专利名称：一种新的肝癌分子标志物视黄酸受体应答蛋白2的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症防治领域，尤其涉及视黄酸受体应答蛋白2及其C末端活性片段在癌症防治中的应用。
背景技术：
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界最常见，且最具危害性的癌症之一，位列世界第五大常见癌症，以及第三大常见癌症相关死因，仅次于肺癌和胃癌。肝癌细胞生长极为活跃，侵袭性强，易侵犯包膜和血管，由于肝内有丰富的血窦，因此肝内转移最为常见，多数患者早期即可有肝内转移。肝癌细胞侵犯门静脉分支形成癌栓，肝癌伴有 门静脉癌栓被认为是预后差的主要指标之一。肝外转移以血行转移为主，多见于晚期病人，肺为HCC肝外最常见的转移器官，其次为骨，肾上腺，肾，脑等。肝癌的高转移率，是肝癌预后较差的重要原因。因此，研究肝细胞癌的转移及恶化机制，发展有效的治疗策略，是当前刻不容缓的任务。Chemerin,亦名为 tazarotene-induced gene 2 (TIG2),或 retinoic acidreceptor responder 2 (RARRES2,视黄酸受体应答蛋白2),最早被鉴定为存在于银屑病皮损中的一个新的类维生素A应答基因。后来，它被鉴定为孤儿G蛋白偶联受体chemokine-like receptor I (CMKLR1,也称ChemR23)的一个分泌型配体，首次揭不了它的生物学功能。之后更多的研究表明，chemerin还是另外两个受体chemokine (C_C motif)receptor-like (CCRL) 2 和 G protein-coupled receptor (GPR) I 的配体。不过，这两个受体在哺乳类动物中的功能还不是很清楚。chemerin通常以ー种活性微弱的前体形式(prochemerin)被分泌出细胞，需要将C端的数个氨基酸剪切掉，成为活性形式，激活它的受体ChemR23。由于不同的酶的识别和剪切序列不尽相同，因此可得到chemerin-154,155,156,157等多种形式(对应着C末端的9,8,7,6个氨基酸被剪切掉)的活性chemerin。据文献报道,chemerin-157的C末端,尤其是第149-157位的九肽(chemerin-9),对于chemerin受体的激活是非常关键的，chemerin-9保留了 chemerin-157的绝大部分激活受体的活性。涉及先天性免疫和后天性免疫的许多种细胞都表达chemerin受体CMKLRl，目前，已知chemerin扮演着趋化因子的角色，将这些细胞招募到淋巴器官和组织受损处。此外，研究报道chemerin的表达和分泌在脂肪细胞分化过程中显著升高。而且，在细胞模型中，chemerin或者CMKLRl表达的丧失几乎完全阻止了脂肪细胞的生成，并且改变了糖脂代谢中重要基因的表达，包括GLUT4, DGAT2, Ieptin和adiponectin。这些研究揭不chemerin不仅是一个趋化因子，还扮演着脂肪细胞因子的角色。虽然目前在免疫、心血管疾病及代谢疾病等方面都对chemerin进行了研究并有相关报道，但是，对它在肿瘤方面的作用和机制鲜有报道。这正是我们这项发明中所要阐述的
发明内容
本发明第一方面提供视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。本发明第二方面提供视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抑制患者癌细胞转移能力的药物中的应用。本发明第三方面提供视黄酸受体应答蛋白 2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用。在一具体实施例中，所述抗肿瘤血管生成包括抑制癌症发生、发展和/或转移过程中的血管生成。本发明第四方面提供一种用于癌症预后的诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于检测样品中的视黄酸受体应答蛋白2水平的试剂。本发明第五方面提供能检测视黄酸受体应答蛋白2的试剂在制备用于癌症诊断的试剂盒中的应用。本发明第六方面提供视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抑制Akt信号通路的药物中的应用。本发明还包括视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抑制VEGF的mRNA及蛋白水平的药物中的应用。在一具体实施例中，所述视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2的编码序列或其相关多肽或含有所述编码序列的多核苷酸构建物通过抑制VEGF启动子的转录活性，从而下调其mRNA的水平。本发明还包括视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽或其激动剂、视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备促进Ml巨噬细胞的分化的药物中的应用。在一具体实施例中，Ml巨噬细胞的分化生成抑癌的微环境，从而实现癌症的抑制和/或治疗。本发明中，视黄酸受体应答蛋白2选自(I) SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列；或(2)在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加ー个或几个氨基酸且保留SEQ ID NO 2的生物学活性或功能的氨基酸序列。本发明中，视黄酸受体应答蛋白2的编码序列的一个例子如SEQ ID NO 1所示。本发明中，视黄酸受体应答蛋白2包括C末端被截短了 I 一 10个氨基酸的截短的视黄酸受体应答蛋白2。在一具体实施例中，用于本发明上述各种方法或用途的视黄酸受体应答蛋白2如SEQ ID NO: 2的第21-157位(SEQ ID NO: 49)所示，或如SEQ ID NO: 2第21 — 156位、第21 — 155位或第21 — 154位氨基酸所示。本发明也包括在截短的视黄酸受体应答蛋白2中经过取代、缺失或添加ー个或几个氨基酸且保留该截短的视黄酸受体应答蛋白2的生物学活性或功能的氨基酸序列。本发明中，视黄酸受体应答蛋白2相关多肽选自( I)视黄酸受体应答蛋白2的C末端活性片段或其活性变异体；(2)含有(I)所述C末端活性片段或其活性变异体的多肽；和(3)在(I)- (2)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加ー个或数个氨基酸且保留(I) - (2)所述的氨基酸序列的生物学活性或功能的氨基酸序列。本发明中，视黄酸受体应答蛋白2的C末端活性片段包括含有YFPGQFAFS的C末端活性片段，其长度可在9 一 20个氨基酸残基。示例性的C末端活性片段包括但不限于SEQID NO:25 一 30和41所示的那些片段。、
本发明C末端活性片段的活性变异体包括YFPGQFAFS的变异体以及含有YFPGQFAFS的C末端活性片段的变异体。具体而言，所述变异体包括在YFPGQFAFS中或在含有YFPGQFAFS的C末端活性片段中经过取代、缺失、添加或化学修饰ー个或数个氨基酸残基且保留YFPGQFAFS或含有YFPGQFAFS的C末端活性片段的生物学活性或功能的变异体。示例性的变异体包括但不限于X1X2PGqFAFX9 (SEQ ID N0:48)，其中，X1和X2任选为芳香族残基或疏水残基，X9为丝氨酸残基或C末端羧基中的羟基被氨基取代的天冬氨酸残基(D-CONH2)tj示例性的变异体包括但不限于SEQ ID N0:24、26、31 — 40和42_47所示的氨基酸序列。本发明还包括含有所述C末端活性片段或其变异体的能结合chemerin的受体ChemR23的多肽。这类多肽包括但不限于，例如SEQ ID NO:2第1-157位中含有YFPGQFAFS的长20 — 156个氨基酸残基的多肽。本发明中，含有所述编码序列的多核苷酸构建物可以是ー种表达载体，其可表达视黄酸受体应答蛋白2或其相关多肽。本发明中，所述癌症选自甲状腺癌，胰腺癌，乳腺癌，头颈部鱗状细胞癌，肝癌皮肤鳞状细胞癌，肾上腺皮质癌或前列腺癌等，优选肝癌。本发明中，所述试剂盒可包含特异性结合视黄酸受体应答蛋白2编码序列或其受体的核苷酸引物。所述核苷酸引物的例子包括，例如针对视黄酸受体应答蛋白2编码序列的引物SEQ ID N0:3和4，和针对受体ChemR23的引物序列SEQ ID N0:5和6等。或者，试剂盒中可含有特异性结合视黄酸受体应答蛋白2的试剂，例如视黄酸受体应答蛋白2的特异性抗体等。本发明的试剂盒还可包括指导进行癌症诊断的说明书。
图IA显示，通过实时PCR，检测单克隆化的、具有不同转移能力的MHCC97细胞中chemerin的表达水平,表示为单克隆化的细胞(M, H, L)分别与原初细胞chemerin (P)表达的比值，M、H和L三株单克隆化的细胞在体内的转移能力依次降低。图IB显示，通过实时PCR，检测了 46对配对的正常肝组织和肝癌组织中chemerin的mRNA表达，表示为肝癌组织(T)与相应的正常肝组织(N)的Log2 (T/N)。
图2A、2B、2C和2D分别代表了组织芯片的chemerin染色的4种情况，分别对应于评分0,1,2,3。0表不检测不到信号，I表不信号较弱，2表不信号明显,较强,3表不信号很強。图2E显示，结合临床病理信息，对组织芯片的结果进行了分析，chemerin的表达与患者的生存期存在显著正相关(P#=0. 000333)。图2F显示，如果将“0，I”统ー划为“0”级，把2，3统ー划为“I”级，结合临床病理信息，对组织芯片的结果重新进行分析，则chemerin的表达与患者的生存期之间的正相关性更为显著(P#=0. 0000724)。图3显示通过Boyden小室检测,检测了 chemerin对肝癌细胞转移能力的影响。A,7404 细胞，7404/v 代表对照细胞，7404/chemerin L, 7404/chemerin M 和 7404/chemerin H分别代表chemerin的表达量渐次升高的3个单克隆；B,分别感染了对照病毒和chemerin表达病毒的PVTT-I和C，MHCC97H细胞的pool,其中，PVTT-I con和MHCC97H con为对照细胞，PVTT-I chemerin 和 MHCC97H chemerin 为高表达 che merin 的细胞；D, SK-Hep-1/v为对照细胞，SK-Hep-l/chemerin L 和 SK-Hep-l/chemerin H 为 chemerin 表达量不同的两个阳性克隆；E, 7404/chemerin H icon为感染了对照病毒的细胞，而7404/chemerin H il和7404/chemerin H i2为感染了含有不同RNAi target序列的细胞；F,通过RNAi,下调了 HepG2细胞中chemerin的表达，其中，HepG2 chemerin icon为感染了对照病毒的细胞，HepG2 chemerin il, HepG2 chemerin i2, HepG2chemerin i3 分别代表感染了包含 3 条不同的RNAi target序列的病毒的细胞。图4A显示Western Blot的结果，该结果显示了在7404 (左)和PVIT-1 (中)肝癌细胞中，对照细胞和高表达chemerin的细胞中Akt的磷酸化水平(Ser473),右则显示了在通过RNAi将chemerin的表达敲低的HepG2细胞中，Akt磷酸化水平的变化。图4B显示，使用I nM的具有活性的chemerin重组蛋白对7404细胞进行处理,通过Western Blot检测了 Akt磷酸化水平的变化。图5A显示了半定量PCR的结果，显示了在7404 (左)，PVIT-1 (中)和MHCC97H(右)肝癌细胞中，对照细胞和高表达chemerin的细胞中VEGF的mRNA水平，包括VEGF165和VEGF121这两个异构体。图5B显示了 Western Blot的结果，显示了在7404 (左)，PVIT-I(中)和MHCC97H (右)肝癌细胞中，对照细胞和高表达chemerin的细胞中VEGF的蛋白水平，包括55kDa附近的同型ニ聚体，以及17kDa附近的单体。图5C显示了小管形成实验(Tubeformation assay)的结果，分别使用来自 7404/v, 7404/chemerin, PVTT-I con, PVTT-Ichemerin,MHCC97H con,MHCC97H chemerin细胞的条件培养基(conditioned medium,CM),通过小管形成实验检测了来自对照和高表达chemerin的肝癌细胞的CM对HUVEC (人脐静脉内皮细胞)细胞体外血管形成能力的影响。图6显示通过Boyden小室检测了 chemerin对肝癌细胞转移能力的影响的结果。其中A, SK-Hep-I con 为对照细胞，SK-Hep-I/chemerin L 和 SK-Hep-l/chemerin H 为chemerin表达量不同的两个阳性克隆(见C) ;B, 7404/chemerin H icon为感染了对照病毒的细胞，而7404/chemerin H il和7404/chemerin H i2为感染了含有不同RNAi靶序列的细胞；C,通过Western Blot检测了在过表达chemerin的SK-Hep-I细胞克隆中，以及chemerin被knockdown的7404/chemerin H细胞克隆中，标注分子的表达变化。图7 显示，分别使用来自 A，SK-Hep-I con 和 SK-H印-1/chemerin 和 B，7404/chemerin H icon, 7404/chemerin H iI, 7404/chemerin H i2 细胞的条件培养基(CM),通过小管形成实验，检测了来自对照和高表达chemerin/chemerin表达被抑制的肝癌细胞的CM对HUVEC细胞体外血管形成能力的影响。图8A将PVTT-I con及PVTT-1 chemerin细胞对6周大的裸鼠分别进行左心室注射，利用IVIS-imagingsystem，监测标记了荧光素酶的PVTT-1细胞的体内转移情況。图8A中显示了第0天(注射后立即检测)、第14天和第28天的情况；图SB显示了肝脏注射的結果，分别从正面和背面显示了 PVTT-1 con组和PVTT-1 chemerin组中具有代表性的小鼠肝脏，白色实线箭头所指为注射处形成的原发灶，白色虚线箭头所指为表面可见的癌灶(foci);图8B还显示分别对应于PVTT-1 con组小鼠(上)和PVIT-I chemerin组小鼠(下)的肝脏切片进行的札E.染色；图8C显示，对PVTT-1 con组和PVTT-1 chemerin组的小鼠的注射叶表面可见的癌灶(左)和非注射叶的表面可见的转移的癌灶(将这些癌灶定义为肝内转移灶)的计数统计。图9显示，通过实时PCR，对已分化为巨噬细胞，并经过PVIT-I con和PVIT-I chemerin细胞的条件培养基处理的已分化为巨噬细胞的THP-I细胞进行分析，包括Ml型巨 噬细胞的标记分子TNF-alpha (A)，IL_12a (B)，IL_6 (C)的表达，以及M2型巨噬细胞的标记分子CCL24 (D)的表达。Control为阴性对照，LPS刺激为阳性对照(见“材料与方法”)。图10 显不，利用 AKTA purifer 和 Q Sepharose FF, SP Sepharose FF 纯化得到的chemerin蛋白(电导率曲线反映溶液中离子浓度的变化);B，使用纯化得到的蛋白进行长时处理，通过Western Blot检测Akt磷酸化水平的变化。图11显示，利用肝内注射荧光标记的PVTT-I细胞原位成瘤，使用chemerin进行处理，以探索chemerin对肝癌的治疗潜力。A, PBS对照组和chemerin处理组的生存曲线(n=10，数据截止处理第6周，虚线代表PBS对照组，实线代表chemerin处理组));B，PBS对照组和chemerin处理组的平均体重曲线，从第I天(以第一次腹腔注射蛋白为第I天)开始測定，每隔四天称量一次，直至第33天，结果以平均数土标准误(n=10)，实心框线代表PBS对照组，空心框线代表chemerin处理组。图12显示,通过Boyden小室检测,检测细胞外活性形式的chemerin对肝癌细胞迁移能力的影响。A :分别对7404和PVTT-I细胞使用IOnM的活性形式的重组chemerin进行预处理(0. 5h)，在实验的过程中(7404 8h, PVTT-1 :6h)，每隔2h分别在对照孔中加IulPBS,在chemerin处理的孔中加IuL IOOxchemerin,以保持chemerin的持续作用；B :对7404/chemerin H 细胞分别使用 lug/ml 和 10ug/ml 的 chemerin 抗体(R&D, Cat. No :AF2324,配制于PBS中)进行预处理(0. 5h)，然后进行Boyden小室检测，在对照组中，以相同浓度的正常羊IgG作为对照(抗chemerin抗体是羊来源的)。图13显示,在7404/chemerin H中分别转入空载体和表达持续活化形式的Akt的CA-Akt,然后，A :和7404 con细胞一起进行Boyden小室检测；B :通过Western blot对CA-Akt的转入进行鉴定。HA表明外源CA-Akt的表达，GSK_3beta为Akt的下游靶标，p-GSK-3beta (Ser9)的水平上升表明Akt下游通路的激活。图14显示，使用包含人VEGF启动子的荧光素酶报告基因载体，通过双荧光素酶报告基因测试(Dual luciferase reporter assay),检测chemerin对VEGF启动子的转录活性的影响。A、B、C分别为在三种不同的肝癌细胞系7721，Huh7和7404中的結果。图15显不，通过Boyden小室分析检测了 chemerin-9和chemerin对7404细胞迁移能力的影响。分别使用IOnM chemerin-9和活性形式的重组chemerin对细胞进行预处理(0. 5h),在检测过程中(8h),姆隔2h在对照孔中加Iul PBS,在chemerin-9和chemerin处理的孔中分别加入Iul IOOx原液，以保持chemerin-9和chemerin的持续作用；B,分别使用InM的chemerin-9和活性形式的重组chemerin对7404细胞进行处理，2h后收取样品，通过Western Blot检测Akt磷酸化水平的变化(左),右为对Western Blot结果的辉度扫描定量图。
具体实施例方式用于本发明的chemerin包括含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列(其中，第I 一20位为信号肽)的多肽及其保留chemerin生物学活性的活性片段。本发明的chemerin还包括具有与chemerin蛋白相同功能的、SEQ ID N0:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加ー个或数个(通常为20个以内，较佳地为I 0个以内，更 佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。下表显示了代表性的氨基酸取代。
权利要求
1.具有抗癌活性的多肽在制备治疗或预防癌症的药物中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中含有(1)YFPGQFAFS ;或 (2)在YFPGQFAFS中经过取代、缺失、添加或化学修饰ー个或数个氨基酸残基且保留YFPGQFAFS的生物学活性或功能的变异体。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，所述YFPGQFAFS的变异体为AAPGQFAFXg，其中，X1. X2为芳香族残基或疏水残基，X9为丝氨酸残基或C末端羧基中的羟基被氨基取代的天冬氨酸残基(D-CONH2)15
3.如权利要求I 2中任ー项所述的应用，其特征在于，所述YFPGQFAFS的变异体选自AFPGQFAFS、YAPGQFAFS、YFAGQFAFS、YFPAQFAFS、YFPGAFAFS、YFPGQAAFS、YFPGQFAAS、YFPGQFAFA、LFPGQFAFS、IFPGQFAFS、FLPGQFAFS、YLPGQFAFS、YVPGQFAFS、YFPGQFAFD-C0NH2、QRAGEDPHSFYFPGQFAF 或 FPGQFAFS。
4.如权利要求I 3中任ー项所述的应用，其特征在于，所述多肽选自(1)YFPGQFAFS、AFPGQFAFS、YAPGQFAFS、YFAGQFAFS、YFPAQFAFS、YFPGAFAFS、YFPGQAAFS、YFPGQFAAS、YFPGQFAFA、LFPGQFAFS、IFPGQFAFS、FLPGQFAFS、YLPGQFAFS、YVPGQFAFS、YFPGQFAFD-C0NH2、QRAGEDPHSFYFPGQFAF 或 FPGQFAFS ； (2)SEQID NO:2所示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO: 2中经过取代、缺失、添加或化学修饰ー个或数个氨基酸残基且保留SEQ ID NO:2的生物学活性或功能的氨基酸序列；和 (3)SEQID N0:49所示的氨基酸序列，或在SEQ ID N0:49中经过取代、缺失、添加或化学修饰ー个或数个氨基酸残基且保留SEQ ID NO:49的生物学活性或功能的氨基酸序列。
5.编码权利要求I 4中任ー项所述多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
6.如权利要求I 5中任ー项所述的应用，其特征在于，所述多肽用于制备抑制患者癌细胞转移能力的药物。
7.如权利要求I 5中任ー项所述的应用，其特征在于，所述多肽用于制备抗肿瘤血管生成的药物。
8.权利要求I 4中任ー项所述多肽、所述多肽的编码序列或含有所述编码序列的多核苷酸构建物在制备抑制Akt信号通路的药物中的应用。
9.如权利要求I 8中任ー项所述的应用，其特征在于，所述癌症选自甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、皮肤鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌或前列腺癌。
10.如权利要求I 8中任ー项所述的应用，其特征在于，所述癌症为肝癌。
11.ー种用于癌症预后的诊断试剂盒，所述试剂盒包含用于检测样品中的视黄酸受体应答蛋白2水平的试剂。
12.如权利要求11所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性结合视黄酸受体应答蛋白2编码序列或其受体的编码序列的核苷酸引物。
13.如权利要求11所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性结合视黄酸受体应答蛋白2或其受体的抗体。
14.如权利要求11 13中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括指导进行癌症诊断的说明书。
15.能检测视黄酸受体应答蛋白2的试剂在制备用于癌症预后诊断的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的肝癌分子标志物视黄酸受体应答蛋白2，更具体而言涉及一种具有抗癌活性的含有YFPGQFAFS序列或其变异体的多肽。本发明还涉及该多肽在制备治疗或预防癌症的药物中、制备抑制Akt信号通路的药物中的应用。本发明还涉及一种用于癌症预后的检测试剂盒，通过检测对象样品中视黄酸受体应答蛋白2的表达量对癌症患者的生存期进行评估。
文档编号C12Q1/68GK102772782SQ20121013821
公开日2012年11月14日 申请日期2012年5月7日 优先权日2011年5月6日
发明者刘将, 印宏坤, 李晶晶, 谢东 申请人:中国科学院上海生命科学研究院