专利名称：一种低聚半乳糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种低聚半乳糖的制备方法，特别是ー种利用固定化酶生产低聚半乳糖的方法。
背景技术：
低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide, G0S)是ー类天然存在于动物母乳中的功能性低聚糖，具有出色的保水力和极强的酸热稳定性，不能被人小肠消化吸收，但可被结肠菌群发酵，能促进双歧杆菌増殖，抑制有害病原菌和腐败菌生长，促进钙、镁、钾的吸收，有利于B族维生素、烟酸和叶酸的生成，能有效刺激肠道蠕动，減少和防止便秘的发生，降低结肠中有毒物质的含量等调节肠道微生态、促进肠道健康的作用。低聚半乳糖是以乳糖为原料经β -半乳糖苷酶(EC3. 2. I. 23)催化制得，是在乳糖 分子中的低聚半乳糖基上以β (I —2)键或β (I —3)、β (I —4)键、β (I —6)键连接I 4个半乳糖分子的寡糖类混合物。目前通常使用游离细胞或游离β-半乳糖苷酶酶来生产低聚半乳糖。在生产过程中，产品会引入游离细胞或蛋白质等杂质，需要增加复杂的提纯エ艺，不利于清洁生产。为了解决此问题，已研究出将细胞进行固定化，并利用固定化的细胞生产低聚半乳糖的方法。该方法能简化生产エ艺，含β_半乳糖苷酶的固定化细胞可以重复利用，节省了生产成本。固定化细胞常采用海藻酸钙包埋法，在利用固定化细胞转化乳糖的过程中，由于温度较高且海藻酸钙机械強度差，导致固定化细胞容易破碎，从而引入糖浆中，造成糖浆在后续过滤エ序中容易堵塞过滤装置，使过滤压力升高较快。另外，目前用于生产β -半乳糖苷酶的菌种有脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)等微生物。其中，脆壁克鲁维酵母所产的β_半乳糖苷酶为胞内酶，乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉等所产的β_半乳糖苷酶为胞外酶。胞内β_半乳糖苷酶的获取需要进行破碎菌体、分离提纯等步骤，这增加了生产环节和生产设备，同时耗能也増加。若菌株直接将半乳糖苷酶分泌到胞外，则大大方便了酶的分离和利用，并且节省生产成本。已知环状芽孢杆菌所产的半乳糖苷酶为胞外酶，并具有耐高温的性质，但是利用环状芽孢杆菌生产β_半乳糖苷酶的报道很少。
发明内容
本发明的ー个目的在于提供一种低聚半乳糖的制备方法，利用该方法能够获得较高的低聚半乳糖得率。本发明的另ー个目的在于提供ー种固定化β -半乳糖苷酶的制备方法，利用该方法制备的固定化酶具有机械强度高、物化性能稳定等优点，能够有效解决采用海藻酸钙包埋法制备的固定化细胞或固定化酶生产低聚半乳糖的过滤エ序中过滤压力上升较快的问题。
本发明的又ー个目的在于提供ー种利用环状芽孢杆菌(Bacillus circulars)生产β_半乳糖苷酶的方法，该方法能够显著提高β_半乳糖苷酶的产量。本发明所采用的技术方案是一种低聚半乳糖的制备方法，包括以下步骤(I)使用戊ニ醛在15-35°C下与大孔弱碱苯こ烯树脂在搅拌下反应16_24h，使树脂活化；(2)取液体半乳糖苷酶与步骤(I)所得的活化的大孔弱碱苯こ烯树脂在15-35°C下搅拌反应16-24h，得到固定化的β -半乳糖苷酶；(3)将固定化的半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48_52°C搅拌反应24_36h。优选地，步骤(2)所述的β -半乳糖苷酶在使用前经盐析进行提纯。优选地，步骤(2)中β -半乳糖苷酶与大孔弱碱苯こ烯树脂的配比为100_200U/g树脂；步骤(3)中所加入的乳糖浓度为45%-52% (w/w)，并按照每千克乳糖(按干基计)加入6000-10000U的固定化β -半乳糖苷酶。优选地，步骤(2)中所述β -半乳糖苷酶由环状芽孢杆菌产生。优选地，步骤(2)中所述半乳糖苷酶经以下步骤制备Α.将保存的环状芽孢杆菌接种至LB固体培养基，于36_38°C下培养16_24h，使菌种活化；B.取活化的菌种接种至20_50ml的LB液体培养基中，振荡培养46h后接种至装有LB培养基的种子罐中，于36-38°C下培养4-6h，得到种子培养液； C.将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中培养36_48h，得到环状芽孢杆菌发酵液；D.将发酵液经微滤或离心除去菌体，再将所得酶液浓缩，得到液体半乳糖苷酶。优选地，上述环状芽孢杆菌为环状芽孢杆菌ATCC No. 31382。优选地，步骤C所述培养的方式为将种子培养液接入发酵罐中培养16_24h后，以补料量4-6g ·じ1以及补料速度为O. 4-0. 6g ·じ1 · h-1的方式补加乳糖，继续发酵20-28h。优选地,步骤C所述发酵培养基为乳糖5_15g/L、半乳糖5-10g/L、大豆蛋白胨10-30g/L、玉米浸提液4-6g/L、酵母提取物2-4g/L、磷酸氢ニ铵2_4g/L、碳酸钠l_2g/L、大豆油 8-15g/L、消泡剂 O. 5-2g/L。优选地，步骤C中所述培养的条件为温度36_38°C、pH6. 8-7. 5、溶氧彡30%、通气量 O. 5-2V · Ti · mirT1、搅拌速度 120_220rpm。ー种由上述方法制备得到的低聚半乳糖，包括浆状产品和粉状产品。本发明的有益效果是本发明采用固定化β_半乳糖苷酶生产低聚半乳糖，固定化所采用的树脂机械强度高、物化性能稳定，在乳糖的转化过程中不会发生变化，也不容易破碎，因而不会堵塞过滤装置，能够使压力保持稳定，克服固定化细胞所带来压力上升较快的问题。生产过程中所用的固定化酶可以回收重复使用，其使用效率比游离的β_半乳糖苷酶要高得多，具有适合エ业化规模生产的特点。本发明制备低聚半乳糖的生产エ艺简单易行，操作便利，可满足エ业化大生产的要求，低聚半乳糖的得率> 57%。本发明采用环状芽孢杆菌生产半乳糖苷酶，由于环状芽孢杆菌所产的半乳糖苷酶为胞外酶，因此后续的酶的分离纯化过程大为简化，从而节省了分离纯化的设备和成本。同时，该菌种所产的β -半乳糖苷酶具有耐高温的性质，因此，生产低聚半乳糖的过程可以在较高温度下进行，由此带来至少以下好处第一，在高温下反应可減少微生物的污染；第二，高温下乳糖的溶解度更高，越高的乳糖初始浓度低聚半乳糖的得率就越高；第三，β -半乳糖苷酶在低温、低乳糖浓度下一般表现为水解乳糖的活性，合成的低聚半乳糖较少。另外，本发明对环状芽孢杆菌产β-半乳糖苷酶的发酵方式、培养基及发酵条件进行了改进，使β-半乳糖苷酶的产酶能力得到了一定的提高。
具体实施例方式以下实施方式中使用的产半乳糖苷酶的菌株环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号为31382。但本发明所用的菌株不限于环状芽孢杆菌ATCC No. 31382，其它环状芽孢杆菌也适用于本发明。以下对描述本发明的几个概念进行说明。
游离β -半乳糖苷酶酶活测定在ImL含有浓度为4mg/mL的ONPG O. IM磷酸缓冲液中(pH 6. O)加入ImL β -半乳糖苷酶酶液，在50°C反应lOmin，加入2mL10%碳酸钠溶液終止反应，通过测定产物中邻硝基酚含量计算邻硝基酚半乳糖苷(ONPG)的水解量。在该条件下每分钟水解I μ M ONPG所需的酶量定义为ー个酶活单位(U)。低聚半乳糖的含量測定參照AOAC Official Method 2001. 02《Determinationof trans-Galacto-oligosaccharides (TGOb； m Selected Food Products〉〉。本发明提供了一种低聚半乳糖的制备方法，包括以下步骤(I)使用戊ニ醛在15-35°C下与大孔弱碱苯こ烯树脂在搅拌下反应16_24h，使树脂活化；(2)取液体半乳糖苷酶与步骤(I)所得的活化的大孔弱碱苯こ烯树脂在15-35°C下搅拌反应16-24h，得到固定化的β -半乳糖苷酶；(3)将固定化的半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48_52°C搅拌反应24_36h。本发明还提供了一种低聚半乳糖的制备方法，其步骤包括液体β_半乳糖苷酶的制备、固定化半乳糖苷酶的制备和固定化半乳糖苷酶生产低聚半乳糖三部分。以下针对每个部分进行说明。I.液体半乳糖苷酶的制备以环状芽孢杆菌(Bacillus circulars)为出发菌种，经活化、种子罐培养、发酵、除菌体、浓缩得到液体β_半乳糖苷酶，具体步骤如下I)菌种活化将甘油保存的环状芽孢杆菌接种到装有LB固体培养基的平板中，36 38°C培养16 24小时，得到活化环状芽孢杆菌。2)种子罐培养挑取一至ニ环活化后菌种接种到装有2(T50mLLB液体培养基的三角瓶中，振荡培养4飞小时后，再按f3% (v/v)的接种量接入装有LB培养基的种子罐中，于36 38°C、溶氧彡30%、通气量0. 5 2V. T1 · mirT1、搅拌速度12(T400rpm培养4 6小时，得到种子罐培养液。3)发酵培养将种子罐培养液按f 3% (v/v)的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐进行发酵培养16 20小时后,按补料量为5g.じ1,补料速度0. 5g.じ1. IT1的方式补加乳糖至发酵罐，继续发酵2(Γ28小时后，得到环状芽孢杆菌发酵液。其中，发酵用培养基包括以下几种物质乳糖5 15g/L、半乳糖5 10g/L、大豆蛋白胨l(T30g/L、玉米浸提液4飞g/L、酵母提取物2 4g/L、磷酸氢ニ铵2 4g/L、碳酸钠f 2g/L、大豆油8 15g/L、消泡剂O. 5^2g/し其培养条件是在36°C 38°C、pH7. 0 7. 5、溶氧彡30%、通气量O. 5 2V. V' mirT1、搅拌速度120 220rpm。4)除菌体、浓缩酶液将发酵液经微滤或离心去除菌体，再用低温真空浓缩或超滤浓缩方法浓缩酶液，得到酶活为8(Tl20U/mL的液体β -半乳糖苷酶。2.固定化半乳糖苷酶的制备将游离的β -半乳糖苷酶用固定化工艺制成一定形状的固定化酶。固定化β_半乳糖苷酶的制备是将液体β_半乳糖苷酶经硫酸铵盐析初步提纯，然后用化学偶联法与树脂交联，所述硫酸铵盐析过程中硫酸铵使用终浓度为25 30%，固液分离可以采用离心或O. 2^1 μ m孔径的滤纸板加压过滤；所用的树脂是大孔弱碱苯こ烯树脂；所用交联剂是戊ニ醛。固定化方式是先活化树脂，再与酶进行吸附交联。树脂活化条件是戊ニ醛使用终浓度为O. 5^1. 5%，温度为15 35°C，转速为5(Tl00rpm，反应时间为16 24小吋。酶固定化条件是酶与树脂的配比是每克大孔弱碱苯こ烯树脂所需酶量为10(T200U，温度为15 35°C，转速为5(Tl00rpm，反应时间为16 24小时。3.固定化β-半乳糖苷酶生产低聚半乳糖用固定化β_半乳糖苷酶生产低聚半乳糖所采用的分批反应法是在反应罐中加入45 52%(w/w)的乳糖溶液，按每千克乳糖(干基算)加入600(Tl0000U酶量的固定化β-半乳糖苷酶，控制温度在48 52°C，搅拌转速在5(Tl00rpm的条件反应24 36小时，反应完成后，回收固定化酶，用于下ー批原料的生产，反应液经过滤、真空浓缩得到低聚半乳糖含量为57%以上的低聚半乳糖糖浆，或者将浓缩的糖浆进一歩干燥、添加辅料、干燥得到粉状低聚半乳糖。以下结合实施例对本发明进行进一步的说明。实施例I β -半乳糖苷酶的制备I、菌种活化将甘油管保存的环状芽孢杆菌接种至LB固体培养基，于37°C培养18h。2、种子液培养将环状芽孢杆菌经LB平板活化后，挑取一环菌种接种到装有25mLLB培养基的三角瓶中，于37°C、180rpm振荡培养4小吋，然后转接到装有2. 5L LB培养基的发酵罐中，于37°C、搅拌速度12(T220rpm、通气量I. 25L/min，通过调整转速控制溶氧彡30%培养4小时，得到种子培养液。3、发酵培养I)预发酵将种子培养液接种到装有乳糖1250g、半乳糖2000g、大豆蛋白胨4000g、玉米浸提液1300g、酵母提取物650g、磷酸氢ニ铵650g、碳酸钠325g、大豆油2275g、消泡剂125g、水250kg的500L发酵罐中，于37°C下，搅拌速度12(T220rpm、通气量125L/min，通过调整转速控制溶氧> 30%用盐酸调节pH值在7. 4，发酵培养18小时。其中培养基的各种成分包括大豆蛋白胨、玉米浸提液和酵母提取物等均可从市面购买。并且，消泡剂可使用聚醚类、聚醚改性硅消泡剂等。2)补料发酵阶段在步骤I)的发酵体系中开始按20mL/min流加12. 5%的乳糖溶液10し开始补料后，每隔2h取样发酵液測定β-半乳糖苷酶酶活，待酶活停止上升后停止发酵。4、粗酶液制备取上述发酵液，在4 °C下，IOOOOrpm离心IOmin,收集中部酶液，将酶液在-O. 0Γ-0. 009MPa条件下蒸发浓缩，得到酶活力为115U/mL的β -半乳糖苷酶粗酶液。实施例2 β -半乳糖苷酶的固定化按照以下步骤制备固定化β -半乳糖苷酶I、粗酶的精制取实施例I浓缩获得的酶液IOOmL,向其中缓慢添加硫酸铵43. 6g，待硫酸铵完全溶解后，于4°C静置2小时后，在4°C下，IOOOOrpm离心IOmin收集沉淀，然后用IOOmL pH6. O磷酸缓冲液溶解沉淀，得到酶活力为100U/mL β-半乳糖苷酶精制液。2、酶的固定化(I)称取大孔弱碱苯こ烯树脂A103sl00g，用去离子水清洗2 3遍后，加入去离子水2000mL，再加入40mL 50%的戊ニ醛溶液，30°C搅拌16h，过滤，然后用去离子水清洗树脂，过滤晾干水分即得活化树脂。(2)在活化树脂中加入含有IOOmL的β -半乳糖苷酶精制液，于30°C摇床振荡16小时，过滤，然后用去离子水清洗树脂，过滤晾干水分得到酶活力为85U/g的固定化β-半乳糖苷酶100g。
实施例3固定化酶生产低聚半乳糖在5L反应罐中加入质量浓度为50%的乳糖溶液2000g，加入实施例2的固定化酶80g，于50°C、80rpm条件下转化24小时后，采用滤袋收集固定化酶，分离到的糖浆经过滤、真空浓缩器浓缩得到低聚半乳糖含量为57. 6%的Brix为76的糖浆。实施例4 β -半乳糖苷酶的制备I、菌种活化将甘油管保存的环状芽孢杆菌接种至LB固体培养基，于37°C培养18h。2、种子液培养将环状芽孢杆菌经LB平板活化后，挑取ニ环菌种分别接种到2瓶装有50mL LB培养基的三角瓶中，于37°C、180rpm振荡培养4小吋，然后转接到装有10L LB培养基的发酵罐中，于37°C、搅拌速度12(T220rpm、通气量5L/min，通过调整转速控制溶氧^ 30%培养4小时，得到种子培养液。3、发酵培养I)预发酵将种子培养液接种到装有乳糖5kg、半乳糖8kg、大豆蛋白胨16kg、玉米浸提液5. 2kg、酵母提取物2. 6kg、磷酸氢ニ铵2. 6kg、碳酸钠I. 3kg、大豆油9. 1kg、消泡剂0. 5kg、水1000kg的2000L发酵罐中，于37°C下，搅拌速度12(T220rpm、通气量500L/min，用盐酸调节PH值至7. 4，发酵培养18小吋。2)补料发酵阶段在I)发酵体系中开始按25mL/min流加20%的乳糖溶液25し开始补料后，每隔2h取样发酵液測定β -半乳糖苷酶酶活，待酶活停止上升后停止发酵。3、粗酶液制备将上述发酵液在30°C以下、进膜压カ为0. 3^0. 4MPa条件下，用0. 5μπι孔径的陶瓷膜进行循环错流过滤除去菌体，在此过程中适量添加水将酶洗出，最終得到澄清酶液。然后将澄清酶液在30°C以下、进膜压カ为O. 25、. 3MPa条件下，用截留分子量为IOKD的卷式膜超滤浓缩，得到酶活为98. 5U/mL的粗酶液。实施例5 β -半乳糖苷酶的固定化按照以下步骤制备固定化β -半乳糖苷酶I、半乳糖苷酶的精制取实施例4制备的粗酶液200L添加87. 2kg硫酸铵，室温搅拌至硫酸铵完全溶解后，静置2小时后，用O. 2 μ m孔径的澄清纸板加压过滤截留沉淀，然后用200LPH6. O的磷酸缓冲液将沉淀循环清洗下来，即得酶活力为85U/mL β -半乳糖苷酶精制液。2、固定化β-半乳糖苷酶的制备
称取大孔弱碱苯こ烯树脂A103s 150kg，用去离子水清洗2 3遍后，加入去离子水至3000L，再加入60L浓度为50%的戊ニ醛溶液，于15°C、80rpm搅拌24小吋，过滤，然后用去离子水清洗树脂去除残余戊ニ醛，离心甩干即得活化树脂。将活化树脂加入到200L步骤I制备的β_半乳糖苷酶精制液中，于15°C、80rpm搅拌24小时，过滤，然后用去离子水清洗树脂，离心甩干水分，即得酶活力为100U/g的固定化β-半乳糖苷酶150kg。实施例6固定化酶生产低聚半乳糖在4m3罐中加入质量浓度为50%的乳糖溶液3500kg，加入实施例5制备的固定化酶150kg,于48 °C、80rpm条件下转化36小时,采用酶过滤器回收固定化酶，分离到的糖衆进一步过滤、真空浓缩器浓缩得到低聚半乳糖含量为57. 4%的Brix为75的糖浆。实施例7固定化细胞与固定化酶生产低聚半乳糖的比较I、固定化细胞生产低聚半乳糖在8m3罐中加入质量浓度为50%的乳糖溶液6000kg，加入专利CN201110049829. 7方法制备的固定化细胞，于60°C、80rpm条件下转化20小时，采用酶过滤器回收固定化细胞，分离到的糖浆进一歩经过滤面积为5 Hf板框过滤机加压过滤，得到澄清糖浆再进行脱盐脱色、旋转真空蒸发浓缩得到低聚半乳糖。2、固定化酶生产低聚半乳糖按照本发明方法，在8m3罐中加入质量浓度为50%的乳糖溶液6000kg，加入本发明所述固定化酶，于50°C、80rpm条件下转化24小时，采用酶过滤器回收固定化酶，分离到的糖浆进一歩经过滤面积为5 Hf板框过滤机加压过滤，得到澄清糖浆再进行脱盐脱色、旋转真空蒸发浓缩得到低聚半乳糖。上述两种方式生产低聚半乳糖过程中板框过滤效果如下
权利要求
1.一种低聚半乳糖的制备方法，包括以下步骤 (1)使用戊二醛在15-35°C下与大孔弱碱苯乙烯树脂在搅拌下反应16-24h，使树脂活化； (2)取液体￠-半乳糖苷酶与步骤(I)所得的活化的大孔弱碱苯乙烯树脂在15-35°C下搅拌反应16-24h，得到固定化的P -半乳糖苷酶； (3)将固定化的P-半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48-52°C搅拌反应24-36h。
2.根据权利要求I所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤(2)所述的￠-半乳糖苷酶在使用前经盐析进行提纯。
3.根据权利要求I所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤(2)中￠-半乳糖苷酶与大孔弱碱苯乙烯树脂的配比为100-200U/g树脂；步骤(3)中所加入的乳糖浓度为45%-52% (w/w),并按照每千克乳糖(按干基计)加入6000-10000U固定化P -半乳糖苷酶。
4.根据权利要求I所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤(2)中所述￠-半乳糖苷酶由环状芽孢杆菌产生。
5.根据权利要求I所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤(2)中所述￠-半乳糖苷酶经以下步骤制备 A.将保存的环状芽孢杆菌接种至LB固体培养基，于36-38°C下培养16_24h，使菌种活化； B.取活化的菌种接种至20-50ml的LB液体培养基中，振荡培养4_6h后接种至装有LB培养基的种子罐中，于36-38°C下培养4-6h,得到种子培养液； C.将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中培养36-48h，得到环状芽孢杆菌发酵液； D.将发酵液经微滤或离心除去菌体，再将所得酶液浓缩，得到液体3-半乳糖苷酶。
6.根据权利要求5所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤C所述培养的方式为将种子培养液接入发酵罐中培养16_20h后，补加乳糖，继续发酵20-28h。
7.根据权利要求5所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中所述环状芽孢杆菌为环状芽孢杆菌 ATCC No. 31382。
8.根据权利要求5所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中所述补加乳糖的方式为补料量4飞g L—1，补料速度为0. 4^0. 6g L—1 h'
9.根据权利要求5所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤C所述发酵培养基为乳糖5-15g/L、半乳糖5-10g/L、大豆蛋白胨10-30g/L、玉米浸提液4_6g/L、酵母提取物2-4g/L、磷酸二氢铵2-4g/L、碳酸钠l_2g/L、大豆油8_15g/L、消泡剂0. 5_2g/L。
10.根据权利要求5所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤C中所述培养的条件为温度 36-38°C、pH6. 8-7. 5、溶氧彡 30%、通气量0. 5-2V ^T1 .min'搅拌速度 120_220rpm。
全文摘要
本发明公开了一种低聚半乳糖的制备方法，包括(1)使用戊二醛在15-35℃下与大孔弱碱苯乙烯树脂在搅拌下反应16-24h，使树脂活化；(2)取液体β-半乳糖苷酶与步骤(1)所得的活化的大孔弱碱苯乙烯树脂在15-35℃下搅拌反应16-24h，得到固定化的β-半乳糖苷酶；(3)将固定化的β-半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48-52℃搅拌反应24-36h。采用本发明的方法生产低聚半乳糖能使糖浆过滤工艺中过滤压力保持稳定，提高低聚半乳糖的得率，既降低了能耗，又能满足工业化生产的要求。
文档编号C12N11/08GK102676614SQ20121017297
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者曾宪纲, 曾宪经, 肖桂秋, 陈子健, 陈振鹏 申请人:江门量子高科生物股份有限公司