专利名称：一种提高植物耐盐性的棉花耐盐基因GarCIPK的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，是ー种提高植物耐盐性的棉花ぬァ677况基因。
背景技术：
土壤盐溃化是当今全球性的资源环境问题和生态问题。据统计，全世界约有10亿公顷的土地存在不同程度的盐溃化，占世界陆地总面积的约10%，而我国就有近一亿公顷盐溃化土地，随着经济的发展，エ业污染的加剧，不合理的灌溉和化肥施用不当等原因，次生盐溃化土壤面积在逐年扩大，使农业可持续发展受到严重阻碍。改良利用、综合治理盐溃土，培育耐盐新品种以提高植物耐盐性已成为发展未来农业及环境治理的重大课题。因此，探讨盐适应机理、挖掘耐盐功能基因、培育耐盐新品种以提高植物抗盐性具有重要的理论意义。利用转基因技术将具有优良性状的基因转入植物中，以此开发高效的转基因新品种具有广阔的应用前景。ー些研究已表明将植物本身及其他植物中耐盐相关基因转入植物中，通过转录表达可以提高转基因植物的耐盐性。CIPK与CBL有效结合形成CBL-CIPK复合体，参与Ca2 +信号系统应答逆境胁迫，将信号传递到終端调控下游的胁迫相应基因的表达，最終使植物体内某种胁迫达到平衡。目前，已鉴定出部分CBL-CIPK信号系统的成员，并在一些模式植物的研究中解析了该信号网络在植物应答逆境胁迫的功能，但棉花中的相关研究较少。
发明内容
本发明提供一种提高植物耐盐性的棉花蛋白磷酸激酶CIPK类蛋白基因GarCIPK,所述基因cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述的提高植物耐盐性的棉花ぬァ677况基因编码的蛋白质，具有序列表中SEQ IDNO. 2所述的氨基酸序列。本发明提供了含有上述棉花蛋白磷酸激酶基因ぬァ677况的植物表达载体pCAMBIA2301。将棉花蛋白磷酸激酶基因GarCIPK克隆到pCAMBIA2301，获得pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK 和 pCAMBIA2301_RD29A_GarCIPK。本发明所述基因在培育耐盐植物中的应用。所述植物优选是烟草。本发明的有益效果利用现有的植物基因工程技术，利用电子克隆及RT-PCR技木，分离与鉴定棉花耐盐相关基因序列信息，并通过根瘤农杆菌介导法将基因转入烟草，经过耐盐表型鉴定证明转基因植株的耐盐カ明显提高。
图I GarCIPK基因全长cDNA序列的扩增结果
图2、3实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)分析盐处理不同时期ぬァ677况基因在叶片和根中的表达情况
图 4 植物表达载体 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK 和 pCAMBIA2301- RD29A_GarCIPK的构建
(a)大肠杆菌pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK PCR检测电泳结果；(b)大肠杆菌pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK PCR 检测电泳结果；(c)pCAMBIA2301-CaMV35S_GarCIPK 的酶切鉴定；(d) pCAMBIA2301 -RD29A-GarCIPK 质粒酶切鉴定图5转基因植株的PCR鉴定
(a)PCR扩增载体pCAMBIA2301-CaMV35S-CIPK抗性烟草目的基因；(b) PCR扩增载体pCAMBIA2301-RD29A-CIPK抗性烟草目的基因
图6转基因烟草及野生型对照在不同浓度NaCl处理下的生长
(а)、(b)、(c):生长在含不同浓度NaCl的MS培养基上
图7根系长度的測量NaCl条件下，25° C培养第10天的根长表现。此图表示OmM、150mM和200mM NaCl条件下野生型和转基因株系萌发率的统计分析
具体实施例方式
实施实例I、ぬァ677况基因的获得 I. I RNA的提取 提取RNA
(1)取O.5g新鲜棉花组织，加入O. Ig交联聚こ烯砒咯烷酮(PVPP)，在液氮中充分研磨至粉末，将冻粉末迅速转入IOml离心管中，加5ml CTAB提取液与500 μ LO. IM ρΗ8. O的Tris-HCl，65°C水浴20min，中途翻转混匀；
(2)加等体积氯仿充分混匀，冰浴静置IOmin；
(3)4 °C, IOOOOrpm 离心 20min。分装于 4 个 I. 5ml 离心管；
(4)吸上清，加入1/3体积的8MLiCl混匀，-700C 30min或_20°C过夜；
(5)4°C, IOOOOrpm离心20min。弃上清，70%こ醇洗涤两次后，吹干沉淀溶解于30 μ LDEPC 水；
(б)加入IOU 无 RNase 活性的 DNase 和 25U RNase Inhabitor, IOXbuffer 消化 30min后加等体积氯仿，抽提一次；
(7)上清转移到新管中，加1/10体积的3MpH 5. 2 NaAc和等体积的异丙醇或2. 5倍体积的无水こ醇，_20°C放置过夜或_70°C冰浴3h ；
(8)4°C, IOOOOrpm离心20min，弃上清，70%こ醇洗涤两次后溶解于30 μ L DEPC水。即得棉花RNA。I. 2 cDNA 的合成 体系
cDNA第一链的合成
模板(上述无DNA污染的RNA IOOng) 6 yL OligdT 通用引物(50 μ M)I μ L
dNTP (IOmM)2 yL
RNase 抑制剂(40U/ μ L )O. 5 μ LDEPC 水6 μ L
65 ° C (10 min)—冰上放置(2 min)
M-MLV (反转录酶，takara, 200U μ L )O. 5 μ L
5Xbuffer4 μ L
42 ° C (2h)— 70 ° C (IOmin) — 4 ° C I. 3 cDNA 克隆
根据本实验室旱地棉转录组测序获得的约576bp蛋白磷酸激酶特异序列(SEQ IDNO. 9)为探针，利用电子克隆的方法，NCBI在线分析获得一系列同源EST (NP_851258. 2、BABl 1035. UABF99892. UAAB65477. UAAA02840. UAAB65483. KAAMl3129. UAAM60822. I、 AAP68289. I)。拼接序列，经基因预测，然后用软件ORF FinderChttp://www. ncbi. nlm. nih.gov/gorf /gorf. html)预测完整 ORF。在ORF 序列两侧设计上游引物 5’- GATGGTG GTGAGA AAAGTAGGGAA GTA-3’ ( SEQID NO. 3)和下游引物 5’- CAGGTCAACGT- CTTTTA CTCCTAGA - 3，(SEQ ID NO. 4)，用旱地棉cDNA(由步骤I. 2合成的)进行RT-PCR，得到包含整个编码框的GarCIPK cDNA克隆，全长1350bp (图I)。回收该片段，克隆至T-载体中鉴定、測序。测序结果经Blast比对，证明所扩序列正确，与电子克隆序列相比，序列相似度为97. 34%。1.3.1 PCR 反应体系(20 μ L)
cDNAI μ L
10XPCR buffer2μ L
MgCl2 (10mmol/L)I. 6 μ L
IOmM dNTP0. 4 μ L
Primerl (10 μ Μ)IuL
Primerl (10 μ Μ)IuL
rTaqO. 2 μ L
ddH2012. 8μ L
1.3.2PCR 扩增程序94°C 5min ；94°C 30sec, 55°C 45sec, 72 °C I min30sec,36 个循环；72°C 10 min ;4°C保温。C、扩增得到该基因的ORF序列，回收扩增产物，并克隆到PTG19-T载体，筛选阳性克隆，测序由上海英俊公司完成。1.4基因表达分析(qRT-PCR)
I.4. I盐胁迫下RNA的提取
材料棉属野生种旱地棉，将旱地棉种子播于盆钵中，待长至约20cm的小苗从土中取出，洗去根上的泥土，将苗浸在含200 mM NaCl溶液(其中CNa+ : Cea2+为15:1)的营养液中，按不同的处理时间处理小苗(0h、lh、3h、6h、12h、24h、36 h、48 h、72h)，分别取叶片、根，提取RNA，方法同上。I. 4. 2 逆转录(RT)产生 cDNA 方法同上。1.4.3 PCR 反应
①以cDNA为模板,引物为GarCIPK-RT-F 5 ‘-CGAAAGCGTTGCCATGAAAGTCCTC-3，( SEQ ID NO. 5)
GarCIPK-RT-R 5 ‘-GCTTCCGCTTCACTAAGACGACCTT-3’ ( SEQ ID NO. 6)
②PCR反应体系
SYBR Premix Ex Taq (2X)10 μ L
GarCIPK-RT-F (10 μ Μ)O. 4 μ L GarCIPK-RT-R (10 μ Μ)O. 4 μ L
ROX Reference Dye 11 (50 X)O.4 μ L
cDNA2· O μ L
ddH206· 8 μ L
③PCR程序
将PCR反应的组分别加于qRT-PCR专用96-孔板(Applied Biosystems)中,カロ盖专用的高透光率封 ロ膜(Applied Biosystems),用 Applied Biosystems 7500 FastReal-Time PCR System)进行 qRT-PCR，采用两步法 PCR 扩增标准程序95 °C 30 sec ；95°C 40 sec,60°C 30 sec 共 40 个循环；95で 15sec，60°C lmin, 95°C 15 sec。每个样品三次重复。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，可以通过溶解曲线分析确认PCR反应大的特异性。计算CT值，结果见图2、3。实施例2、植物表达载体的构建
2.I pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK 植物表达载体的构建
植物表达载体 pCAMBIA2301_CaMV35S (购自 Biovector Science Lab)质粒，选用BamH I和Knp I分别对pCAMBIA2301和目的基因片段进行酶切，回收载体大片段和目的基因片段，用T4连接酶连接后转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，鉴定重组子后即得到带有目的基因的植物表达载体。pCAMBIA2301质粒和目的基因片段的酶切 质粒双酶切体系如下
IOXK buffer5μ L
2301 质粒25 μ L
BamH IO. 5 μ L
Knp IO. 5 μ L
无菌 dd H2O19 μ L
于30°C酶切5h。双酶切后琼脂糖凝胶对双酶切产物进行电泳检测，结果见图3。GarCIPK片段双酶切体系
IOXK buffer5μ L
纯化的GarCIPK PCR产物30 μ L
BamH IIyL
Knp IIuL
无菌 dd H2O13 μ L
30°C 酶切 12h
回收pCAMBIA2301载体大片段和目的基因片段。
2. I. I基因与酶切得到的PCAMBIA2301大片段的连接
连接反应体系
PCAMBIA23015μ L
CIPK片段双酶切产物3 μ L
10X ligase bufferIuL
T4 DNA ligaseIuL
4°C连接过夜或16°C连接2h。2. I. 2转化大肠杆菌
连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，在含Ampl00mg/1的LB液体培养基中37°C振荡培养。2. I. 4重组子的鉴定 ① PCR鉴定
挑取单菌落接种于I. 5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C振荡培养，用GarCIPK基因特异性引物 GarCIPK-F-BamHI :5’ CGCGGATCCGATGGTGGTGAGAAAAGTAGGGAAGTA3’ ( SEQID NO. 7)和 GarCIPK-R-KpnI:5，-GGGGTACCCAGGTCAACGTCTT TTACTCCTAGA-3’ ( SEQ IDNO. 8)进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期片段。PCR反应程序如下94°C5min ; 94°C 30sec, 55°C 45sec, 72°C I min30sec, 36 个循环；72で 10 min ;4で保温。②质粒的酶切鉴定
用碱变性法提取质粒，选取BamH I和Knp I酶进行酶切，酶切体系同上，琼脂糖凝胶电泳检测是否有预期片段。2.2 pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK 植物表达载体的构建
植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S (购自Biovector Science Lab)表达载体含有CaMV35S和NPT II基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶Knp I和Xba I位点。分别用Knp I和Xba I双酶切载体pCAMBIA2301_CaMV35S和RD29A片段，将切除CaMV35S启动子的PCAMBIA2301载体与RD29A酶切片段连接，获得pCAMBIA2301_RD29A载体。再用PCAMBIA2301-RD29A 与 ferCTiT基因片段构建植物表达载体 pCAMBIA2301_RD29A_GarCIPK，方法同上，结果见图4。实施例3、农杆菌感受态的制备与转化
3.I农杆菌EHA105感受态的制备
(1)挑取EHA105单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，28°C，200rpm震荡培养过夜至 0D600 值为 O. 4 ；
(2)以I:100接种于400-500ml LB培养基中(IL三角瓶中)，摇菌至0D600为O. 6-0. 8，冰浴IOmin ；
(3)预冷的50ml离心管中收集菌液,4°C,5000rpm,离心5min ；
(4)弃上清,沉淀用IOml预冷的O.IMCaCl2充分悬浮,4°C, 5000rpm,离心5min ；
(5)加4ml(根据菌体多少而定)预冷含15%0. lmol/L CaC12溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；
(6)分装成100μ L-200 μ L每管，液氮速冻，置于_80°C备用。
3. 2农杆菌EHA105的热激转化
(1)-80°C冰箱中取出感受态，冰上冻融；
(2)分别取1-2μ L重组质粒至ΕΗΑ105热激感受态中，轻打混匀，冰浴5min;
(3)然后用液氮冻8min，再置于37°C5min，；
(4)冰上静置2min后，加入800LB培养液，28°C震荡培养4h；
(5)离心30s，收集菌液，弃去600ml上清，剩下的上清用来重悬菌块，用玻璃棒涂布固体LB培养基平板(含Kan 50mg/L, Rif 50mg/L), 28°C，倒置培养48h。3.3菌体PCR鉴定
菌体PCR方法及程序同上(同步骤2. I. 4)。
实施例4、转化烟草及转基因功能验证 4. I叶盘化法侵染烟草 4. I. I侵染
从烟草幼苗上摘取完全展开的叶片，置于70%こ醇中浸泡lmin，0. 1%的升汞中消毒3min，再用无菌水冲洗4-5遍，无菌滤纸吸干表面的水分后，用灭过菌的剪刀将叶片剪成Icm见方的小块；将剪好的叶片分别放入工程菌液pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK和pCAMBIA2301-RD29A_GarCIPK中侵染5min，期间不停的摇晃菌液，使叶片的伤ロ充分与菌液接触；将叶片上的菌液用无菌滤纸吸干。4. I. 2 共培养
侵染过并吸干表面菌液的叶盘，气孔面朝上，紧靠着放在共培养基上(MS+ 6-BAI. Omg/L+ IAA O. lmg/L)，黑暗处培养 2d。4. 1.3筛选及分化培养
暗培养2d后，转换到筛选分化培养基上(MS+ 6-BA I. Omg/L+ IAA O. lmg/L+ Kan100mg/L+ Cef 400mg/L),每15d换一次筛选分化培养基,至分化出的烟草长至3_5cm时转至生根培养基中。4. I. 4生根培养
将分化至3-5cm的烟草分株切下，转移至生根培养基(1/2MS+ IBA 2. Omg/L)
4. I. 5移栽
当再生植株的根长至5-8cm时，打开封ロ膜炼苗2-3d，将幼苗移栽至盆钵内，移栽后最初的5-10d要罩上透明塑料，保持90%-100%的湿度，并在罩上打些小孔以利于气体交換。移栽的基质以及盆钵均预先消毒。4.2转基因阳性植株鉴定
4. 2. I用CTAB法，提取卡那霉素选择压力下筛选的烟草转化植株
4.2.2PCR鉴定阳性植株PCR扩增转基因植株的基因组DNA为模板，引物用基因特异性引物，PCR反应体系和反应条件同上，结果见图5。4. 3烟草转化系的抗性鉴定
4.3. I播种
选取Tl代烟草转基因种子与野生型种子，用75%的こ醇(v/v)消毒5 min，再用15%的NaClO (v/v)消毒5 min，用无菌水漂洗3_5遍，除净所有残留的NaClO溶液；将消毒的野生型(作为对照)及Tl代纯合体种子分别平铺到l/2MS(K+25mg L_l)及1/2MS播种培养基上，暗培养2-3 d ;然后放置25/28°C，相対湿度70%，每天16hr光照/8hr黑暗的条件下培养。4. 3. 2幼苗耐逆性试验的鉴定
取形态长势基本一致的野生型植株和转基因阳性植株，分成两份，一份分别至含O mMじ1、100 mMじ1和200 mMじ1不同浓度NaCl的MS固体培养基上，于(25±2)で，相対湿度70%，每天16hr光照/8hr黑暗的光照培养箱培养中生长，每个处理至少10株苗。继续培养10天后，观察转基因烟草和野生型烟草幼苗的生长情況。整个生长过程中，MS平板垂直放直。结果见图6、7。
权利要求
1.一种提高植物耐盐性的棉花基因，其特征在于它的序列如SEQ ID NO. I所/Jn ο
2.权利要求I所述的提高植物耐盐性的棉花基因编码的蛋白质，其特征在于它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.含有权利要求I所述的提高植物耐盐性的棉花基因的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于是pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK和pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK。
全文摘要
本发明公开了一种棉花耐盐基因即棉属野生种旱地棉CIPK类蛋白磷酸激酶基因GarCIPK，具有序列表中SEQIDN0.1的序列。本发明利用电子克隆及RT-PCR技术分离了一个棉花耐逆性相关蛋白，通过转化烟草进行功能验证，证明所述转基因植株的抗盐能力明显提高。
文档编号C12N15/54GK102628055SQ201210137339
公开日2012年8月8日 申请日期2012年5月4日 优先权日2012年5月4日
发明者冯娟, 刘章伟, 张香桂, 徐鹏, 沈新莲 申请人:江苏省农业科学院