骤一，同时用PCR方法进行检测(PCR检测方法参见KR Gurukumar, D Priyadarshini, JA Patil, A Bhagat, A Singh. Development of real time PCR for detection and quantitation of Dengue Viruses. Virology Journal,2009,1, 23 :1-8)。结果如下表1所示，结果表明，本发明的检测方法对登革病毒进行检测的真阳性率为5/5 = 100%，真阴性率为20/20 = 100%，对登革病毒进行分型检测的准确率达到 100%。表1.实际样品的检测结果
权利要求1.一种用于检测登革病毒血清型的芯片，其特征在于它包括固体基质和设置在所述固体基质上的探针包被层。
2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于所述探针包被层在所述固体基质上的分布呈方阵阵列。
3.根据权利要求2所述的芯片，其特征在于所述方阵阵列的列间距为10.8mm。
专利摘要本实用新型公开了一种用于登革病毒分型的芯片。该用于检测登革病毒血清型的芯片，它包括固体基质和设置在所述固体基质上的探针包被层。本实用新型的芯片可同时对多个样品进行检测，实现了样品的高通量检测，节省了大量劳动成本，解决了现有技术通量低的问题。因此，本实用新型具有重要意义。
文档编号C12M1/34GK202193789SQ2011202570
公开日2012年4月18日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者冬冰, 刘春晓, 史蕾, 徐云庆, 杨燕秋, 赵纯中, 顾大勇 申请人:深圳市检验检疫科学研究院