芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因及其编码产物和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因及其编码蛋白与用途，该基因为首次利用构建cDNA文库从芍药中克隆而得，填补了从我国传统中药材芍药中分离克隆出乙酰CoA酰基转移酶基因的空白。本发明所提供的芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因可以通过生物技术提高芍药中乙酰CoA代谢产物的含量，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。
【专利说明】芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因及其编码产物和应
用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，主要涉及利用芍药cDNA文库克隆乙酰CoA酰基转移酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的有机酸、萜类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。药用植物的化学成分复杂，种类繁多，其中主要含有有机酸类、黄酮类、挥发油、萜类、二萜类、微量元素等多种成分，芍药Paeonia lactif 1ra不仅是名花,还是一味常用中药,其根可供药用。其中白苟具有镇痉、镇痛、通经等作用。芍药根中含有芍药苷、安息香酸等活性成分，其中芍药苷属于单萜类化合物，具有显著的镇痛、镇静、抗惊厥、，解痉、解热、抗炎、抗溃疡、抗过敏、降血糖、调节免疫、保护肝脏等作用(杨俊，方红编。芍药[M]。北京:中国中医药出版社，2001，113)。
[0003]乙酸CoA酸基转移酶(acetyl-CoAC-acetyltransferase,AACT)是職类化合物生物合成甲羟戊酸(MVA)途径的起始酶，是萜类化合物生物合成途径上的第一个关键酶，其表达量可能与芍药苷等萜类成分的含量密切相关。AACT能催化使2个分子的乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA(acetoacetyl CoA),再经过轻甲基戍二酰CoA合酶(HMGS)、轻甲基戍二酰CoA还原酶(HMGR)等酶的作用生成异戊烯基焦磷酸(IPP)，再进一步合成各种不同的萜类化合物(张长波，孙红霞，巩中军，祝`增荣。植物萜类化合物的天然合成途径及其相关合酶[J]。植物生理学通讯，2007，43 (4):779-786)。芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因的克隆，为利用基因工程提高芍药活性成分含量提供重要基础，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的芍药中乙酰CoA酰基转移酶基因及其氨基酸序列。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因。
[0005]本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。
[0006]本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。
[0007]本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。
[0008]本发明所提供的芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因，为以下核苷酸序列之
[0009](I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；[0010](2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0011]该基因所编码的蛋白质为芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因，是以下氨基酸序列之一:
[0012](1)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
[0014]本发明所提供的芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因是首次从芍药中克隆制备的，体外实验表明，PLAACT具有催化使2个分子的乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA(acetoacetyl CoA)的活性。利用本发明可以通过基因工程技术来提高芍药等植物中萜类物质含量。
【专利附图】
【附图说明】:
[0015]图1:PLAACT功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；
[0016]图2 =PLAACT系统进化树(邻接法)；
[0017]图3:表达载体 pBAD/HisB-AACT 构建；
【具体实施方式】
[0018]实施例1、芍药cDNA文库的构建
[0019]1、芍药总RNA的分离和检测
[0020]取苟药(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研钵中用液氮快速研磨成粉末,快速转移至 65°C预热的 IOmL 提取缓冲液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol.1-1，EDTA25mmol.?Λ NaCl 2.0mol. PVP402%，亚精胺 0.5g/L，巯基乙醇 2% )，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的IOM LiCl，混匀后放置 4°C沉淀过夜；7500g 离心 20 分钟，沉淀用 500yL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol.?ΛTris-HCl (ρΗ8.0) IOmmol.?Λ EDTA lmmol.?Λ 在 65°C溶解 5 分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，_70°C放置2小时；4°C 13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于IOOy L DEPC处理的水中，用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定Α260、Α280比值和浓度。置于_80°C冰箱备用。
[0021]2、cDNA文库的构建
[0022]米用mRNA 纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分离 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Cat.N0.634903)进行建库，原理为 SMART (switch mechanism at 5 ' endofmRNAtemplate)。
[0023]实施例2:芍药相关基因的克隆
[0024]随机挑取5000个单克隆进行菌落PCR鉴定。取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。用灭过菌的1Oul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。依次加入:Taq buffer 2.5 μ L，MgCl2 (25mM) 1.8 μ L，dNTP (2.5mM) 1 μ L，M13+引物(1Opmol) 1 μ L，Μ13-引物(1Opmol) 1 μ L，Taq SI 0.4 μ L0 PCR 反应条件为 94°C预变性 5 分钟后，94°C 40秒，54°C 40秒，72°C 4分钟，35个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。待PCR反应进入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ul PCR产物加入3ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。选择条带单一扩增产物送至华大基因公司进行测序，获得芍药相关基因序列。
[0025]实施例3、PLAACT基因的生物信息学分析
[0026]本发明涉及的芍药乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA的长度为1218bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于l_1218bp。将芍药全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的AACT有较高的同源性，同时具有典型的acetyl-CoAC-acetyltransferase结构域。如图1。
[0027]实施例4、PLAACT基因功能的研究
[0028]1.原核表达载体的构建
[0029]以PLAACT cDNA 为模板，利用引物 Pl:5 ' -ATGGATGCAGGGGGAT-3 ' , P2:5' -TTACATGAGCTCTAGAACAAGGGC-3'进行PCR反应，反应体系同实验例2。取5ul扩增产物加入3ul溴芬兰跑电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为1218bp。利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化切胶回收产物。将回收产物和pCR4T0P0-TA vector (Invitrogen)连接转化后，对PCR检测合格的克隆提质粒，该质粒命名为pCR-T0P0AACT。
[0030]利用EcoRI对质粒pCR-T0P0AACT在37°C下酶切2小时，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物，同时利用EcoRI酶切pBAD/His B vector (Invitrogen) 2小时，加入5ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用回收试剂盒回收4092bp片段。
[0031]回收片段利用T4连接酶在15°C连接过夜。热击转化T0P10E.coli感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C过夜培养，挑选单克隆加入5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C过夜培养。经PCR和限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析，保存具有正确目标序列的重组质粒pBAD/HisB-AACT以及菌液用于表达转化。该表达载体命名为pBAD/HisB-AACT(图 3)。
[0032]2.工程菌的诱导表达
[0033]将含有pBAD/HisB-AACT的5ml T0P10E.coli菌液加入95ml含氨苄青霉素的LB培养基中，并分成2份于220rpm培养，当0D600为0.5时向其中一份中加入0.2%阿拉伯糖，另一份不加阿拉伯糖作为对照，在37°C诱导4h后取样。4°C超声破碎离心过N1-NTA琼脂糖凝胶柱纯化蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为41.4kD处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致。
[0034]3.粗酶液的制备
[0035]当菌体密度达到OD6tltl = 1.8-2.0A后，12000r/min, 4°C,离心Imin。收集菌体沉淀，重悬于PBS (pH7.4)缓冲液中，洗涤2次。加入10mg/ml的溶菌酶，室温放置15min，再加入100 μ I细胞裂解液，剧烈振荡Imin,冰浴Imin,重复6次。12000r/min, 4°C，离心20min,吸取上清液作为粗酶提取液，置冰上备用。
[0036]4.AACT活性测定
[0037]AACT可以催化2分子乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA和CoA，苹果酸在苹果酸脱氢酶(MDH)作用下生成NADH和草酰乙酸，而草酰乙酸和乙酰CoA在柠檬酸合酶(CS)作用下生成柠檬酸和CoA。用紫外分光光度计测定反应前后的0D340检测NADH的形成率，利用NADH的形成和乙酰辅酶A的降解之间的比例是2: I从而计算粗酶液AACT的活力。活性测定按以下条件进行:lmL 反应体系为 175mM Tris-HCl (pH 8.5)，0.12mM CoA, 2.0mM DTE, 2.6mM苹果酸，0.14mM NAD，58nkat苹果酸脱氢酶，18nkat柠檬酸合酶，0.05% (w/v)牛血清蛋白和重组粗酶。底物是20 μ M乙酰乙酰辅酶Α。终止反应后测得PLAACT酶活为220nkat/mg。
[0038]5.突变AACT活性测定[0039]以PLAACT cDNA 为模板，利用突变引物 P3:5 ' -ATGGATGCGGGGGGAT-3 '，P4:5' -TTACATGAGCTCTAGAACAAGGGC-3'进行PCR反应，原核表达载体的构建、工程菌的诱导表达、粗酶液的制备及粗酶液AACT活性测定方法同上，结果表明突变PLAACT转基因工程菌株经诱导后活力与正常PLAACT没有显著差异。
【权利要求】
1.一种芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之
(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列； (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.—种芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一: (1)具有SEQID N0.2所不的氣基酸序列； (2)SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。
3.重组载体，其特征在于:含有权利要求1所述的芍药乙酰CoA酰基转移酶(PLAACT)基因全序列或部分序列。·
【文档编号】C12N9/10GK103571857SQ201210262067
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月27日 优先权日:2012年7月27日
【发明者】黄璐琦, 袁媛, 汪周勇 申请人:中国中医科学院中药研究所