专利名称：蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法。
背景技术：
神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)具有广泛的临床应用前景，主要表现在促进神经元的发育和分化，减轻病理状态下神经元损伤，促进神经元修复和再生；诱导血管内皮细胞，促进血管生成；提高细胞溶酶体内各种水解酶活性，增强巨噬细胞吞噬能力，及诱导细胞凋亡等。蛇毒神经生长因子(Venom NGF, vNGF)与人类NGF的同源性在66 % -80 %之间，对人类神经细胞具有可靠的正向调节作用，作用机制相通，存在相似的多肽刺激和激活领域。目前，国内外已对vNGF进行了大量的基础性研究，但有关临床应用的研究和实践甚少，主要受限于以下原因由于NGF促进生长和诱导细胞凋亡的双重功效，疗效尚不十分确切；vNGF原料不易获取，纯化过程繁杂；进入体内后，活性维持和作用效果不 详。故而，迄今为止，vNGF尚未能在临床上得到较好的应用。目前，在已知的神经生长因子P链118个氨基酸序列中，以小鼠NGF的cDNA为探针，已从人的DNA文库中克隆出人类NGF的基因编码鼠、人类、牛、鸡胚和蛇的NGF cDNA已经被测序和克隆。因为蛇毒中NGF含量最丰富，同时蛇类NGF与人类的同源性在66 % -80 %之间，但对人类神经细胞依然具有可靠的正向调节作用，作用机制相通，存在相似的多肽刺激和激活领域，因此备受人们关注。vNGF的代表株是一种活化的重组蛇毒神经生长因子一sputa NGF，被证明在体内外均是无毒的，更具安全性。对比11株已登录的vNGF的mRNA序列，我们发现vNGF具有高度的同源性，介于93 % -99 %，其变异点主要集中在441位点、541位点和555位点。Kostiza等根据亚基数目以及亚基之间的结合方式将蛇毒分为四类，并指出@ -亚基是NGF的活性部位。NGF生物活性的发挥是通过受体介导的，NGF受体有两类TrKA和P75，分别以高、低亲和力结合NGF。TrkA受体属于酪氨酸激酶家族，与NGF结合后，可激活Ras、Akt等多条信息途径，调节神经细胞的存活、生长和分化。P75受体的效应主要是诱导细胞凋亡。本研究以sputa NGF为模板，通过基因重组构建2个组蛋白标记的融合蛋白质作为研究模型的不同多肽刺激物；通过不同长度的功能多肽片段刺激研究模型细胞一鸡胚背根神经节组织和大鼠肾上腺嗜铬细胞(pheochromocy toma cells,PC12),解析其两个不同受体TrKA和P75的活化状态，及细胞内信号转导的信息表达水平和磷酸化水平，利用特异性细胞信号分子活化抑制剂阻断细胞内特定分子的信号转导，综合判断vNGF的功能区域，从而鉴定vNGF的具有活性的多肽组成和序列，为具有单一取向的蛇毒神经生长因子活性多肽的新药生产提供分子生物学数据和奠定理论基础。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种利用基因重组技术分段筛选蛇毒神经生长因子活性多肽的方法。
本发明所述蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法，其包括以下步骤一、融合蛋白质的构建选择活化的重组蛇毒神经生长因子，以sputa NGF(vNGF)为模板，进行功能区域断点分析，然后通过PCR引物法构建至少两个不同长度的片段序列，并作标记。二、质粒表达系统的构建将上述片段序列分别组装在pBluscriptll SK+质粒中，构建vNGF的转移载体，并使其在DH5a中克隆，形成活性多肽质粒转移系统，然后利用单一酶切点的黏性末端连接方法将具有相同黏性末端的至少两个不同长度的基因片段和目的片段连接，分别组装在PQE30质粒的BamHI和HindIII酶切位点之间，克隆并表达vNGF的活性多肽。三、通过6X组氨酸回收提纯技术进行分离、鉴定、提纯，形成vNGF活性多肽的刺激物原液。
四、验证原核表达VNGFP片段的生物活性，进行多肽筛选。所述片段序列为2个，分别为vNGF Fl片段，对应20-388基因位点，计369bp ;vNGF F2片段，对应389-751基因位点，计363bp。所述验证原核表达vNGF片段的生物活性的方法为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤培养检测法。本发明所述蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法，其有益效果是本发明通过蛇毒神经生长因子氨基酸和核苷酸同源性分析，发现其变异点主要集中在441位点、541位点和555位点。并以此为基础确定以sputa NGF为模板进行了功能区域的断点分析，提出以sputa NGF为模板，通过基因重组构建2个组蛋白标记的融合蛋白质作为研究模型的不同多肽刺激物的设计方案，研究蛇毒神经生长因子多肽的活性，以进行筛选。对sputa NGF的应用基础研究提供分子生物学支持。
附图I为pQE30的基因序列，其中I为HindIII酶切位点，2为BamHI酶切位点，3为启动子，4为翻译起始点,5为终止子,6为终止序列。附图2为vNGF的基因序列。
具体实施例方式下面将以具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。实施例I :本发明所述蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法，通过对已登录的28个vNGF可参考序列进行分子树原序列分析，对比11株登录的vNGF mRNA序列,发现vNGF具有闻度的同源性，介于93%-99%，其变异点主要集中在441位点、541位点和555位点，对11个vNGFmRNA序列分别进行了氨基酸和核苷酸同源性分析，并以此为基础，以vNGF为模板进行了功能区域的断点分析，以此为基础，筛选步骤如下一、融合蛋白质的构建提出以vNGF为模板，通过PCR引物法构建2个不同长度的片段序列，分别为所述片段序列为2个，分别为vNGF Fl片段，对应20-388基因位点，计369bp ；vNGF F2片段，对应389-751基因位点，计363bp，构建2个组蛋白标记的融合蛋白质。二、质粒表达系统的构建因为pBluscriptll SK+质粒和pQE30质粒是目前应用效果最好的转移载体和多肽表达载体，将上述2个序列在pBluscriptIISK+质粒中构建vNGF的转移载体，并在DH5a中克隆，形成活性多肽质粒转移系统。然后利用单一酶切点的黏性末端连接方法将具有相同黏性末端的2个不同长度的基因片段和目的片段连接，分别组装在PQE30质粒的BamHI和HindIII之间，鉴定插入方向，克隆并表达vNGF的活性多肽。三、通过6X组氨酸回收提纯技术进行分离、鉴定、提纯，形成sputaNGF活性多肽的刺激物原液。活性多肽的回收与提纯在必要时通过8M尿素蛋白质复性方法获得可溶性蛋白，并辅以肝素亲和层析和双层阳离子交换层析方法予以回收和提纯。四、验证原核表达vNGF ^片段的生物活性的方法为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤 (pheochromocytoma cells,PC12)培养检测法将vNGF与PCI2置于无血清培养液中，vNGF与PCI2细胞上的受体结合，使PC12细胞长出轴突向神经细胞方向分化。观察上述两个实验的阳性反应和阴性反应条件下效应细胞的TrKA和P75受体的表达量以及活性，确定有效多肽。分别取FI、F2片段基因重组原核表达蛋白，采用上述PC12细胞培养检测法定性检测结果Fl蛋白组细胞在培养10天后，细胞生长出大量神经样纤维，F2蛋白组细胞培养10天后，细胞多数呈球形，少量细胞有神经样纤维。定量检测分别取25ng / ml的FI、F2基因重组原核表达蛋白、10%小牛血清、5%马血清、85%1640培养基中培养24小时，Fl组细胞聚集成团并长出神经样纤维，F2组细胞聚集成团未见纤维生长。活性测定取致敏PC12细胞适量，接种于盛有活性测定培养液IOml (10%小牛血清、5%马血清、85%1640培养基)的培养瓶中，分别加入适量的上述刺激物原液使培养液中的vNGF浓度控制在能促使活性细胞团比例为3(T70之间，或加入对照生理盐水。同法培养24h后于显微镜下观察，随机计数10个视野.每个视野各10个细胞团，明显长出突触的记为活性细胞团。活性单位定义为实验组活性细胞团数减去空白对照组活性细胞团数与总观察细胞团数相比乘以100%，求得活性细胞团所占比例，Iml活性测定培养液中，促进产生50%活性细胞团的vNGF量为一个活性单位。经测定，Fl基因重组原核表达蛋白12. 67ng/ml为I个活性单位，F2基因重组原核表达蛋白70. 25ng/ml为I个活性单位。以上结果证明，Fl基因重组原核表达蛋白其活性、表达量都高于F2，其为所要筛选的目的vNGF活性多肽。本发明所述蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法，其有益效果是本发明通过对蛇毒神经生长因子氨基酸和核苷酸同源性分析，发现其变异点主要集中在441位点、541位点和555位点。并以此为基础确定以sputa NGF为模板进行了功能区域的断点分析，提出以sputa NGF为模板，通过基因重组构建2个组蛋白标记的融合蛋白质作为研究模型的不同多肽刺激物的设计方案，研究蛇毒神经生长因子多肽的活性，以进行筛选。对sputa NGF的应用基础研究提供分子生物学支持。以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方 式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
权利要求
1.蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤 一、融合蛋白质的构建选择活化的重组蛇毒神经生长因子，以vNGF为模板，进行功能区域断点分析，然后通过PCR引物法构建至少两个不同长度、不同组合的片段序列，并作标记； ニ、质粒表达系统的构建将上述片段序列分别组装在pBluscriptll SK+质粒中，构建vNGF的转移载体，并使其在DH5a中克隆，形成活性多肽质粒转移系统，然后利用单ー酶切点的黏性末端连接方法将具有相同黏性末端的至少两个不同长度的基因片段和目的片段连接，分别组装在PQE30质粒的BamHI和HindIII酶切位点之间，克隆并表达vNGF的活性多肽； 三、通过6X组氨酸回收提纯技术进行分离、鉴定、提纯，形成vNGF活性多肽的刺激物原 液； 四、验证原核表达vNGFP片段的生物活性，进行多肽筛选。
2.如权利要求I所述蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法，其特征在于 所述片段序列为2个，分别为vNGF Fl片段，对应20-388基因位点，计369bp ；vNGF F2片段，对应389-751基因位点，计363bp。
3.如权利要求I所述蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法，其特征在于 所述验证原核表达vNGF片段的生物活性的方法为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤培养检测法。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法。其包括利用sputa NGF(vNGF)为模板构建融合蛋白质；通过pBluscriptIISK+和pQE30构建质粒表达系统；通过6X组氨酸回收提纯技术进行分离、鉴定、提纯，形成vNGF活性多肽的刺激物原液；验证原核表达vNGFβ片段的生物活性。本发明以sputa NGF为模板进行了功能区域的断点分析，提出以sputa NGF为模板，通过基因重组构建2个组蛋白标记的融合蛋白质作为研究模型的不同多肽刺激物的设计方案，研究蛇毒神经生长因子多肽的活性，以进行蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选，并对sputa NGF的应用基础研究提供分子生物学支持。
文档编号C12N15/63GK102816766SQ20121013854
公开日2012年12月12日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者徐军, 吴鹏, 祁荣, 张忠 申请人:沈阳医学院