专利名称：核酸探针检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于核酸检测方法技术领域，具体涉及核酸探针检测方法及其试剂盒。
背景技术：
生物分子检测在分子诊断、工业和环境监测以及生化防御等领域得到广泛应用。随着应用的进一步发展，开发快速、简单和低成本的生物传感器显得非常重要。纳米材料由于其独特的光学、电学以及催化特性，能很好的解决其中部分问题。特别是近些年，很多 研究人员把目光投向基于纳米材料的生物传感器，这些生物传感器利用了不同组分、尺寸、相貌的纳米材料与生物分子间的相互作用。最具代表的是美国西北大学的Mirkin教授组开发的一系列基于纳米金的高灵敏度的生物传感器(N. L. Rosi, C. A. Mirkin, Chem.Rev. 2005，105，1547.)。核酸探针是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可用来快速检测病原体。核酸探针将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针。可与固定在硝酸纤维素膜的DNA或RNA进行互补结合，经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。利用荧光标记的DNA探针均能检测核酸，具有一些内在的优点，如操作方便、具有很快的杂交动力学以及能够和实时定量PCR或者原位细胞成像兼容。一般此类探针都由荧光基团和淬灭基团组成，基于能量共振转移原理。随着DNA杂交发生，荧光基团和淬灭基团距离发生改变，导致荧光变化。近些年，为了增加此类探针的信噪比，传统的有机荧光 基团和淬灭基团被量子点、纳米金和单壁碳纳米管取代。石墨烯(graphene)是由单层碳原子构成的二维纳米材料,该材料具有独特的电学、热学和力学性质，并且氧化之后的石墨烯具有很好的水溶性，因此该材料在纳米电子学和纳米复合材料领域应用非常广泛。石墨烯和石墨一样属于复式六角晶格，在二维平面上每个碳原子以sp2杂化轨道相衔接，也就是每个碳原子与最近邻的三个碳原子间形成三个O键。剩余的一个P电子轨道垂直于石墨烯平面，与周围原子形成键，碳原子间相互围成正六边形平面蜂窝形结构，这样在同一原子面上只有两种空间位置相异的原子。最近，一些研究人员通过理论模拟发现，石墨烯具有长程纳米尺度上的能量转移特性，因此可以作为一种超强淬灭剂(R. S. Swathi, K. L. Sebastian, J. Chem. Phys.2008， 129， 054703)。
发明内容
本发明所要解决的问题在于提供一种具有更高灵敏度和信噪比的基于石墨烯的核酸探针检测方法。本发明的所要解决的又一问题，在于提供上述的核酸探针检测试剂盒。本发明的所要解决的又一问题，在于提供上述的核酸探针检测试剂盒的应用。为了解决现有技术中的这些问题，本发明第一方面提供的技术方案是核酸探针检测方法，其特征在于，包括以下步骤，
(1)氧化石墨烯的制备，
(2)准备荧光基团标记的核酸探针，及准备待检测、鉴定和/或定量的样品，
(3)将步骤(I)中的氧化石墨烯与步骤(2)中的荧光基团标记的核酸探针、待检测、鉴定和/或定量的样品进行混合，
(4)将上述的混合产物进行分离，检测分离产物的荧光量。优选地，所述步骤(3)中，氧化石墨烯和荧光基团标记的核酸探针进行混合，然后加入待检测、鉴定和/或定量的样品。优选地，步骤(3)中反应的温度为20°C -37 °C，混合时间为1—30分钟。
优选地，步骤(3)中反应的温度为37 °C，混合时间为I分钟。优选地，所述的氧化石墨烯为片层结构，每片面积大小在300-500平方纳米范围内，片层厚度在0. 5 2nm范围内。优选地，所述的荧光基团标记的核酸探针为荧光标记的适配体。优选地，所述的荧光基团为FAM或ROX或CY5。优选地，反应体系为pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液，其具体配方为100 mM NaCl, 7.7mM Na2HPO4, 2. 3 mM NaH2PO4。为了解决现有技术中的这些问题，本发明第二方面提供的技术方案是一种核酸探针检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光基团标记的核酸探针、氧化石墨烯。优选地，所述的氧化石墨烯为片层结构，每片面积大小在300-500平方纳米范围内，片层厚度在0. 5 2nm范围内。优选地，所述的荧光基团标记的核酸探针为荧光标记的适配体。优选地，试剂盒中采用pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液，其具体配方为100 mM NaCl,
7.7 mM Na2HPO4, 2. 3 mM NaH2PO4。优选地，荧光标记的适配体可以根据具体的检测需要而选用相应的适配体，且当适配体种类为一种以上，其上各自的荧光基团的激发和发射波长不能有重叠。为了解决现有技术中的这些问题，本发明第三方面提供的技术方案是前述的试剂盒在制备用于核酸探针检测方法的制品中的应用。在本文中，术语“氧化石墨烯”具有本领域技术人员所熟知的含义，本发明的石墨烯(Graphene)是纳米石墨烯纳米材料。氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)具有与突光基团进行能量共振转移，从而猝灭荧光的特性。GO与单链核酸之间存在较强的作用，荧光基团标记的单链核酸被吸附到GO表面，则荧光基团靠近GO表面，被激发的能量转移到GO表面，则检测不到荧光。而GO对核酸双链的作用很弱，双链DNA远离G0，荧光基团标记的核酸则在相应波长激发下发出荧光。探针是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可用来快速检测病原体。核酸探针将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针。可与DNA或RNA进行互补结合，经放射自显影或其他检测手段就可以判定是否有同源的核酸分子存在。本专利申请中的术语“适配体”是本领域技术人员所熟知的，指的是能够与特定的靶分子结合的单链核酸，包括DNA或RNA。本发明使用的核酸适配体5’端修饰有不同的荧光基团。本发明中，适配体aptamer链用不同的突光基团标记， 氧化石墨烯(GO)和DNA之间的相互作用，当存在待检测的DNA时，荧光基团标记的互补DNA与靶DNA相互杂交，由于GO对双链的作用很弱，双链DNA远离G0，荧光基团在相应波长激发下发出荧光。而没有靶DNA时，由于GO与单链DNA之间存在较强的作用，荧光基团标记的DNA被吸附到GO表面，荧光基团靠近GO表面，被激发的能量转移到GO表面，没有荧光。通过荧光的数值我们可以判断靶DNA的存在。本发明旨在建立一种用于DNA检测的探针，该探针利用了 DNA/G0之间的相互作用。同时，该策略不限于DNA的检测，还可以检测腺嘌呤和重金属离子等。
本专利申请中的术语“荧光基团”是本领域技术人员所熟知的，如常用的FAM、R0X、CY5。修饰好的荧光基团的核酸适配体可以从生物公司购买，但在荧光基团的选择上要求各个核酸适配体荧光基团的激发和发射波长不能有重叠，因此也不宜采用磷光基团。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是
I.氧化石墨烯的易合成和探针DNA的单标记特点使得该探针能够成为低成本、快速检测方法的首选之一。整个检测过程耗时短，无需复杂仪器及特别技巧，尤其是该方法可以利用未经精度提纯的待测样品直接检测这样极大地方便了检测操作，节省了试剂使用并加快了检测进程。相对较高的检测灵敏度，特异性强、重复性好、准确率高。由于石墨烯表面积大以及其良好的淬灭效果，该探针能同时检测多个不同待检测物质并且比传统的分子信标能提高至少一个数量级。不会出现适配体与靶分子(MAM mRNA)和其他非特异核酸序列互相干扰的情况。氧化石墨烯具有较高的淬灭能力，大大提高了核酸分子检测的灵敏度和特异性。检测分子种类多，本发明的采用的探针结合适配体技术，该探针将荧光基团标记的适配体及其氧化石墨烯技术结合，可以在均相体系中检测多种小分子以及DNA以外的分子，比如腺嘌呤、重金属离子，该策略为快速检测多种小分子提供一种潜在的方法。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
图I为一实施例合成的GO片层形貌、尺寸和高度信息。图2为GO的核酸探针检测DNA原理示意图。图3为设计的探针用于DNA检测的结果。不同荧光基团(图中选取了 FAM、ROX和CY5三种荧光基团，各自最佳激发波长为494纳米、587纳米和643纳米)标记的DNA混合后加入分别与FAM标记DNA互补(3A)、CY5标记DNA互补(3B)以及与ROX标记DNA互补(3C)的靶DNA，然后用各自最佳激发波长激发。图4为一实施例中核酸探针对腺嘌呤(ATP)的检测结果。图5为一实施例中核酸探针对汞离子(Hg2+)的检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，如《分子克隆实验手册》以及所用试剂和仪器的厂商说明书。腺嘌呤(ATP)、鸟嘌呤(GTP)、胞嘧啶(CTP)、胸腺嘧啶(TTP)、ATP特异性结合的FAM标记的适配体DNA(aptamer)和汞离子(Hg2+)特异性结合的DNA购自上海生物工程有限公司，汞离子(Hg2+)以及其他金属离子购自国药集团，GO由本实验室合成。实施例I氧化石墨烯的合成
GO 的合成主要参考相关文献(W. Hummers, J. R. Offeman, J. Am. Chem. Soc.1958，80，1339)。通常化学合成的GO片层都在几百纳米，大小尺寸主要分布在300-500纳米，但大小不影响检测结果。荧光标记的DNA在50个碱基对时检测效果比较好。利用GO和DNA的相互作用可以实现多种DNA或小分子的检测。
的合成
合成基本步骤如下4克石墨粉加入到温度为80°C的H2S04、K2S208、P205的混合液中，反应6小时后将该混合液冷却到室温。然后，将该混合液用去离子水稀释到300毫升，用0. 22微米的滤膜抽滤，放在60°C烘干，得到的样品(2g)再用92毫升H2SO4和KMnO4 (12g)放在冰浴中搅拌，15分钟后加入NaNO3 (2g)，放在35°C搅拌2小时后稀释到200毫升，然后用30%的H2O2终止。终产物用1%的HCl洗3次，得到的溶液用300瓦超声仪超声I. 5小时，没有剥离的石墨通过离心分离。片层的表征
用原子力显微镜(AFM)测量GO片层的形貌的厚度，在气相中进行，采用接触模式(Tapping-mode)，得到的GO片成大小在300-500纳米，有少数微米级别的片层，其厚度在I纳米左右，与文献报道相符。采用透射电子显微镜(TEM)表征其精细结构。图I是原子力显微镜(AFM)对合成的氧化石墨烯(GO)的表征图，从图中可以得到GO的形貌(片层结构)、尺寸大小(平均值约为300纳米X 500纳米)，高度约为I纳米，这些信息可以确定得到的是单片层的氧化石墨烯。实施例2核酸探针的检测
2.I根据标记的荧光基团的效率不同，将不同量的不同荧光基团标记的DNA探针(FAM,ROX和CY5)三种荧光基团标记的DNA探针的量分别为5 pmol, 10 pmol和20 pmol)和待检测溶液混合，混合条件为37°C，30分钟，混合溶液含有相应的磷酸缓冲液(PBS)，其中PBS的浓度为0. I M0然后加入适量GO溶液。在上述荧光探针DNA的加入量时，通常氧化石墨烯的浓度为I 50 ii g/mL ;荧光浓度范围为I 100pM。本实施例中，GO的最终浓度为5 u g/mL。DNA杂交液和GO混合的时间在I分钟内，这样可以有效区分不同浓度靶DNA的荧光强度。待检测溶液中的靶DNA与其互补的荧光探针杂交形成双链，远离GO表面，发出荧光。采用不同的荧光染料基团的相应激发波长激发，不同的波长激发时间间隔控制在15秒钟内。使用荧光光度计测量混合溶液的荧光强度，当用荧光染料基团的相应激发波长激发后，得到该染料基团的发射光谱，在相应的发射峰出现最大信号值，而其他染料不会有信号产生，从而可以检测靶DNA的存在。(附图3A，3B，3C)
实施例33.I荧光基团FAM标记的与ATP特异性结合的适配体aptamer与GO混合，不加入ATP时，FAM标记的aptamer吸附到GO表面。用494纳米激发，由于标记的aptamer荧光大部分被GO淬灭，因此荧光信号很低。将突光基团FAM标记的aptamer与ATP混合,aptamer与之形成三维刚性结构,GO基本不能淬灭该结构的荧光，所以荧光信号很强。将荧光基团FAM标记的aptamer与CTP、GTP或TTP混合，其荧光信号比加入ATP时低，说明该策略有很好的选择性，见附图4。
实施例4
4.I荧光基团FAM标记的与Hg2+特异性结合的DNA片段与GO混合，不加入Hg2+。一定时间后用494纳米激发，测得其荧光信号很低(附图5，横坐标O)。荧光基团FAM标记的与Hg2+特异性结合的DNA片段和Hg2+混合，反应一段时间，DNA片段与Hg2+作用后形成茎环结构，加入一定量GO溶液，用494纳米激发测得其荧光信号很强(附图5，横坐标Hg2+)。突光基团FAM标记的DNA片段和其他不同金属离子混合,反应一段时间后加入一定量GO溶液，用494纳米激发测得其荧光信号很弱，说明该策略有很好的选择性，如附图5所示其他金属离子的反应。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种核酸探针检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 (1)氧化石墨烯的制备， (2)准备荧光基团标记的核酸探针，及准备待检测、鉴定和/或定量的样品， (3)将步骤(I)中的氧化石墨烯与步骤(2)中的荧光基团标记的核酸探针、待检测、鉴定和/或定量的样品进行混合； (4)将上述的混合产物进行分离，检测分离产物的荧光量。
2.根据权利要求I所述的核酸探针检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，氧化石墨烯和荧光基团标记的核酸探针进行混合，然后加入待检测、鉴定和/或定量的样品。
3.根据权利要求2所述的核酸探针检测方法，其特征在于，步骤(3)中反应的温度为.20 0C -37 °C，混合时间为1—30分钟。
4.根据权利要求2所述的核酸探针检测方法，其特征在于，步骤(3)中反应的温度为37°C，混合时间为I分钟。
5.根据权利要求I所述的核酸探针检测方法，其特征在于，所述的氧化石墨烯为片层结构，每片面积大小在300-500平方纳米范围内，片层厚度在0. 5 2nm范围内。
6.根据权利要求I所述的核酸探针检测方法，其特征在于，所述的荧光基团标记的核酸探针为荧光标记的适配体。
7.根据权利要求5所述的核酸探针检测方法，其特征在于，所述的荧光基团为FAM或ROX 或 CY5。
8.根据权利要求I所述的核酸探针检测方法，其特征在于，反应体系为pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液。
9.一种核酸探针检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光基团标记的核酸探针、氧化石墨烯。
10.根据权利要求9所述的核酸探针检测试剂盒，其特征在于，所述的氧化石墨烯为片层结构，每片面积大小在300-500平方纳米范围内，片层厚度在0. 5 2nm范围内。
11.根据权利要求9所述的核酸探针检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光基团标记的核酸探针为荧光标记的适配体。
12.根据权利要求9所述的DNA探针检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中采用pH7. 4的磷酸盐缓冲溶液。
13.根据权利要求9所述的DNA探针检测试剂盒，其特征在于，荧光标记的适配体可以根据具体的检测需要而选用相应的适配体，且当适配体种类为一种以上，其上各自的荧光基团的激发和发射波长不能有重叠。
14.根据权利要求9-13任一项所述的试剂盒在制备用于权利要求I所述方法的制品中的应用。
全文摘要
本发明所要解决的问题在于提供一种具有更高灵敏度和信噪比的基于石墨烯的核酸探针检测方法及其试剂盒和应用。将氧化石墨烯与荧光基团标记的核酸探针、待检测、鉴定和/或定量的样品进行混合，最后检测分离产物的荧光量。氧化石墨烯的易合成和探针DNA的单标记特点使得该探针成为低成本、快速检测方法的首选之一。由于石墨烯表面积大以及其良好的淬灭效果，该探针能同时检测多个不同待检测物质并且比传统的分子信标能提高至少一个数量级。不会出现适配体与靶分子(MAMmRNA)和其他非特异核酸序列互相干扰的情况。
文档编号C12Q1/68GK102643916SQ20121011616
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月19日 优先权日2012年4月19日
发明者宋世平, 樊春海, 黄庆 申请人:华森新科(苏州)纳米技术有限公司