禽脑脊髓炎病毒vp1蛋白亚单位疫苗的制备方法

专利名称：禽脑脊髓炎病毒vp1蛋白亚单位疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
禽脑脊髓炎又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus, AEV)引起的一种主要侵害雏鸡的传染病，其特征性病理变化为非化脓性脑脊髓炎， 典型症状为运动失调，头颈震颤和渐进性麻痹(赵振华、禹旺盛、郝宪谱等.禽脑脊髓炎的发生与诊断.内蒙古畜牧科学.1994，3 :34-37)。世界几乎所有饲养商品鸡的地区都发生过该病，我国自上世纪80年代以来各地陆续暴发此病，给养禽业带来较大的经济损失。由于本病具有突然出现，难以预测持续期，可通过水平接触和垂直传播等特点，所以对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过对产蛋种鸡接种疫苗来预防后代雏鸡的发病。目前国内对禽脑脊髓炎疫苗的研究大多集中在灭活疫苗的研制，国外为弱毒活疫苗的研究报道。AEV是小RNA科肠病毒属成员，基因组为单链正股RNA(Calnek，B. W.，Luginbuhl， R. E. , Helmboldt, C. F. ,1997.Avian encephalomyelitis diseases of Poultry. Iowa State University Press，Ames，IA，pp. 571-581)。AEV 仅有一个翻译起点，编码产生一个多聚蛋白，多聚蛋白在病毒编码的活性蛋白的作用下，级联水解成功能性蛋白，VPl是病毒的四种结构蛋白中的一种，与病毒的侵入及参与构成病毒的抗原成分有关。新加坡的Li Wei (2008)最近报道用细胞表达的VPl亚单位疫苗能有效地保护鸡免受AEV的感染。他们将AEV的主要抗原蛋白VPl、VP0、VP3分别在细胞SF9中进行表达，然后纯化蛋白，制成亚单位疫苗，并对VP1、VP0和VP3生物活性进行了检测，结果发现VP1是主要的抗原蛋白，能有效地保护鸡免受 AEV 的感染(Wei L，Chee LL, Wei T et al. The VPl protein of avian encephalomyelitis virus is a major host-protective immunogen that serves as diagnostic potential. J Virol Methods. 2008Apr ； 149(1) :56-62.)。完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。 并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，敏感性高，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物。而且不需灭活，但安全性高。通过对禽脑脊髓炎病毒VPl cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在原核细胞中高效表达的cDNA序列，构建了原核表达载体，进行原核表达， 并成功地表达出可溶性的重组蛋白。利用本发明可以生产出禽脑脊髓炎亚单位疫苗，具有商业使用价值。 发明内容
本发明的目的是提供一种禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白的基因合成、表达载体构建及产物的制法，以求在大规模工业化生产中能生产出高效、安全、价廉的禽脑脊髓炎病毒VPl 蛋白亚单位疫苗。实现本发明的技术方案为1.构建一种可表达禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌将含有所禽脑脊髓炎VPl蛋白基因(序列1)连入克隆载体PM-18T，并转入大肠埃希氏菌DH5CI ；将鉴定正确的阳性质粒PMD18-T-VP1，用ECORI和Mil双酶切后，经1. 2%琼脂糖凝胶电泳，回收到VPl基因；回收的VPl基因连入pET-32a，构建成禽脑脊髓炎VPl蛋白基因的表达载体 pET-3^i-VPl，转化表达型大肠杆菌(Escherichia coli) Rossetta，获得可表达禽脑脊髓炎 VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌pET-32a-VPl/Rossetta株。2.制备的禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗利用构建获得可表达禽脑脊髓炎 VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pET_3^i-VPl/Rossetta株作为生产菌株，制备脑脊髓炎VPl蛋白和常规矿物油佐剂而成禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫
田ο3.本发明涉及的禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗是将本发明中获得的重组大肠埃希氏菌pET-32a-VPl/ROSSetta接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C 培养过夜后挑取菌落，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液和大肠埃希氏菌培养基(配方为胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%)中培养至菌液OD6c 为0.6 0.8时， 加入终浓度为0. 02M的乳糖，进行诱导培养5 几，离心收集菌体；将收集的菌体用生理盐水进行悬浮，置超声波破碎菌体；经硫酸铵提取、透析后禽脑脊髓炎VPl蛋白；再按常规矿物油佐剂灭活疫苗制备方法制备成疫苗。本发明
具体实施例方式一、制苗用菌种1.禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白的基因合成、表达载体构建本发明设计合成了能生产禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因，这种基因含有如下核苷酸序列(序列1)5' -ATGGGGAAAG AGGATGAAGG AGGATTTTCC AGTGTGCCTG AAGTGGAGCA ACATGTTGTT GAGGACAAGG AACCACAGGG ACCTTTGCAC GTGACACCTT TTGGCGCTGT TAAAGCCATG GAGGACCCTC AGTTGGCGAG GAAAACACCT GGTACATTTC CTGAATTAGC TCCTGGTAAA CCTCGACACA CAGTAGACCA TATGGATCTG TATAAGTTTA TGGGGCGTGC CCATTACTTG TGGGGACATA AATTTACCAA AACTGATATG CAGTACACAT TCCAGATACC ATTGAGTCCC ATCAAGGAGG GTTTTGTGAC GGGAACGCTT AGGTGGTTTT TAAGTCTTTT CCAATTGTAT CGTGGTTCTC TCGACATTAC CATGACATTC GCAGGAAAGA CTAATGTAGA CGGCATTGTA TACTTTGTGC CTGAGGGTGT TGCGATAGAG ACTGAGAGGA AGGAACAGAC CCCTCTGCTC ACGTTGAACT ACAAAACATC GGTAGGTGCC ATTAGGTTTA ATACTGGACA AACTACAAAT GTCCAGTTTA GGATCCCTTT CTACACGCCA CTGGAGCACA TCGCAACCCA TTCTAAAAAC GCGATGGACT CAGTCTTGGG GGCAATTACA ACTCAGATCA CCAATTATAG TGCTCAGGAT GAGTACCTGC AGGTCACCTA CTATATCAGC TTTAATGAAG ATTCACAGTT TTCTGTTCCC AGAGCGGTAC CAGTGGTTAG CTCATTCACT GACACATCTA GCAAGACAGT GATGAATACA TATTGGCTCG ATGATGACGA GTTGGTGGAA GGGTCCTCCC ATTTTAGTTT CGATGAAATT GAGGAGGCCC AATGTTAA-3‘
其氨基酸序列为序列2:Met Gly Lys Glu Asp Glu Gly Gly Phe Ser Ser Val Pro Glu Val GluGln His Val Val Glu Asp Lys Glu Pro Gln Gly Pro Leu His Val ThrPro Phe Gly Ala Val Lys Ala Met Glu Asp Pro Gln Leu Ala Arg LysThr Pro Gly Thr Phe Pro Glu Leu Asp Pro Gly Lys Pro Arg His ThrVal Asp His MetAsp Leu Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ala His Tys LeuTrp Gly His Lys Phe Thr Lys Thr Asp Met Gln Tyr The Phe Gln liePro Leu Ser Pro lie Lys Glu Gly Phe Val Thr Gly Thr Leu Arg TrpPhe Leu Ser Leu Phe Gln Leu Tyr Arg Gly Ser Leu Asp lie Thr MetThr Phe Ala Gly Lys Thr Asn Val Asp Gly lie Val Tyr Phe Val ProGlu Gly Val Ala lie Glu Thr Glu Arg Lys Glu Gln Thr Pro Leu LeuThr Leu Asn Tyr Lys Thr Ser Val Gly Ala lie Arg Phe Asn Thr GlyGln Thr Thr Asn Val Gln Phe Arg lie Pro Phe Tyr Thr Pro Leu GluHis lie Ala Thr His Ser Lys Asn Ala Met Asp Ser Val Leu Gly Alalie Thr Thr Gln lie Thr Asn Tyr Ser Ala Gln Asp Glu Tyr Leu GlnVal Thr Tyr Tyr lie Ser Phe Asn Glu Asp Ser Gln Phe Ser Val ProArg Ala Val Pro Val Val Ser Ser Phe Thr Asp Thr Ser Ser Lyr ThrVal Met Asn Thr Tyr Trp Leu Asp Asp Asp Glu Leu Val Glu Gly SerSer His Phe Ser Phe Asp Glu lie Glu Glu Ala Gln Cys为扩增如上所述的基因，本发明设计并合成了如下相应引物primer 1:5' -GGGGAATTCATGGGGAAAGAGGATGAAGGAGGA-3‘(序列 3)primer 2:5' -GGGGTCGACTTAACATTGGGCCTCCTCAATTTC-3‘(序列 4)将含有如上所述核苷酸序列的基因(禽脑脊髓炎VPl蛋白基因)连入克隆载体 PM-18T，并转入大肠杆菌DH5 α。将鉴定正确的阳性质粒pMD18_T_VPl用ECORI和Mil双酶切后，经1. 2%琼脂糖凝胶电泳，回收到VPl基因。回收的VPl基因连入pET-32a，构建成禽脑脊髓炎VPl蛋白基因的表达载体pET-32a-VPl，转化表达型大肠杆菌Rossetta，获得可表达禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因工程大肠杆菌。表达载体pET_3h (+)带有高效表达的T7启动子，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制，能在乳糖的作用下，由宿主菌提供的T7RNA聚合酶进行诱导。构建的禽脑脊髓炎VPl 蛋白表达质粒pET-32a_VPl，转化大肠杆菌转化表达型大肠埃希氏菌Rossetta后构建成重组大肠埃希氏菌RoSSetta/pET-3^i-VPl (该菌株与2011年12月13日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为；CGMCC No. 5581)加入0. 2mmol/L乳糖溶液的诱导剂，使禽脑脊髓炎VPl蛋白获得高效表达。2.表达产物的鉴定将PBS重悬浮的菌体用超声波裂解后，12000r/min离心15min，取上清加入蛋白电泳上样缓冲液(购自北京博迈德科技发展有限公司)，沸水煮8min后，用12%的分离胶进行SDS-PAGE鉴定(图5中，从左到右分别是蛋白marker，对照，全菌-1，全菌_2)。采用硫酸铵沉淀(每100ml上清加5. 6g硫酸铵，4°C过夜，然后lOOOOr/min离心lOmin，收集沉淀，用IOmlPBS (pH7. 2)进行悬浮)、Ni_NTA对上清液进行纯化(见附注1)。将用Ni-NTA纯化的产物进行SDS-PAGE分析(图6，从左到右分别是洗脱液洗脱下的第一管、第二管和第三管)。二、疫苗制造1.抗原制备(1)发酵及诱导表达将本发明中重组大肠杆菌R0SSetta/pET-3h-VPl接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C培养过夜。挑取菌落，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液和大肠埃希氏菌培养基(配方为胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化钠)中培养至菌液 OD600为0. 6 0. 8时，加入终浓度为0. 02M的乳糖，进行诱导培养5 7h，离心收集菌体。(2)表达蛋白的纯化过程将收集的菌体用生理盐水进行悬浮，置超声波破碎菌体。加固体硫酸铵至浓度达到10%，充分溶解后4°C存放过夜。离心收集沉淀。用生理盐水重溶沉淀，并用透析袋(北京瑞达恒辉科技发展有限公司生产，截留量14KD)进行透析。用 AGP法(张淑霞，杨增岐.禽脑脊髓炎琼扩抗原的研制和应用.动物医学进展，2001，22 O) 59-60)测定回收物抗原滴度。2.疫苗的制备水相制备将灭活好的抗原(琼扩效价为1 16) 96份、吐温-80 4份混勻制成水相。油相制备将白油94份、司本-80 6份、硬脂酸铝2份混勻制成油相。乳化取油相2份放于剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份， 加完后以10000r/min乳化5min。三、疫苗检验1、效力试验将制备的疫苗颈部皮下注射(0. 5ml/只)免疫罗曼蛋种鸡。用爱德士禽脑脊髓炎抗体检测试剂盒对其抗体进行检测，ELISA检测结果S/P ^ 0. 2，均为为阳性。收集免疫后蛋鸡的受精种蛋，卵黄囊内接种禽脑脊髓炎强毒VR株(购自中国兽医药品监察所)，其剂量为IOOEID5q，孵化，雏鸡正常出壳。四、本发明所涉及的疫苗与其他疫苗的比较见表1。表1本发明所涉及的疫苗与现在使用的疫苗比较
权利要求
1.一种可表达禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，其特征在于该工程菌是将含有所禽脑脊髓炎VPl蛋白基因(序列I)连入克隆载体PM-18T， 并转入大肠埃希氏菌DH5 a ;将鉴定正确的阳性质粒pMD18-T-VPl，用ECORI和SalI双酶切后，经I. 2%琼脂糖凝胶电泳，回收到VPl基因；回收的VPl基因连入pET-32a，构建成禽脑脊髓炎VPl蛋白基因的表达载体pET-32a_VPl，转化表达型大肠杆菌Rossetta，获得可表达禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pET_32a_VPl/ Rossetta株，该菌株已于2011年12月13日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGMCC No. 5581。
2.一种由权利要求I所制备的禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗，其特征在于该亚单位疫苗含有大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No. 5581表达的脑脊髓炎VPl蛋白和常规矿物油佐剂。
3.—种权利要求2的禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于 将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No. 5581接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB 平板上，37°C培养过夜后挑取菌落，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液和大肠埃希氏菌培养基中培养至菌液OD6tltl为0. 6 0. 8时，加入终浓度为0. 02M的乳糖，进行诱导培养 5 7h，离心收集菌体；将收集的菌体用生理盐水进行悬浮，置超声波破碎菌体；经硫酸铵提取、透析后禽脑脊髓炎VPl蛋白；再按常规矿物油佐剂灭活疫苗制备方法制备成疫苗。
全文摘要
本发明涉及一种禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白亚单位疫苗的制备方法。本发明是通过合成了禽脑脊髓炎VP1基因的引物，构建并获得了一株带有该基因的高效表达载体的重组菌，实现了禽脑脊髓炎VP1蛋白在大肠杆菌中的高效表达，可溶性蛋白表达量约占菌体总蛋白的60％，该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然VP1蛋白的抗原活性。利用该重组菌作为生产菌株制备成的禽脑脊髓炎VP1亚单位疫苗能有效地保护禽类免遭禽脑脊髓炎病毒的攻击。
文档编号C12N1/21GK102533629SQ20121004700
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者宫晓, 徐宝娟, 李昌友, 王红, 郭伟伟 申请人:青岛易邦生物工程有限公司