芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因及其编码产物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因及其编码蛋白与用途，该基因为首次利用构建cDNA文库从芍药中克隆而得，填补了从我国传统中药材芍药中分离克隆出3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因的空白。本发明所提供的芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因可以通过生物技术提高芍药中3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)代谢产物的含量，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。
【专利说明】芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因及
其编码产物和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，主要涉及利用芍药cDNA文库克隆3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的有机酸、萜类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。
【背景技术】 [0002]药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。药用植物的化学成分复杂，种类繁多，其中主要含有有机酸类、黄酮类、挥发油、萜类、二萜类、微量元素等多种成分，芍药Paeonialactiflora不仅是名花,还是一味常用中药，其根可供药用。其中白苟具有镇痉、镇痛、通经等作用。芍药根中含有芍药苷、安息香酸等活性成分，其中芍药苷属于单萜类化合物，具有显著的镇痛、镇静、抗惊厥、解痉、解热、抗炎、抗溃疡、抗过敏、降血糖、调节免疫、保护肝脏等作用(杨俊，方红编。芍药[M]。北京:中国中医药出版社，2001，113)。
[0003]3-羟基 _3_ 甲基戍二酸 CoA 还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreducase,HMGR)可催化3_羟基_3_甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)生成甲羟戊酸(MVA)，由于该过程不可逆，故HMGR被视作MVA途径的第一个限速酶，是萜类化合物代谢中的重要调控点，其表达量可能与芍药苷等萜类成分的含量密切相关。而甲羟戊酸经过甲羟戊酸激酶(MK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)等酶的作用生成异戊烯基焦磷酸(IPP)，再进一步合成各种不同的萜类化合物(张长波，孙红霞，巩中军，祝增荣。植物萜类化合物的天然合成途径及其相关合酶[J]。植物生理学通讯，2007，43 (4) =779-786) 0芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因的克隆，为利用基因工程提高芍药活性成分含量提供重要基础，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的芍药中3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因及其氨基酸序列。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因。
[0005]本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。
[0006]本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。
[0007]本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。
[0008]本发明所提供的芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因，为以下核苷酸序列之一:
[0009](I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0010](2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0011]该基因所编码的蛋白质为芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因，是以下氨基酸序列之一:
[0012](I)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
[0014]本发明所提供的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因是首次从芍药中克隆制备的，体外实验表明，PLHMGR具有催化3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)生成甲羟戊酸(MVA)的活性。利用本发明可以通过基因工程技术来提高芍药等植物中萜类物
质含量。 【专利附图】
【附图说明】:
[0015]图1:PLHMGR功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；
[0016]图2 =PLHMGR系统进化树(邻接法)；
[0017]图3:表达载体pYES2-PLHMGR构建；
【具体实施方式】
[0018]实施例1、芍药cDNA文库的构建
[0019]1、芍药总RNA的分离和检测
[0020]取苟药(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研钵中用液氮快速研磨成粉末,快速转移至 65°C预热的 IOmL 提取缓冲液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol.1，EDTA25mmol.?Λ NaCl 2.0mol.?Λ PVP402%，亚精胺 0.5g/L，巯基乙醇 2% )，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的IOM LiCl，混匀后放置 4°C沉淀过夜；7500g 离心 20 分钟，沉淀用 500yL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol.?ΛTris-HCl (ρΗ8.0) IOmmol.?Λ EDTA lmmol.?Λ 在 65°C溶解 5 分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，_70°C放置2小时；4°C 13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于IOOy L DEPC处理的水中，用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定Α260、Α280比值和浓度。置于_80°C冰箱备用。
[0021]2、cDNA文库的构建
[0022]米用mRNA 纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分离 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Cat.N0.634903)进行建库，原理为 SMART (switch mechanism at 5 ' end of mRNAtemplate)。
[0023]实施例2:芍药相关基因的克隆
[0024]随机挑取5000个单克隆进行菌落PCR鉴定。取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。用灭过菌的IOul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。依次加入:Taq buffer 2.5 μ L，MgCl2 (25mM) 1.8 μ L，dNTP (2.5mM) I μ L，M13+引物(IOpmol) I μ L，Μ13-引物(IOpmol) I μ L，Taq SI 0.4 μ L0 PCR 反应条件为 94°C预变性 5 分钟后，94°C 40秒，54°C 40秒，72°C 4分钟，35个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。待PCR反应进入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ul PCR产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。选择条带单一扩增产物送至华大基因公司进行测序，获得芍药相关基因序列。[0025]实施例3、PLHMGR基因的生物信息学分析
[0026]本发明涉及的芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因全长cDNA的长度为1398bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于l_1398bp。将芍药全长cDNA 序列用 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundantGenBank CDStransIation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR 数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的HMGR有较高的同源性，同时具有典型的hydroxymethylglutary1-CoA synthase 结构域。如图1。
[0027]实施例4、PLHMGR基因功能的研究
[0028]1.表达载体的构建
[0029]以PLHMGR cDNA 为模板，利用引物 Pl:5' -AAGCTTATGGCCAAGAATGTAGGAATTCTCG-
3' , P2:5/ -TCTAGATCAATGACCATTAGCAACCAAACCA-3 '进行 PCR 反应，反应体系同实验例
2。取5ul扩增产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为1410bp。用Hind III和Xba I在37°C下双酶切扩增产物2小时，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用Hind III和Xba I在37°C下酶切pMD19_T载体2小时，加入5ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用回收试剂盒回收片段。
[0030]回收片段经T4连接酶在8°C连接过夜。电击转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。含PLHMGR克隆的pMD19质粒经PCR和限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列分析，保存具有正确目标序列的重组质粒pMD-PLHMGR。
[0031]Hind III 和 Xba I 双酶切携带 PLHMGR 的 pMD_19T Vector 质粒和 pYES2 质粒，分别回收目标片段HMGR和开环的pYES2，于16°C连接回收片段，获得重组质粒，经PCR和限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列分析，证明含有正确序列的PLHMGR，该表达载体命名为pYES2-PLHMGR(图 3)。
[0032]2.工程酵母构建
[0033]pYES2-PLHMGR 连接转化 DH5 α，在 LB 平板(100mg/L Ampicillin)筛得携带PYES2-PLHMGR的单斑，然后在LB液体培养基(25mg/L Ampicillin)中培养，经质粒提取，PCR检测以及酶切验证之后，采用醋酸锂法将pYES2-PLHMGR转化酵母JRY2394 ;同时用PYES2空质粒转化JRY2394作为对照。
[0034]3.PLHMGR基因功能分析
[0035]由于 JRY2394 (MATa, ade2, his3, met-, ura3, hmgl, hmg2)是一个缺乏 HMGR 活性、生长需要甲羟戊酸的酵母突变菌株，可以通过转入外源HMGR基因，使其在JRY2394中表达，通过遗传功能互补，从而恢复酵母自身失去的HMGR功能来验证外源HMGR基因的功能。
[0036]将JRY2394，JRY2394+pYES2, JRY2394+pYES2_PLHMGR 分别在含有 YM (0.67% 氨基酸缺失的酵母氮源，30mg/L腺嘌呤,组氨酸和甲硫氨酸)+2% galactose (半乳糖)+5mg/LMVA(甲轻戍酸)+30mg/L uracil (尿嘧唳)即 YM galatose+MVA+Uracil, ΥΜ(0.67%氨基酸缺失的酵母氮源，30mg/L腺嘌呤,组氨酸和甲硫氨酸)+2% galactose (半乳糖)+5mg/LMVA(甲轻戍酸)即YMgalatose+MVA-Uracil,和ΥΜ(0.67%氛基酸缺失的酵母氣源,30mg/L腺嘌呤，组氨酸和甲硫氨酸)十2% galactose (半乳糖)即YM galatose-MVA-Urac平板上划线培养，并于30°C培养3天后观察菌落形态 。
[0037]结果表明，转化的含有pYES2-PLHMGR的JRY2394能在选择培养基(YMgalaetose-MVA-uracil)上生长，但是JRY2394和含有pYES2的JRY2394却由于不能合成生长所必需的甲羟戊酸而无法在选择培养基上生长。含有pYES2-PLHMGR和pYES2的JRY2394能在另一选择培养基(YM galactose, +MVA and-uracil)上生长,而JRY2394却始终不能生长。三种工程菌都能在非选择培养基(YM galactose, +MvAand+uracil)上生长。以上实验结果证明，PLHMGR具有HMGR基因功能，可以参与酵母甲羟戊酸的生物合成。
[0038]5.突变HMGR活性测定
[0039]以PLHMGR cDNA 为模板，利用突变引物 P3:5' -AAGCTTATGGCTAAGAATGTAGGAATTCTCG-3/ ,P4:5/ -TCTAGATCAATGACCATTAGCAACCAAACCA-3'进行 PCR 反应，表达载体的构建、工程酵母的构建及PLHMGR基因功能分析方法同上，结果表明突变PLHMGR转基因工程酵母与正常PLHMGR酵母没有显著差异。
【权利要求】
1.一种芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列； (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.—种芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一:
(1)具有SEQID N0.2所不的氣基酸序列； (2)SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
3.重组载体，其特征在于:含有权利要求1所述的芍药3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(PLHMGR)基因全序列或部分序列。
【文档编号】C12N15/53GK103571855SQ201210262201
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月27日 优先权日:2012年7月27日
【发明者】黄璐琦, 袁媛, 汪周勇 申请人:中国中医科学院中药研究所