专利名称：一株植物乳杆菌在全株小麦青贮中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株植物乳杆菌在全株小麦青贮中的应用。
背景技术：
研究表明，乳熟期小麦(Triticum spp.)的茎、叶和种子可以为牲畜提供可消化纤维和一定的能量(9. 0MJ/kg，DM)，比干草的营养价值高10% 20%，与玉米相比，其粗蛋白含量相对较高。全株青贮小麦是泌乳期奶牛和肉牛的良好饲料。由于青贮乳熟期小麦的茎、叶和种子具有饲用价值高的优点，目前一些国家和地区开始注重开发青贮全株小麦的饲用价值。我国青贮原料主要是牧草(黑麦草、苜蓿、三叶草)和玉米，而小麦的青贮研究及应用较少。寻求适合的青贮添加剂，以此来改善青贮发酵，减少青贮损失，最终提高动物的生产性能，而选择微生物添加剂将不失为一条高效的途径。
发明内容
本发明的一个目的是提供植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Z3-1在制备青忙饲料中的应用；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3_l在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5027 ;所述青贮饲料为全株小麦(Triticum spp.)青忙饲料；所述全株小麦青忙饲料的青忙原料为全株小麦(Triticumspp.),具体可为发育至乳熟期的小麦(Triticum spp.)的莖、叶和种子；所述青贮饲料是将所述青贮原料在厌氧的条件下进行发酵得到的饲料；所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1的菌落呈乳白色,边缘整齐；细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；接触酶阴性，氧化酶阴性；具有较强的生长及产酸性能，30°C条件下，在MRS液体培养基中培养24h，菌体浓度可达到IO8 IO9Cfu/mL, pH彡3. 5 ;其碳源发酵实验结果如表I所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列I所示；该植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1CGMCC No. 5027 具有以下生物学特性I)在起始ρΗ2· 5 ρΗ9· O的条件下能够生长；2)在5°C 10°C或50°C温度环境下呈现微弱生长，在15°C 45°C条件下生长状况良好；3)在彡6. 5% NaCl的条件下生长状况良好。本发明的另一个目的是提供一种全株小麦青贮饲料的制备方法，包括如下步骤用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1对全株小麦(Triticum spp.)进行固体发酵，收集所有发酵产物，得到所述全株小麦青贮饲料；所述进行固体发酵所用的全株小麦(Triticum spp.)为发育至乳熟期的小麦(Triticum spp.)的莖、叶和种子。在上述全株小麦青贮饲料的制备方法中，所述发酵按照每克所述全株小麦(Triticum spp.)接种 IO5 IO6Cfu 所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Z3-I 进行。在上述全株小麦青贮饲料的制备方法中，所述发酵的温度为室温；所述室温为15 25 。在上述全株小麦青贮饲料的制备方法中，所述发酵的时间为30d 60d。上述任一所述方法制备得到的全株小麦青贮饲料均属于本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种青贮饲料添加剂，所述青贮饲料添加剂的活性成分为所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3_I ；所述青贮饲料添加剂为制备青贮饲料过程中添加的菌剂。本发明还提供上述青贮饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤将所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在用于培养植物乳杆菌的培养基上培养,得到所述青忙饲料添加剂。本发明还提供培养所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1的方法,该方法包括将所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3_l在用于培养植物乳杆菌的培
养基上培养的步骤。在上述青忙饲料添加剂的制备方法及培养所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) Z3-1的方法中，所述用于培养植物乳杆菌的培养基可为MRS培养基，具体可为MRS液体培养基或MRS固体培养基；所述MRS液体培养基的溶剂为水，溶质为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温-80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，所述溶质蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温-80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰在所述MRS液体培养基中的浓度分别为10. 0g/LU0. 0g/L、5. 0g/L、2. 0g/L、20. Og/L、I. 0g/L、5. 0g/L、2. 0g/L、0. 58g/L 和 0. 25g/L，所述 MRS 液体培养基的 pH 值为 6. 5 ;所述MRS固体培养基是按照每升所述MRS液体培养基加15克琼脂制备得到的培养基。实验证明，与自然青忙相比，每克全株小麦(Triticum spp.)接种IO5 IO6Cfu植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Z3_ICGMCC No. 5027 青忙 15d,全株小麦中的大肠杆菌即低于检测线，而自然青贮30d大肠杆菌才低于检测线；接种Z3-1青贮后发酵产物的PH降低较快，5d即降到4. O以下，而自然青贮至30d pH值仍高于4. O ;接种Z3-1青贮30d 60d，有机酸中乳酸的含量较自然青贮提高196%，乙酸提高159%，粗蛋白含量提高
8.32%,粗纤维含量降低12.6%。因此,与自然青忙相比，接种植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1CGMCC No. 5027能够明显提高全株小麦青贮的营养价值。应用本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3_ICGMCCNo. 5027发酵全株小麦具有发酵效率高、成本低廉等优点，可用于生产绿色环保生物饲料。
图I 为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3_ICGMCC No. 5027 发酵液对革兰氏阳性及阴性指示菌的抑菌圈。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MRS液体培养基溶剂为水，溶质为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温-80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，溶质蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温-80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰在MRS液体培养基中的浓度分别为 10. 0g/LU0. 0g/L、5. 0g/L、2. 0g/L、20. 0g/L、l. 0g/L、5. 0g/L、2. 0g/L、0. 58g/L 和0. 25g/L，pH 值为 6.5。
MRS固体培养基每升上述MRS液体培养基添加15g琼脂制备得到的培养基。红薯茎叶为发育至红薯成熟时期的红薯(Ipomoea batatas)茎叶经过刈割处理后得到的，平均粒径为2mm，含水量为75. 5%，切割为5cm长度。麸皮为小麦最外层的表皮,小麦被磨面机加工后得到的,含水量为为18. I %。玉米糁将玉米的成熟籽粒去皮后磨成的小颗粒，平均粒径为1mm，含水量为
18.2%。豆柏含水量为10%。花菜外包叶为发育至花菜成熟时期的花菜(Brassica oleracea)外包叶,含水量为81. 1%，切割长度为5cm。实施例I、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Z3_ICGMCC No. 5027 的分离、纯
化与鉴定取河南郑州地区青忙玉米稻杆IOg,加入90mL蒸懼水，用震荡器震荡5min,10-1-10-5梯度稀释。分别从各梯度稀释液中取20 μ L涂布于MRS固体培养基上，静置厌氧培养48h，挑取菌落形态、大小、颜色和光泽度等有明显差别的单菌落，重复划线，直至得到纯菌落。将菌株接种于MRS液体培养基中30 V培养24h，IOOOOrpm离心IOmin后，取20 μ L上清液，以藤黄微球菌(Micrococcus Iuteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和大肠杆菌(Escherichia coli)分别作为指不菌,用牛津杯双层平板法进行抑菌试验，如图I所示，从中筛选出抑菌效果好的Z3-1菌株。将Z3-1菌株在MRS固体培养基上培养24h后，观察菌落的大小、颜色、边缘状况及革兰氏染色镜检细菌形态。利用API 50CH检测Z3-1菌株对49种不同碳源的同化能力。结果Z3-1菌株菌落呈现乳白色，边缘整齐；Z3-1菌株细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；Z3-1菌株接触酶阴性，氧化酶阴性；Z3-1菌株具有较强的生长及产酸性能，在MRS液体培养基中培养24h，菌体浓度可达到IO8 109cfu/mL，pH ( 3. 5。Z3-1菌株的碳源发酵实验结果如表I所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列I所示。根据细胞显微形态、碳源发酵实验结果和16S rRNA基因序列数据，将菌株Z3-1鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),并于2011年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记编号为CGMCC No. 5027。表I. Z3-1菌株的碳源发酵实验结果
权利要求
1.植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3_l在制备青忙饲料中的应用；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3_l在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5027 ;所述青忙饲料为全株小麦(Triticum spp.)青忙饲料。
2.一种小麦青贮饲料的制备方法，包括如下步骤用权利要求I所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1对全株小麦(Triticum spp.)进行固体发酵，收集所有发酵产物，得到所述全株小麦青贮饲料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵按照每克所述全株小麦(Triticum spp.)接种 IO5 IO6Cfu 所述植物乳杆菌(Lac tobacillus plantarum) Z3-I 进行。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述发酵的温度为室温，所述室温为15 25 。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述发酵的时间为30d 60d。
6.权利要求2-5中任一所述方法制备得到的全株小麦青贮饲料。
7.一种青贮饲料添加剂，其特征在于所述青贮饲料添加剂的活性成分为权利要求I所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1。
8.权利要求7所述青贮饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤将权利要求I所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在用于培养植物乳杆菌的培养基上培养,得到权利要求7所述的青贮饲料添加剂。
9.培养权利要求I所述的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3_l的方法,包括将权利要求I所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) Z3-1在用于培养植物乳杆菌的培养基上培养的步骤。
全文摘要
本发明公开了一株植物乳杆菌在全株小麦青贮中的应用。所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5027，该菌株能够提高乳熟期小麦(Triticumspp.)的茎、叶和种子青贮的营养价值，青贮15天后大肠杆菌低于检测线，且不含易引起恶臭的丁酸。与自然青贮相比，接种Z3-1青贮发酵30d，pH较低，有机酸中乳酸的含量提高了196％，乙酸的含量提高了159％，粗蛋白的含量提高了8.32％，粗纤维的含量降低了12.6％。应用本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1CGMCC No.5027接种青贮全株小麦具有效果好、成本低廉等优点，可用于生产绿色环保生物饲料。
文档编号C12N1/20GK102640885SQ20121011636
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者倪奎奎, 庞会利, 李东霞, 焦浈, 王雁萍 申请人:郑州大学