专利名称：玉米内州萎蔫病菌的pcr检测方法及检测用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业和植物检疫技术领域，具体涉及ー种玉米内州萎蔫病菌的检测方法，尤其涉及一种玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法。此外，本发明还涉及检测玉米内州萎蔫病菌的引物。
背景技术：
棒形杆菌属Clavibacter仅包含一种植物病原菌Clavibactermichiganensis(Cm),根据其寄主专化性的不同，分为5个亚种，包括玉米内州萎蔫病菌C. m. subsp. nebraskensis (Cmn)、畨爺细菌性溃场病菌 C. m. subsp. Michiganenis (Cmm),马铃薯环腐病菌 C. m. subsp. sepedonicus (Cms),苜猜萎蔫病菌C. m. subsp. insidiouss (Cmi),玉米内州萎蔫病菌Cmn和小麦花叶病菌C. m. subsp. tessellarius (Cmt) (Eichenlaub etal. 2006)。它们均可引起重要的植物病害，EPPO将Cmm、Cms和Cmi列为检疫性有害生物， 而我国将Cmn、Cmm、Cms和Cmi同时列入检疫性有害生物名录。玉米内州萎蔫病菌Cmn又名密执安棒形杆菌内布拉斯加亚种，隶属于厚壁菌门Firmicutes,厚壁菌纲Firmibacteria,棒型杆菌属Clavibacter。1969年，美国内布拉斯カロ州首次发现该病菌引起的玉米内州萎蔫病(Goss’s bacterial wilt and leaf blightof corn) (Vidaver and Mandel, 1974)。至1972年,该病害已扩展至邻近5个州。近年来随着转基因品种的推广，病害蔓延至美国中西部各玉米种植区，包括内布拉斯加州、堪萨斯州、南达科他州、科罗拉多州、怀俄明州、密歇根州、威斯康幸州、爱荷华州、伊利诺斯州、印第安那州(Ruhl et al. 2009)、明尼苏达州(Malvick et al. 2010)、德科萨斯州(Korus etal. 2011)及加拿大安大略省、曼尼托巴省(Agarkova et al. 2011),成为北美地区玉米生产上的严重病害。玉米内州萎蔫病菌Cmn可危害马齿玉米、甜玉米、硬粒玉米、爆玉米、狗尾草、稗草和甘鹿。Cmn可随种子传播(Biddle et al. 1990),而且我国大部分玉米种植区适合病害发生(陈宴等.2009)。病菌一旦传入定殖，容易暴发造成病害流行，且病害防治难度大。我国玉米产量和种植面积均居世界第二，在国民经济中占有重要地位。2011年，仅饲用玉米我国每年进ロ量已达数百万吨。因此，病菌传入我国并扩散传播的潜在风险巨大。目前，国内尚未见进境玉米样品中Cmn检测的报道，准确快速实用的微量病菌检测方法具有十分重要的潜在应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一方面，提供一种玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法，包括如下步骤(I)设计引物，该引物的序列为
PSM I :5，-cctttccgtcgtcctttc-3’ (SEQ ID NO. I)或其互补链；CM3 :5，-gcatccaccgtttgctct-3，(SEQ ID NO. 2)或其互补链;(2)玉米样品(或玉米种子样品)中细菌DNA提取；(3)采用步骤(I)设计的引物进行PCR检测。步骤(2)中，所述玉米样品中细菌DNA提取具体为玉米样品混匀后放入PBS缓冲液(PH7. 2)中，4°C浸泡过夜；过滤，滤液离心弃上清，沉淀用试剂盒提取DNA。步骤(3)中，所述PCR检测的反应体系为25yL，包括2. 5 μ L
10X PCRbufTer(Mg2+Plus)，2. 5μ L dNTP(各 250 μ M)，步骤(I)上下游引物各 I μ L(IOOpM),2μ L模板DNA、I. 5U Taq聚合酶(5U/μ L)，加水补至25 μし 步骤(3)中，所述PCR检测的反应程序为94°C预变性3min ;然后以94°C 30s，63°C 30s, 72°C 30s扩增35个循环；最后72°C延伸5min。在本发明的另一方面，提供一种用于检测玉米内州萎蔫病菌的引物，其序列为PSMl :5，-cctttccgtcgtcctttc-3J (SEQ ID NO. I)或其互补链；CM3 :5，-gcatccaccgtttgctct-3，(SEQ ID NO. 2)或其互补链。为了针对性检测玉米样品中Cmn,本发明根据GenBank中Cmn及其相关种间16S-23S序列差异，设计引物PSM1/CM3特异性检测玉米样品中Cmn，建立了 Cmn的PCR检测方法。试验结果表明，引物PSM1/CM3可特异性检测Cmn，且检测的灵敏度很高，该引物能扩增供试的4株Cmn菌株获得208bp的预期产物，供试的36株相关菌株都不能扩增出预期条带。对不同系列稀释度Cmn的DNA和菌悬液进行PCR检测灵敏度测试，结果表明引物PSMl/CM3的检测灵敏度为4pg的DNA或680CFU目标细菌；玉米样品的检测试验表明这种PCR方法可用于进境玉米样品中Cmn的快速检测。
图I是本发明实施例中PCR的检测灵敏度结果示意图；其中，图IA是玉米内州萎焉病菌菌悬液检测灵敏度电泳图，图IB是玉米内州萎焉病菌DNA检测灵敏度电泳图。图2是本发明实施例中引物PSM1/CM3检测玉米样品的PCR检测电泳图。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，或按制造厂商建议的条件。I材料方法I. I供试玉米样品和菌株供试玉米样品为美国进ロ饲用玉米，编号1058，进境时间为2011年7月。供试菌株共计40株,包括4株Cmn,菌株除来源于ATCC (American type culturecollection,美国典型菌种保藏中心)和 NCPPB (The national collection of plantpathogenic bacteria,英国植物病原细菌保藏中心)タト，宁波、甘肃和天津出入境检验检疫局、云南农业大学、中国检验检疫科学研究院和山西省农科院等単位提供部分试验菌株，另有10株从进境饲用玉米样品上分离的革兰氏阳性菌菌株。供试菌株及其来源详见表I。 表I供试菌株和PCR检测结果
Table I Isolates used in the test and the result of PCR reaction
Isoi it、Collection no.PCR reaetion
ATCC27822+
ATCC27794 + Ciavibacier michmanemis subsp. nebraskense--；-
ATCC27795a+
NCPPB2578h+
ATCC44501'-
Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis ATCCl 1456c—
NCPPB297911—
ATCC!0253C_
Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus ----
INCPPB83b—
CM20C — Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ----—-
,ATCC33566—
Clavibacter michiganense subsp. tessellarius ----
INCPPB366511一
ATCC29231—
Pantoea stewartu subsp. stewartiiATCC8199—
ATCC 謂)-
ATCC51785—
Pantoea. stewartii subsp. indoloQenes--
ATCC35396—
权利要求
1.一种玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)设计引物，该引物的序列为 PSMl :5，-cctttccgtcgtcctttc-3’ (SEQ ID NO. I)或其互补链； CM3 :5，-gcatccaccgtttgctct-3，(SEQ ID NO. 2)或其互补链； (2)玉米样品中细菌DNA提取； (3)采用步骤(I)设计的引物进行PCR检测。
2.如权利要求I所述的玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法，其特征在于， 步骤(2)中，所述玉米样品中细菌DNA提取具体为玉米样品混匀后放入PBS缓冲液中,4°C浸泡过夜；过滤,滤液离心弃上清,沉淀用试剂盒提取DNA。
3.如权利要求I所述的玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR检测的反应体系为25μ L，包括2. 5μ L IOXPCR buffer，2. 5 μ LdNTP，步骤(I)上下游引物各luL、2yL模板DNA、1.5U Taq聚合酶，加水补至25 μ L。
4.如权利要求I或3所述的玉米内州萎蔫病菌的PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR检测的反应程序为94°C预变性3min ;然后以94°C 30s, 63°C 30s, 72°C 30s扩增35个循环；最后72°C延伸5min。
5.一种用于检测玉米内州萎蔫病菌的引物，其特征在于，其序列为 PSMl :5，-cctttccgtcgtcctttc-3J (SEQ ID NO. I)或其互补链； CM3 :5，-gcatccaccgtttgctct-3J (SEQ ID NO. 2)或其互补链。
全文摘要
本发明公开了一种玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(Cmn)的PCR检测方法及检测用引物，根据Cmn不同亚种间16S-23S序列差异，设计特异性引物PSM1(5’-cctttccgtcgtcctttc-3’)/CM3(5’-gcatccaccgtttgctct-3’)，建立了Cmn的PCR检测方法。该方法的检测灵敏度为4pg菌体DNA或680CFU目标细菌，进境玉米样品的检测试验表明这种PCR方法可用于进境玉米样品中Cmn的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102816835SQ20121013780
公开日2012年12月12日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者易建平, 叶露飞, 周国梁, 杨赛军 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局