专利名称：一种利用固定化酵母利用能源甜菜发酵生产乙醇的方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用固定化酵母利用能源甜菜发酵生产乙醇的方法。
背景技术：
乙醇是一种高效、环保、可再生的燃料及汽油添加剂，大力发展燃料乙醇，不仅可以有效解决能源日益匮乏的难题，更加可以有效减少环境污染。我国传统的乙醇生产，一般以粮食为原料，不但成本高而且产量也收粮食资源的限制，产量有限，难以满足需求。利用能源甜菜进行乙醇发酵工艺的研究越来越引起人们的重视。传统的乙醇发酵方式通常采用游离酵母间歇发酵法，为了提高酵母细胞的利用率和减少杂菌污染，同时提高设备的利用率，利用改进的连续发酵方式可明显提高发酵效率。最初的连续发酵使用游离的酵母菌，由于酵母菌体积小，致使在发酵过程中不断被成熟的发酵醪带走，造成后续发酵液中的菌液浓度降低，使整个发酵过程延迟，生产效率降低。为了解决以上问题，研究者采用固定化酵母的方法，使酵母菌既不受损伤又不流失，使整个连续发酵过程的菌种浓度几乎是在同样条件下进行。而固定化后的酵母始终保留在发酵罐内，并能持续不断地进行繁殖和代谢，从而提高发酵效率。近几年来，利用固定化酵母生产乙醇技术逐渐成为发酵工艺研究的热点。但研究表明不同的固定化方法对菌种的性能保持和发酵效果影响较大。
发明内容
本发明提供了一种利用固定化酵母利用能源甜菜发酵生产乙醇的方法，本发明以酵母菌为出发菌株，以能源甜菜为发酵原料，采用固定化酵母的方法进行连续发酵。本发明采用海藻酸盐作为包埋剂进行ADY酵母固定化，利用包埋法进行酵母菌固定化效果较好，可连续多批次进行发酵试验。I. 一种利用固定化酵母利用能源甜菜发酵生产乙醇的方法，其特征在于发酵时，在250 mL三角瓶中装入一定量的发酵培养基，接入一定量的固定化酵母种子液到发酵培养基中进行发酵制备菌悬液，然后进行固定化增值培养。2.步骤I所述的发酵培养基称取已水分平衡的甜菜糊样品80 g。加入20 mL水分高温灭菌，在无菌条件下加入15 mL液体种子及其他的营养元素。3.步骤2所述的液体种子培养基200 g马铃薯，1000 mL水，20 g葡萄糖，3 g无水硫酸镁，I. 5 g磷酸二氢钾，自然pH, 121°C,灭菌15 min,用于固定化酵母的增殖培养。4.步骤I所述的菌悬液的制备方法为在无菌条件下将酵母菌种接入麦芽汁培养基，放入摇床中在30°C，120 r/min条件下增殖12 h。之后，将增殖后的培养液在无菌条件下用离心管分装，在6000 r/min,4°C下离心10 min弃去上清液,加入适量无菌生理盐水,将其振荡打散以清洗菌体，之后又在相同的条件下离心，再清洗，重复三次，最后一次用无菌水混合菌体制备菌悬液。
5.步骤I所述的固定化方法取一定质量的湿菌体，将菌体细胞加入海藻酸钠溶液，充分混匀。将海藻酸钠菌体悬液移入10 HiL注射器中，适度加力，在无菌条件下将海藻酸钠菌悬液滴入CaCl2溶液中，在磁力搅拌机的作用下形成固定化小球，常温下静置2 h，捞出用无菌去离子水清洗干净。胶珠捞出冲洗干净，然后浸泡于0. 5%壳聚糖溶液三维摇床上振摇，完成与壳聚糖的成膜反应。水洗除去未反应的壳聚糖，将胶珠保存于水中。6.步骤5所述的海藻酸钠的最佳浓度为4%。7.步骤I所述的最适温度在32°C，发酵周期符合生产要求。8.步骤5所述的填充量选择0. 3 g/mL时最有利于固定化酵母发酵酒精。9.步骤I所述的固定化时间为3 h时最有利于固定化酵母发酵酒精。本发明的有益效果在于发明采用海藻酸盐作为包埋剂进行酵母固定化，根据前 期研究结果选择所用菌种ADY，旨在探索固定化酵母的稳定性和对能源甜菜乙醇发酵的批次发酵效果，从而为下一步工业化生产提供理论依据。
图I不同浓度海藻酸钠的发酵结果。图2不同温度对固定化酵母发酵条件的影响。图3不同填充量对固定化酵母发酵酒精的影响。图4不同固定化时间对酒精发酵的影响。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本发明所用的菌株为巴斯德毕赤酵母，购买于ACCC，编号为ACCC20065。实施例I
本实施案例说明不同海藻酸钠浓度对发酵的影响，海藻酸钠浓度分别控制在2%，4%，6%和8%，发酵条件为能源甜菜糊的初糖浓度为15%，颗粒填充率为0. 20 g/mL,温度为30°C，摇床培养箱培养12小时后静止培养。得到结果如图I所示。由图I可知，从酒精转化率这个方面可以较为清晰的看出，海藻酸钠浓度在4%的时候，发酵效果是最好的，酒精浓度最高。因而在之后的固定化发酵试验中，我们均选取4%作为海藻酸钠的固定化浓度。实施例2
本实施案例说明不同温度对固定化酵母发酵条件的影响，按0. 20 g/mL填充量，将固定化细胞置于甜菜糊培养基中，温度选择分别为20°C，24°C，28°C，32°C，36°C和40°C，pH为自然pH，起始糖度15%，进行发酵。通过测定不同温度下的酒精转化率，研究温度对固定化酵母发酵的影响，结果见图2。温度对酵母的生长繁殖、发酵速度与周期、杂菌污染等影响较大。由图2可知，当温度低于32°C时，固定化酵母发酵速度较慢，随着温度的升高，发酵速度逐渐增加至停滞，最适温度在32°C，发酵周期符合生产要求。实施例3
本实施案例说明不同填充量对固定化酵母发酵酒精的影响，选择填充量在0. I g/mL,0.2 g/mL,0. 3 g/mL, 0.4 g/mL 和 0.5 g/mL，温度为 32°C，起始糖度 15%，发酵 30 h。通过测定不同填充量下的酒精转化率，研究填充量对固定化酵母发酵的影响。结果见图3所示。由图3可知，填充量越大，酒精转化率越高，也就是说糖分利用率越高，填充量继续增加，酒精含量反而下降，经研究发现，酵母浓度过高，易造成无氧环境，影响酵母细胞的增殖，同时由于酒精含量的增加也对酵母的发酵发生抑制。因此，填充量选择0.3 g/mL即能节约资源又能达到良好的发酵效果。实施例4
本实施案例说明不同固定化时间对酒精转化率的影响，根据固定化方法，仅改变固定化时间，发酵条件与前面的实施例相同，观察固定化时间对酒精转化率的影响。结果如图4所示。由图4可知，固定化时间为3 h时，载体酒精转化率最高。海藻酸钠与钙盐作后， 分子中钠离子与钙离子进行交换，生成海藻酸钙。由于Ca2+的交联作用，随着固化时间的增加分子间相互作用力增强，使线性分子彼此相互连接形成空间网状结构，母在其中活动空间增加，加快繁殖，加速糖度下降。
权利要求
1.一种利用固定化酵母利用能源甜菜发酵生产乙醇的方法，其特征在于发酵时，在250mL三角瓶中装入一定量的发酵培养基，接入一定量的固定化酵母种子液到发酵培养基中进行发酵制备菌悬液，然后进行固定化增值培养。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵培养基称取已水分平衡的甜菜糊样品80 g;加入20 mL水分高温灭菌，在无菌条件下加入15 mL液体种子及其他的营养元素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，液体种子培养基200g马铃薯，1000 mL水,20 g葡萄糖,3 g无水硫酸镁,1.5 g磷酸二氢钾，自然pH, 121°C,灭菌15 min,用于固定化酵母的增殖培养。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，菌悬液的制备方法为在无菌条件下将酵母菌种接入麦芽汁培养基，放入摇床中在30°C，120 r/min条件下增殖12 h ;之后，将增殖后的培养液在无菌条件下用离心管分装，在6000 r/min,4°C下离心10 min弃去上清液,力口入适量无菌生理盐水，将其振荡打散以清洗菌体，之后又在相同的条件下离心，再清洗，重复三次，最后一次用无菌水混合菌体制备菌悬液。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，固定化方法取一定质量的湿菌体，将菌体细胞加入海藻酸钠溶液，充分混匀；将海藻酸钠菌体悬液移入10 mL注射器中，适度加力，在无菌条件下将海藻酸钠菌悬液滴入CaCl2溶液中，在磁力搅拌机的作用下形成固定化小球，常温下静置2 h，捞出用无菌去离子水清洗干净；胶珠捞出冲洗干净，然后浸泡于0.5%壳聚糖溶液三维摇床上振摇,完成与壳聚糖的成膜反应；水洗除去未反应的壳聚糖，将胶珠保存于水中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于海藻酸钠的浓度为4%。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于最适温度在32°C，发酵周期符合生产要求。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于填充量选择0.3g/mL时最有利于固定化酵母发酵酒精。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于固定化时间为3h时最有利于固定化酵母发酵酒精。
全文摘要
本发明提供了一种利用固定化酵母利用能源甜菜发酵生产乙醇的方法，本发明以酵母菌为出发菌株，以能源甜菜为发酵原料，采用固定化酵母的方法进行连续发酵。本发明采用海藻酸盐作为包埋剂进行ADY酵母固定化，利用包埋法进行酵母菌固定化效果较好，可连续多批次进行发酵试验。
文档编号C12P7/06GK102719487SQ201210253108
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月22日 优先权日2012年7月22日
发明者周雪琴 申请人:太仓市周氏化学品有限公司