使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离的制作方法

专利名称：使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，所述组合物包含离液剂、缓冲物质和0.5% 5% (V/V)的聚多卡醇或其衍生物。本发明也涉及所述组合物的用途和包括本发明的组合物的试剂盒。本发明还涉及用于在生物样品中检测核酸的方法，所述方法包括下列步骤在离液剤、缓冲物质和0.5% 5% (V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，任选地分离所述核酸，任选地扩增所述核酸，以及检测所述核酸。本发明进一步涉及用于在生物样品中提纯核酸的方法，所述方法包括下列步骤在离液剂、缓冲物质和0. 5% 5% (V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，和分离所述核酸由此提纯所述核酸。
背景技术：
·许多生物物质，尤其是核酸，就将它们与其自然环境分离而言提出了特殊的挑战。一方面，核酸常常以极低的浓度存在，另ー方面，它们常常在存在许多其他固体和溶解物，如溶胞后的细胞的情况下被发现。这导致核酸难以分离或測定，尤其是在生物特异性測定中，所述生物特异性測定允许对特定分析物，如核酸进行检测，或对特定分析物性质进行检测，而且在诊断及生物分析学领域的研究与发展中起主要作用。生物特异性測定的实例是杂交測定、免疫测定和受体-配体測定。杂交测定使用用于核酸分析物，如RNA和DNA的分子检测的特异性碱基配对。因此，长度为18 20个核苷酸的寡核苷酸探针能够对例如人类基因组中的所选的互补序列进行特异性识别。需要两个寡核苷酸引物选择性结合的另ー种测定是在US 4，683，195中描述的聚合酶链反应(PCR)。该方法允许通过具有热稳定性的聚合酶在脱氧核苷三磷酸的存在下在几个循环中将特定的核酸区域选择性扩增至可检测的水平。如上所述，在上面所提及的測定之一中分析所述生物物质或将其用于其他过程中之前，必须从包含不同成分例如蛋白质成分和非蛋白质成分的复杂混合物的生物样品中将其分离或提纯。对于第一阶段的步骤来说，常常使用可允许所关注的成分如核酸富集的方法。这些常常包含在细菌细胞、真菌细胞、病毒颗粒或更为复杂的有机体的细胞如人类血细胞或植物细胞中。所关注的成分也被称为“靶标成分”。为释放所述细胞或颗粒的内容物，所述细胞或颗粒可以用酶或化学药品进行处理从而使有机体的细胞壁溶解、降解或变性。该过程通常称为溶胞(lysis)。包含该胞溶物的所得溶液称为溶胞产物。在溶胞过程中常常遇到的问题是降解所述靶标成分的其他酶(如分解核酸的脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶)在溶胞过程中与所关注的成分接触。这些降解酶也可存在于所述细胞的外部，或在溶胞前以不同的细胞区室在空间上分隔开再与靶标成分接触。在该过程中释放的其他成分可以为例如属于脂多糖的内毒素，其对细胞具有毒性并可能导致意图用于人类或动物疗法的产品出现问题。已经有各种手段可以解决上面所提及的该问题。当意欲释放核酸时通常使用诸如硫氰酸胍或阴离子、阳离子、两性离子或非离子洗涤剂等离液剂。此外有利的是使用可快速降解这些酶或不需要的蛋白的蛋白酶。然而，这有可能导致另一个问题，即所述物质或酶在后续步骤中会干扰各试剂或成分。可有利地用于上述溶胞或样品制备过程的酶是可使蛋白质底物中的酰胺键分裂并被分类为蛋白酶，或(可以替代地)肽酶的酶(參见Walsh, C. , Enzymatic ReactionMechanisms (1979) chapter 3,ff. H. Freeman and Company, San Francisco)。已经得至丨J放用的蛋白酶是例如碱性蛋白酶(WO 98/04730)或酸性蛋白酶(US 5，386，024)。广泛用于核酸分离的样品制备的蛋白酶是来自Tritirachium album的蛋白酶K(例如參见Sambrook,J.,等Molecular Cloning (1989) Cold Spring Harbor University Press, NY, USA),该蛋白在酶pH约为中性时具有活性并属于本领域的技术人员所公知为枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)的蛋白酶族。枯草杆菌蛋白酶是由革兰氏阳性细菌或真菌所产生的丝氨酸蛋白酶。在溶胞步骤之后的样品制备的后续步骤中，所述靶标成分被进ー步富集。如果所·述靶标成分是核酸，则该靶核酸通常在其用于基于探针的測定之前由复杂溶胞混合物提取。对于核酸的提取已经有了数种方法-序列依赖性或生物特异性方法，如-亲合色谱法-与固定化探针杂交-不依赖序列的或物理化学方法，如-使用例如苯酚-氯仿进行的液-液萃取-使用例如纯こ醇进行的沉淀-使用滤纸进行的提取-使用如十六烷基-三甲基-溴化铵等成胶束剂进行的萃取-与诸如吖啶衍生物等固定化插入染料结合-吸附至硅胶或硅藻土-在离液条件下吸附至磁性玻璃颗粒(MGP)或有机硅烷颗粒对于提取目的而言尤其关注的是核酸对玻璃表面的吸附，尽管其他表面也是可解的。近年来已经提出了通过利用核酸与玻璃或ニ氧化硅表面的结合行为而将核酸与其自然环境分离的许多方法。例如，EP 0 389 063公开了在离液剂的存在下核酸与ニ氧化硅表面的结合。W96/41811和WO 01/37291公开了核酸与磁性玻璃颗粒的ニ氧化硅表面的结合。市场上销售的市售系统为例如可由 Roche Diagnostics, Mannheim, Germany 得到的 the High Pure 系统和the MagNA Pure 系统。为增强或影响生物样品的溶胞和/或核酸与ニ氧化硅表面的结合行为，在现有技术中已经使用了各种试剂。WO 95/01359公开了为将核酸结合至ニ氧化硅表面使用1% 50%的不同醇类、
聚こニ醇或三氯こ酸并结合高盐浓度。WO 97/05248公开了用于从生物样品中分离并提取DNA、RNA和蛋白质的溶液。所述溶液包括离液剂、还原剂和诸如醇等有机溶剤。WO 01/37291 公开了包含 50mM Tris pH 7. 0,15% (V/V)聚多卡醇、5M异硫氰酸胍和ImM ニ硫苏糖醇(DTT)的溶胞缓冲液。WO 2005/064010涉及用于在水溶液中将核酸与固相结合的组合物。所述组合物包含胍盐、缓冲物质和洗涤剂诸如Triton-X-100、NP-40、聚多卡醇及Tween 20等。所述洗涤剂的浓度可以为5% 30%，优选为10% 20%。WO 00/09746和WO 01/60517描述了具有包含胍盐、缓冲物质、还原剂和洗涤剂的溶液的容器。所述洗涤剂的浓度可以为5% 30%。

发明内容
因此，本发明的目的是提供ー种新型组合物，所述组合物用于生物样品的溶胞和/ 或用于影响或增强核酸与ニ氧化硅表面的结合行为。通过本发明的发现已经解决了该问题，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含离液剂(chaotropic agent)、缓冲物质和0. 5% 5% (V/V)的聚多卡醇(polidocanol)或其衍生物。在本发明的另ー个实施方式中，本发明的组合物用于提纯核酸、用于将核酸与固体表面结合或用于检测核酸。在本发明的又一个实施方式中，提供了用于检测生物样品中的核酸的方法，包括下列步骤a)在离液剂、缓冲物质和0. 5% 5% (V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，b)任选地分离所述核酸，c)任选地扩增所述核酸，以及d)检测所述核酸。在本发明的再一个实施方式中，提供了用于提纯生物样品中的核酸的方法，包括下列步骤a)在离液剂、缓冲物质和0. 5% 5% (V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，b)分离所述核酸由此提纯所述核酸。术语“聚多卡醇(polidocanol) ”或“polydocanol”是指由姆个分子中平均约有9个氧化こ烯基团的聚こニ醇单十二烷基醚的混合物构成的化合物或组合物。其可由分子式(C2H4O)nC12H26O或HO(CH2CH2O)n(CH2) nCH3描述，其中n为大约9，S卩，作为其中月桂醇与氧化こ烯反应(こ基氧化)的制造方法的结果，こニ醇部分的中数为约
9。这意味着分子量为约600g/mol。该化合物的其他名称为3，6，9，12，15，18，21，24，27-nonaoxanonatriacontan-l-醇、十二烧基九こニ醇醚、十二烧基九こニ醇、聚こニ醇9月桂基醚或Iaureth 9。所述化合物也是适宜的乳化和增溶剂，用于油/水(0/W)型的化妆用乳液和皮肤病用乳液、局部麻酔剂、杀精子剂和表面活性剂或治疗曲张静脉的硬化剂。所述化合物可以由例如 Kolb, Hedingen, Switzerland(Sympatens_AL/090P)获得。但根据本发明，术语“聚多卡醇”或“polydocanol”还应当指具有式(C2H4O)9C12H26O-HO (CH2CH2O) 9 (CH2) nCH3的化学上明确的化合物。“聚多卡醇”在室温下是白色软膏状物质，在约30°C时变成清澈的、无色至轻微发黄的液体。因此，对于制备含有聚多卡醇的组合物来说，当例如在水浴中加热至如37°C或40°C时可由吸液管吸取聚多卡醇，也可以在室温下作为固体物质加入。因而，根据本发明，2. 371聚多卡醇(液体)(稍高于30°C，优选37°C )等于2. 365kg固体聚多卡醇(稍低于30°C，优选为室温，即20°C 25°C )。所得组合物或溶液以％ (V/V)或％ (W/V)表示聚多卡醇的含量。术语“(V/V)”意思是单位体积的体积，“ (W/V) ”意思是单位体积的重量。所述组合物的优选溶剂或主要成分为水，即，优选的是这些组合物为水性组合物或水性溶液。术语“聚多卡醇的衍生物”或“polydocanol的衍生物”涉及化学衍生的但具有与“聚多卡醇”或“polydocanol”的各种性质相同或极为相近的各种性质，尤其是在本发明的方法中的各种性质的“聚多卡醇”或“polydocanol ”。在本发明的说明书中“组合物”的另ー种说法是溶液。“生物样品”是取自植物或动物(包括人类)并且为固体或液体的样品。其具体实·例将在下面进行更详细的描述。
具体实施例方式在本发明的一个实施方式中，提供了一种组合物，包含-离液剤，-缓冲物质，和-0.5% 5% (V/V)的聚多卡醇或其衍生物。在本发明的优选实施方式中，本发明的组合物包含0.5% 4. 9% (V/V)聚多卡醇、0. 5% 4. 5% (V/V)聚多卡醇、0. 5% 3% (V/V)聚多卡醇或其衍生物，优选所述组合物包含0. 75% I. 75% (V/V)聚多卡醇或其衍生物。在本发明的另ー优选实施方式中，本发明的组合物包含1% 4. 5% (V/V)聚多卡醇或其衍生物，优选所述组合物包含I. 5% 3% (V/V)聚多卡醇或其衍生物。在本发明的另ー优选实施方式中，在本发明的组合物中，所述离液剂是硫氰酸胍、异硫氰酸胍、氯化胍或服。然而，也可以使用氯酸钾(KC104)或碘化钾(KI)。在本发明的另ー优选实施方式中，在本发明的组合物中，所述缓冲物质是三-(羟基甲基)-氨基甲烷(TRIS)、磷酸盐、N-(2-羟基こ基)哌嗪-N' -(2-こ烷磺酸)(HEPES)、こ酸盐或柠檬酸盐。在本发明的另ー优选实施方式中，在本发明的组合物中，所述组合物的pH为酸性，优选所述组合物的pH为3 5。在本发明的又一优选实施方式中，所述组合物还包含还原剂，优选为ニ硫苏糖醇(DTT)。在本发明的极为优选的实施方式中，所述组合物包含4M硫氰酸胍、50mM柠檬酸钠、1% (ff/V)DTT,3% (V/V)聚多卡醇，pH 为 4。在本发明的又一优选实施方式中，本发明的组合物还包含蛋白酶。在本发明的优选实施方式中，本发明的组合物用于提纯核酸、用于将核酸与固体表面结合或用于检测核酸。
本发明还设想了ー种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括本发明的组合物。本领域中公知的该试剂盒还包括可在样品制备过程中使用的塑料器皿，例如96或384孔形式的微量滴定板或例如由Eppendorf, Hamburg, Germany制造的普通反应管等以及用于执行本发明的方法的所有其他试剂。因此，所述试剂盒可另外包括对核酸具有亲合性的物质，优选的是所述对核酸具有亲合性的物质包括具有ニ氧化硅表面的物质。所述具有ニ氧化硅表面的物质优选是玻璃。所述的对核酸具有亲合性的物质最优选是包含磁性玻璃颗粒的组合物。本发明的这些试剂盒的成分可以分别提供在管中或存储容器中。根据各成分的性质，它们也可以提供在単独的管中或存贮容器中。所述试剂盒可进一步或额外地包括洗涤液，当DNA或RNA与磁性玻璃颗粒结合时，所述洗涤液适用于该磁性玻璃颗粒的洗涤步骤。所述洗涤液可以在缓冲溶液或上述具有酸性PH而不含こ醇和/或离液剂的溶液中包含こ醇和/或离液剤。所述洗涤液或其他溶液常常作为在使用前需要稀释的储备溶液提供。所述试剂盒可进一步或额外地包括洗脱液或洗脱用缓冲剂，即，溶液或缓冲液(例如IOmM TrisUmMEDTA, pH为8. 0)或纯水用以洗脱与磁性玻璃颗粒结合的DNA或RNA。此外，可以存在可用于核酸，即DNA或RNA的提纯过程的追加试剂或缓冲溶液。因此，在本发明的实施方式中， 提供ー种包括本发明的组合物的试剂盒。优选的是，所述试剂盒另外包括对核酸具有亲合性的物质，优选具有ニ氧化硅表面的物质。所述对核酸具有亲合性的物质更优选是包含磁性玻璃颗粒的组合物。本发明的试剂盒优选另外还包括洗涤缓冲剂和洗脱缓冲剂。在本发明的优选实施方式中，本发明的试剂盒用于研究、生物分析学或诊断学中的核酸提纯。在本发明的优选实施方式中，本发明的试剂盒或本发明的方法用于高通量形式，即，用于允许对大量不同样品进行分析的自动化方法。在本发明的实施方式中，提供了用于检测生物样品中的核酸的方法，包括下列步骤a)在离液剂、缓冲物质和0. 5% 5% (V/V)的聚多卡醇或其衍生物的存在下培养所述生物样品，b)任选地分离所述核酸，c)任选地扩增所述核酸，以及d)检测所述核酸。在本发明的方法的步骤a)中，所述生物样品经溶胞而释放生物样品中所含有的包括核酸的生物物质。关于用于获得核酸的溶胞过程的普通參数，具体可以參考Samtoook，J., 等Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold SpringHarbour Laboratory Press, NY, USA,和 Ausubel, F.,等Current Protocols in MolecularBiology (1987) John ffiley&Sons, Inc. , NY, USA。使用本发明的组合物将溶胞过程结合也是适用的。例如，溶胞可以使用超声波、高压、通过剪切カ进行。此外常常发生的情况是添加用于降解存在于生物样品中的蛋白质的蛋白酶。本发明的蛋白酶可以以固体形式加入，例如作为片剂或粉末，也可以以缓冲溶液或非缓冲溶液中的溶解形式加入。蛋白酶的实例是蛋白酶K或来自EP 1201753中描述的枯草杆菌的另ー种蛋白酶。优选利用聚合酶链反应将所述核酸扩增，聚合酶链反应特异地将靶序列扩增至可检测的量。因此，在本发明的优选实施方式中，在本发明的方法的所述扩增步骤c)中，所述核酸通过聚合酶链反应扩増。其他可能的扩增反应是连接酶链反应(LCR，ffu, D.Y.，和 Wallace，R. B.，Genomics 4(1989)560-569 和 Barany，F.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991) 189-193);聚合酶连接酶链反应(Barany, F.，PCR Methods and Appl. I(1991)5-16) ；Gap-LCR(PCT 专利公开 No. WO 90/01069)；Repair Chain Reaction (EP 0439182) , 3SR(Kwoh, D. Y.,等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA86(1989) 1173-1177 ;Guatelli, C. J.，等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(1990) 1874-1878 ；PCT专利
发明者E·鲁斯曼, H·勒英, N·纳克鲍尔, S·阿迪 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司