烷烃的制造方法及具有烷烃合成能力的重组微生物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种在利用烷烃合成酶活性合成烷烃的反应体系中烷烃生产率优异的烷烃的制造方法及重组微生物。在利用烷烃合成酶合成烷烃的体系中，在铁氧化还原蛋白的存在下，烷烃生产率大幅提高。即，本发明的烷烃的制造方法在铁氧化还原蛋白存在下利用烷烃合成酶合成烷烃。
【专利说明】烷烃的制造方法及具有烷烃合成能力的重组微生物
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种例如可使用于生物柴油燃料的烷烃的制造方法及具有烷烃合成能力的重组微生物。
【背景技术】
[0002]烷烃含有在石油中，通过分馏纯化，被用于各种用途。另外，烷烃不仅广泛用作化学工业中的原料物质，而且也是由石油得到的柴油燃料的主要成分。作为通过生物技术制造烷烃的技术，例如可以举出专利文献I。在专利文献I中公开有一种利用导入了源自蓝藻类的烷烃合成酶基因及酰基CoA还原酶基因的重组大肠杆菌合成烷烃的尝试。
[0003]另外，在专利文献2中公开有一种可生产碳原子数10~25的范围的烃的微细藻类(Pseudochoricystis ellipsoidea)。进而,在专利文献3中公开有一种利用具有催化醒向烷烃转化的脂肪醛脱羧酶活性的酵母合成烷烃的技术。进而，在非专利文献I中公开有一种使用酶P450由醛合成烷烃的方法。
[0004]另一方面,在专利文献4中公开有一种通过在含有烧烃或烧烃一兀醇的培养基中培养表达CYP153-烷烃-1-单加氧酶基因、铁氧化还原蛋白基因及铁氧化还原蛋白还原酶基因的重组大肠杆菌来生物合成α、ω烷烃二醇的方法。
[0005]如上所述，表达烷烃合成酶基因的重组微生物及具有烷烃合成能力的微生物虽然是公知的，但不能说这些的烷烃生产率充分。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1:W02009/140695
[0009]专利文献2:冊2006/109588
[0010]专利文献3:日本特表2010-528627号公报
[0011]专利文献4:日本特开2007-74959号公报
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献I:Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91, 10000-10004(1994)
【发明内容】
[0014]发明所要解决的课题
[0015]因此，本发明是鉴于如上所述的实际情况而完成的，其目的在于，提供一种在利用烷烃合成酶活性合成烷烃的反应体系中烷烃生产率优异的烷烃的制造方法及重组微生物。
[0016]用于解决课题的手段
[0017]为了实现上述的目的，本发明人等进行了潜心研究，结果发现，在利用烷烃合成酶合成烷烃的体系中，在铁氧化还原蛋白的存在下，烷烃生产率大幅提高，以至完成本发明。
[0018]即,本发明包含以下内容。
[0019](I) 一种烷烃的制造方法，其在铁氧化还原蛋白存在下利用烷烃合成酶合成烷烃。[0020](2)如(I)所述的烷烃的制造方法，其特征在于，利用具有烷烃合成能力的微生物合成烷烃。
[0021](3)如(2)所述的烷烃的制造方法，其特征在于，上述微生物为导入有烷烃合成酶基因的重组微生物。
[0022](4)如(2)所述的烷烃的制造方法，其特征在于，上述微生物为导入有铁氧化还原蛋白基因的重组微生物。
[0023](5)如(2)所述的烷烃的制造方法，其特征在于，上述微生物为导入有烷烃合成酶基因及铁氧化还原蛋白基因的重组微生物。
[0024](6)如(I)所述的烷烃的制造方法，其在上述铁氧化还原蛋白的基础上，在铁氧化还原蛋白NADPH还原酶的存在下合成烷烃。
[0025](7)如(6)所述的烷烃的制造方法，其特征在于，利用将铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因导入具有烷烃合成能力的微生物中而成的重组微生物合成烷烃。
[0026](8)如(3)~(5)及(7)中任一项所述的烷烃的制造方法，其特征在于，上述重组微生物源自酵母。
[0027](9)如(I)所述的烷烃的制造方法，其特征在于，上述烷烃合成酶具有将醛转化为烷烃的活性。
[0028](10)如⑴所述的烷烃的制造方法，其特征在于，制造碳原子数9~16的烷烃。
[0029](11) 一种导入了铁氧化还原蛋白基因的具有烷烃合成能力的重组微生物。
[0030](12)如(11)所述的重组微生物，其特征在于，进一步导入了铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因。
[0031](13)如(11)所述的重组微生物，其特征在于，上述烷烃合成能力通过导入烷烃合成酶基因来赋予。
[0032](14)如(11)所述的重组微生物，其特征在于，其为重组酵母。
[0033]发明效果
[0034]根据本发明，可以提高利用烷烃合成酶合成烷烃的反应体系中的烷烃合成的效率，即烷烃的生产率。即，本发明的烷烃的制造方法可以以非常优异的生产效率制造烷烃，可以有助于烷烃的生产成本降低。另外，本发明的重组微生物与现有的具有烷烃合成能力的微生物相比，由于具有优异的烷烃合成能力，因此，对于烷烃制造非常有用。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1是示意性地表示pESCpgkgap-URA-alkS的构成的图；
[0036]图2是示意性地表示pESCpgkgap-HIS-Yfdx的构成的图；
[0037]图3是示意性地表示pESCpgkgap-HIS-Yfdr的构成的图；
[0038]图4是示意性地表示pESCpgkgap-HIS-YfdxYfdr的构成的图；
[0039]图5是表示实施例中制作的各种转化体中的烷烃(十三烷)的合成量的特性图；
[0040]图6是示意性地表示alkS_pOTF的构成的图；
[0041]图1是示意性地表示Efdx-pCOLA的构成的图；
[0042]图8是示意性地表示Efdr-pCOLA的构成的图；
[0043]图9是示意性地表示EfdxEfdr-pCOLA的构成的图；[0044]图10是表示实验例中制作的各种转化体中的烷烃(十三烷)的合成量的特性图。【具体实施方式】
[0045]下面，使用附图及实施例对本发明更详细地进行说明。
[0046]本发明通过在利用烷烃合成酶合成烷烃的体系中存在铁氧化还原蛋白来提高烷烃的生产率。在此，作为利用烷烃合成酶合成烷烃的体系，是指包含具有烷烃合成能力的微生物或、赋予有烷烃合成能力的重组微生物这样的体内体系、利用烷烃合成酶在含有基质的反应液中合成烷烃的体外体系。在任何的烷烃合成体系中，在铁氧化还原蛋白的存在下，与铁氧化还原蛋白的非存在下相比，烷烃的生产率均提高。[0047]另外，通过在铁氧化还原蛋白的基础上存在铁氧化还原蛋白NADPH还原酶(也有时称为铁氧化还原蛋白NADP+还原酶)，可以进一步显著提高烷烃的生产率。即，通过在利用烷烃合成酶合成烷烃的体系中存在铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白NADPH还原酶，与铁氧化还原蛋白单独存在的情况相比，烷烃的生产率更显著地提高。
[0048]〈铁氧化还原蛋白〉
[0049]所谓铁氧化还原蛋白为内部含有铁-硫群(Fe-S群)的铁硫蛋白质，是作为电子载体发挥作用的蛋白质。为了在利用烷烃合成酶合成烷烃的体系中存在铁氧化还原蛋白，作为一个例子，只要在具有烷烃合成能力的微生物、赋予有烷烃合成能力的重组微生物中导入编码铁氧化还原蛋白的基因即可。作为铁氧化还原蛋白基因没有特别限定，可以使用源自任何生物的基因。例如可以通过参照DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库等收藏了基因信息的数据库来特定涉及源自各种生物种的铁氧化还原蛋白基因的碱基序列及铁氧化还原蛋白的氨基酸序列。
[0050]若一旦能够特定铁氧化还原蛋白基因的碱基序列，则可以根据常规方法分离该基因。例如，可以基于特定的碱基序列全合成源自规定的生物的铁氧化还原蛋白基因，也可以基于特定的碱基序列设计引物并以规定的生物基因组作为模板利用使用了该引物的PCR分离铁氧化还原蛋白基因。
[0051]特别是在向具有烷烃合成能力的微生物或赋予有烷烃合成能力的重组微生物导入铁氧化还原蛋白基因的情况下，作为铁氧化还原蛋白基因，优选为源自该微生物的基因。例如只要相对于规定的酵母导入烷烃合成关联基因、相对于获得了烷烃合成能力的重组酵母导入源自该酵母的铁氧化还原蛋白基因即可。
[0052]更具体而言，优选相对于获得了烷烃合成能力的重组酵母(重组酿酒酵母)，使用源自酿酒酵母的铁氧化还原蛋白基因。需要说明的是，源自酿酒酵母的铁氧化还原蛋白基因作为YAHl基因(或Yfdx基因)公知。将源自酿酒酵母的铁氧化还原蛋白基因的碱基序列及由该基因编码的铁氧化还原蛋白的氨基酸序列分别示于序列号I及2。
[0053]另外，作为铁氧化还原蛋白基因，不限定于编码序列号2所示的氨基酸序列的基因，可以为编码由相对于序列号2所示的氨基酸序列具有70%以上的同源性、优选80%以上的同源性、更优选90%以上的同源性、进一步优选95%的同源性、最优选98%以上的同源性的氨基酸序列构成且作为铁氧化还原蛋白发挥作用的蛋白质的基因。同源性的值可以利用安装了 BLAST演算法的BLASTN或BLASTX程序算出(默认设定)。需要说明的是，同源性的值如下算出:算出与配对解析一对氨基酸序列时完全一致的氨基酸残基，作为比较的总氨基酸残基中的上述残基数的比例算出。
[0054]另外，作为铁氧化还原蛋白基因，不限定于编码序列号2所示的氨基酸序列的基因，可以为编码由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、置换、附加或插入有I~20个氨基酸、优选I~15个氨基酸、更优选I~10个氨基酸、进一步优选I~5个氨基酸的氨基酸序列构成且作为铁氧化还原蛋白发挥作用的蛋白质的基因。
[0055]进而，作为铁氧化还原蛋白基因，不限定于由序列号I所示的碱基酸序列构成的基因，可以为编码在严格的条件下对由序列号I所示的碱基序列构成的DNA的互补链的全部或一部分进行杂交，且作为铁氧化还原蛋白发挥作用的蛋白质的基因。在此所谓的“严格的条件”是指形成有所谓特异性的杂交且不会形成非特异性的杂交的条件，例如可以参照Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Third Edition)适宜确定。具体而言，可以利用SOUTHERN杂交时的温度或溶液中所含的盐浓度或SOUTHERN杂交的清洗工序时的温度或溶液中所含的盐浓度设定严格性。
[0056]另外，作为制作由编码相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、置换、附加或插入有规定的氨基酸的氨基酸序列的碱基序列及、与序列号I所示的碱基序列不同的碱基序列构成的DNA的方法，没有特别限定，可以适宜使用以往公知的方法。例如可以使用部位特异性突变诱发方法，并取代规定的盐基。作为部位特异性突变诱发方法，例如可以举出T.孔克尔(Kunkel)的部位特异性变异导入法(KunkeI，T.A.Proc.Nat1.Acad.Sc1.U.S.A.82，488-492 (1985)),Gapped duplex法等。另外，也可以使用利用了部位特异性突变诱发法的变异导入用试剂盒(例如Mutan-K (宝酒造公司制)或Mutan-G (宝酒造公司制))等，或者，使用宝酒造公司制的LA PCR体外诱变系列试剂盒导入变异。
[0057]另一方面，在含有基质的反应液中利用烷烃合成酶合成烷烃的体外体系中存在铁氧化还原蛋白的情况下，使用作为上述的铁氧化还原蛋白基因的产物的铁氧化还原蛋白。作为蛋白质的铁氧化还原蛋白可以利用现有公知的方法得到。可使用的铁氧化还原蛋白可以为未纯化的状态，也可以为粗纯化的状态，还可以为纯化后的状态。
[0058]<铁氧化还原蛋白NADPH还原酶>
[0059]所谓铁氧化还原蛋白NADPH还原酶为催化铁氧化还原蛋白和NADPH之间的氧化还原反应的酶。为了在在利用烷烃合成酶合成烷烃的体系中与铁氧化还原蛋白NADPH还原酶一起存在铁氧化还原蛋白，作为一个例子，只要向具有烷烃合成能力的微生物或赋予有烷烃合成能力的重组微生物导入编码铁氧化还原蛋白的基因及编码铁氧化还原蛋白NADPH还原酶的基因即可。作为铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因没有特别限定，可以使用源自任何生物的基因。例如可以通过参照DDBJ/EMBL/GenBank国际碱基序列数据库等收藏了基因信息的数据库来特定涉及源自各种生物种的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的碱基序列或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶的氨基酸序列。
[0060]若一旦能够特定铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的碱基序列，则可以根据常规方法分离该基因。例如可以基于特定的碱基序列全合成源自规定的生物的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因，也可以基于特定的碱基序列设计引物并以规定的生物基因组作为模板利用使用了该引物的PCR分离铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因。
[0061]特别是在向具有烷烃合成能力的微生物或赋予有烷烃合成能力的重组微生物导入铁氧化还原蛋白基因及铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的情况下，作为铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因，优选为源自该微生物的基因。进而，作为铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因，更优选为源自与导入的铁氧化还原蛋白基因相同的生物的基因。例如只要相对于规定的酵母导入烷烃合成关联基因、相对于获得了烷烃合成能力的重组酵母导入源自该酵母的铁氧化还原蛋白基因及铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因即可。
[0062]更具体而言，优选相对于获得了烷烃合成能力的重组酵母(重组酿酒酵母)使用源自酿酒酵母的铁氧化还原蛋白基因及源自酿酒酵母的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因。需要说明的是，源自酿酒酵母的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因作为YAHl基因(或Yfdx基因)公知。将源自酿酒酵母的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的碱基序列及由该基因编码的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶的氨基酸序列分别示于序列号3及4。
[0063]另外，作为铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因，不限定于编码序列号4所示的氨基酸序列的基因，可以为编码由相对于序列号4所示的氨基酸序列具有70%以上的同源性、优选80%以上的同源性、更优选90%以上的同源性、进一步优选95%的同源性、最优选98%以上的同源性的氨基酸序列构成且作为铁氧化还原蛋白NADPH还原酶发挥作用的蛋白质的基因。同源性的值可以利用安装了 BLAST演算法的BLASTN或BLASTX程序算出(默认设定)。需要说明的是，对同源性的值而言，算出与配对解析一对氨基酸序列时完全一致的氨基酸残基，作为比较的总氨基酸残基中的上述残基数的比例算出。
[0064]另外，作为铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因，不限定于编码序列号4所示的氨基酸序列的基因，可以为编码由相对于序列号4所示的氨基酸序列缺失、置换、附加或插入有I~50个氨基酸、优选I~40个氨基酸、更优选I~30个氨基酸、进一步优选I~20个氨基酸的氨基酸序列构成且作为铁氧化还原蛋白NADPH还原酶发挥作用的蛋白质的基因。
[0065]进而，作为铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因，不限定于由序列号3所示的碱基酸序列构成的基因，可以为编码在严格的条件下对由序列号3所示的碱基序列构成的DNA的互补链的全部或一部分进·行杂交，且作为铁氧化还原蛋白NADPH还原酶发挥作用的蛋白质的基因。在此所谓的“严格的条件”是指形成有所谓特异性的杂交且不会形成非特异性的杂交的条件，例如可以参照Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Third Edition)适宜确定。具体而言，可以根据SOUTHERN杂交时的温度或溶液中所含的盐浓度或SOUTHERN杂交的清洗工序时的温度或溶液中所含的盐浓度设定严格性。
[0066]另外，作为制作由编码相对于序列号4所示的氨基酸序列缺失、置换、附加或插入有规定的氨基酸的氨基酸序列的碱基序列或与序列号3所示的碱基序列不同的碱基序列构成的DNA的方法没有特别限定，可以适宜使用现有公知的方法。例如可以使用部位特异性突变诱发方法置换规定的碱基。作为部位特异性突变诱发方法，例如可以举出T.昆克尔(Kunkel)的部位特异性变异导入法(Kunkel, T.A.Proc.Nat1.Acad.Sc1.U.S.A.82, 488-492 (1985)) ,Gapped duplex法等。另外，也可以使用利用了部位特异性突变诱发法的变异导入用试剂盒(例如Mutan-K (宝酒造公司制)或Mutan-G (宝酒造公司制))等或者使用宝酒造公司制的LA PCR体外诱变系列试剂盒导入变异。
[0067]另一方面，在含有基质的反应液中利用烷烃合成酶合成烷烃的体外体系中存在铁氧化还原蛋白及铁氧化还原蛋白NADPH还原酶的情况下，使用作为上述的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的产物的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶。作为蛋白质的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶可以通过现有公知的方法得到。可使用的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶可以为未纯化的状态，也可以为粗纯化的状态，还可以为纯化后的状态。
[0068]<重组微生物>
[0069]在本发明中，导入了上述的铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的微生物为具有烷烃合成能力的微生物或赋予有烷烃合成能力的重组微生物。
[0070]作为具有烷烃合成能力的微生物，可以举出:细长聚球藻PCC7942、细长聚球蓝细菌PCC6301、集胞藻PCC6803、原绿球藻CCMP1986、多变鱼腥藻ATCC29413、点形念珠藻PCC73102、无类囊体蓝藻PCC7421、念珠藻PCC7120、蓝杆藻PCC7425及蓝杆藻ATCC51142 (参考:Science30July2010.Vol.329，N0.5991，pp.559-562)。
[0071]另外，作为赋予有烷烃合成能力的重组微生物，可以举出导入了从上述的具有烷烃合成能力的微生物中分离的烷烃合成酶基因的重组微生物。例如，作为烷烃合成酶基因，可以使用从念珠藻ATCC27347(PCC7120)中分离的alkS基因、Science30July2010.Vol.329, N0.5991，pp.559-562及W02009/140695中记载的基因。更具体而言,例如可以使用从点形念珠藻PCC73102、细长聚球藻PCC7942、集胞藻PCC6803、蓝杆藻ATCC51142、海滨蓝藻菌MBIC11017、无类囊体蓝藻PCC7421及原绿球藻MIT9303中分离的烷烃合成酶基因
坐寸ο
[0072]作为导入烷烃合成酶基因的微生物，可以举出酵母。作为酵母没有特别限定，但可以举出:树干毕赤酵母 等毕赤属酵母、酿酒酵母等酵母属酵母及热带假丝酵母及近平滑假丝酵母等假丝属酵母等。其中，作为导入烷烃合成酶基因的微生物，优选使用酿酒酵母。作为一个例子，优选将源自念珠藻ATCC27347的alkS基因导入于酿酒酵母，使用具有烷烃合成能力的重组酿酒酵母。
[0073]通过导入于以上述的铁氧化还原蛋白基因为宿主的微生物基因组，例如酵母基因组，可以制作可用于本发明的重组微生物，例如重组酵母。另外，通过导入于除上述的铁氧化还原蛋白基因以外以上述的铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因为宿主的微生物基因组，例如酵母基因组，可以制作可用于本发明的重组微生物，例如重组酵母。
[0074]例如，只要将含有铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的DN A片段与在宿主微生物中起作用的表达载体，优选多拷贝型的载体连结而制作重组DNA并将其导入于微生物进行转化即可。可使用的表达载体没有特别限定，可以举出:质粒型载体、或可插入于宿主生物中的基因组的染色体导入型载体。作为表达载体，没有特别限定，只要根据宿主微生物适宜选择可获得的任何的表达载体即可。需要说明的是，作为表达载体，例如可以举出:质粒DNA、细菌噬菌体DNA、反转录转座子DNA、人工染色体DNA(YAC:酵母菌人工染色体)等。
[0075]作为质粒DNA，例如可以举出:pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112或pAUR123等YCp型大肠杆菌-酵母穿梭载体；pYES2或YEpl3等YEp型大肠杆菌-酵母穿梭载体；pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101 或 pAUR135 等 YIp 型大肠杆菌-酵母穿梭载体；源自大肠杆菌的质粒(pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTVl 19N、pBluescript、pHSG298、pHSG396 或 pTrc99A 等 ColE 系质粒、pACYC177 或 pACYC184等pl5A系质粒、P丽118、P丽119、p丽218或p丽219等pSClOl系质粒等);源自土壤杆菌的质粒(例如PBIlOl等);源自枯草杆菌的质粒(例如pUBllO、pTP5等)等，作为噬菌体DNA，可以举出:λ 噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λ gtlO、λ gtlU λ ZAP)、φΧ174、M13mpl8或M13mpl9等。作为反转录转座子，可以举出Ty因子等。作为YAC用载体，可以使用PYACC2等。进而，也可以使用反转录病毒或牛痘病毒等动物病毒、杆状病毒等昆虫病毒载体。
[0076]在表达载体中，铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因需要分别在可表达的状态下插入于载体。所谓可表达的状态是指以在导入有铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的宿主生物中在规定的启动子的控制下表达的方式连结这些铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因和启动子并装入于载体。在表达载体中，除铁氧化还原蛋白基因及铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因以外，可以连结启动子及终止子，根据期望可以连结强化子等顺式元件、剪接信号、加A信号、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)等。另外，作为选择标记，例如可以举出:氨苄西林抗性基因、卡那霉素抗性基因或潮霉素抗性基因等抗生素抗性基因。
[0077]另外，作为使用表达载体的转化法，也可以适宜使用凑上木皮公知的方法。作为转化方法，可以例示:氯化钙法、感应细胞法、原生质体或原生质球法、电脉冲法等。
[0078]另一方面，可以以提闻铁氧化还原蛋白基因及铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的拷贝数的方式导入。即，可以以在微生物的染色体DNA上存在多拷贝铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的方式导入。为了在微生物的染色体DNA上多拷贝导入铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因，可以利用多拷贝存在于染色体DNA上的序列作为靶并通过同源重组进行。
[0079]进而，铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的表达的增强也可以通过将内在或导入的铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的启动子等表达调节序列置换为可更闻表达的序列的方法、导入使规定的基因的表达上升这样的调节的方法等来实现。 作为可高表达的启动子，没有特别限定，但例如可以举出:lac启动子、trp启动子、trc启动子、pL启动子等。另外，也可在内在或导入的铁氧化还原蛋白基因或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的表达控制区域中导入突变，变为可更高表达的基因。
[0080]<烷烃制造>
[0081]如上述说明那样，根据本发明，可通过具有烷烃合成能力的微生物或赋予有烷烃合成能力的重组微生物这样的体内体系、利用烷烃合成酶在含有基质的反应液中合成烷烃的体外体系以优异的生产率合成烷烃。
[0082]在使用具有烷烃合成能力的微生物或赋予有烷烃合成能力的重组微生物的体系中，可以在适于这些微生物的培养基中培养，在该培养基中生产烷烃。更具体而言，根据本发明，可以提高利用烷烃合成酶的烷烃合成能力，其结果，可以提高烷烃的生产率。
[0083]在此，所谓提高烷烃合成能力是指包含提高利用烷烃合成酶的由醛转化为烷烃的活性。即，利用烷烃合成酶的以醛为基质的烷烃合成反应通过铁氧化还原蛋白的存在使反应效率提高。例如由从上述的念珠藻ATCC27347(PCC7120)中分离的alkS基因编码的AlkS蛋白质显示将十四烷醇转化为十四烷的活性，但在铁氧化还原蛋白的存在下与铁氧化还原蛋白的非存在下相比，可以合成更大量的十四烷。另外，若此时除铁氧化还原蛋白以外存在铁氧化还原蛋白NADPH还原酶，则可以合成更大量的十四烷。
[0084]同样地，在利用烷烃合成酶在含有基质的反应液中合成烷烃的体外体系中，利用烷烃合成酶的以醛为基质的烷烃合成反应也通过铁氧化还原蛋白的存在使反应效率提高。因此，根据本发明，在该反应体系中也可提高烷烃的生产率。
[0085]在本发明中，作为生产对象的烷烃没有特别限定，但采用例如碳原子数为9~16的范围，优选为13~16的范围的烷烃。这些为粘度较高的液体，可以用于轻油(柴油)及航空器燃料。这样的烷烃可以根据常规方法从上述的体内或者体外反应体系中分离，然后，纯化。
[0086]实施例
[0087]下面使用实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明的技术范围并不限定于以下的实施例。
[0088][实施例1]
[0089]在本实施例中，制作在赋予烷烃生产能力的同时导入了铁氧化还原蛋白基因及/或铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因的重组体酵母，确认了相对于铁氧化还原蛋白、铁氧化还原蛋白NADPH还原酶的烷烃生产性能的效果。
[0090]〈pESCpgkgap-HIS 的制作 >
[0091]以克隆的基因的永久性表达为目的，实施在pESC载体(STRATAGENE公司)中插入永久性启动子(Ppgk及Pgap)。所谓Pgap为源自酿酒酵母YPH499的三磷酸甘油醛脱氢酶(gap)基因的启动子。首先以使用Gen TLE (Takara bio公司制)由酵母YPH499株纯化的基因组DNA作为模板并利用PCR获得含有Pgap的DNA片段。聚合酶使用KOD-Plus-Ver.2 (东洋纺公司制)。为了扩增含有Pgap的DNA片段，设计以下的一对引物，反应液组成及反应循环条件如下述所示。·
[0092](引物#1)
[0093]EcoR1-Pgap-F, 5，-CACGGAATTCCAGTTCGAGTTTATCATTATCAA-3’(序列号 5)
[0094](引物#2)
[0095]BamH1-Pgap-R, 5，-CTCTGGATCCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC-3，(序列号 6)
[0096][反应液组成]
[0097]
【权利要求】
1.一种烷烃的制造方法，其在铁氧化还原蛋白存在下通过烷烃合成酶合成烷烃。
2.权利要求1记载的烷烃的制造方法，其特征在于，通过具有烷烃合成能力的微生物合成烷烃。
3.权利要求2记载的烷烃的制造方法，其特征在于，所述微生物为导入有烷烃合成酶基因的重组微生物。
4.权利要求2记载的烷烃的制造方法，其特征在于，所述微生物为导入有铁氧化还原蛋白基因的重组微生物。
5.权利要求2记载的烷烃的制造方法，其特征在于，所述微生物为导入有烷烃合成酶基因及铁氧化还原蛋白基因的重组微生物。
6.权利要求1记载的烷烃的制造方法，其在除了有铁氧化还原蛋白之外，还有铁氧化还原蛋白NADPH还原酶的存在下合成烷烃。
7.权利要求6记载的烷烃的制造方法，其特征在于，通过将铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因导入具有烷烃合成能力的微生物而成的重组微生物合成烷烃。
8.权利要求3~5及7中任一项记载的烷烃的制造方法，其特征在于，所述重组微生物源自酵母。
9.权利要求1记载的烷烃的制造方法，其特征在于，所述烷烃合成酶具有将醛转化为烷烃的活性。
10.权利要求1记载的烷烃的制造方法，其特征在于，制造碳原子数9~16的烷烃。
11. 一种导入了铁氧化还原蛋白基因的、具有烷烃合成能力的重组微生物。
12.权利要求11记载的重组微生物，其特征在于，进一步导入了铁氧化还原蛋白NADPH还原酶基因。
13.权利要求11记载的重组微生物，其特征在于，通过导入烷烃合成酶基因来赋予所述烷烃合成能力。
14.权利要求11记载的重组微生物，其特征在于，其为重组酵母。
【文档编号】C12N1/15GK103717745SQ201180072823
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2011年8月15日 优先权日:2011年8月15日
【发明者】森昌昭 申请人:丰田自动车株式会社