专利名称：叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4D3、蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW，还涉及该剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质和应用。
背景技术：
叶酸受体(folate receptor, FR)是一种叶酸结合蛋白，这些受体的表达对于细胞从血衆中摄取叶酸非常重要。人的叶酸受体有四种亚型，分别为FR-α，FR-β , FR-Y和FR - δ。其中FR-α主要表达在上皮细胞，对叶酸(folate, acid FA)的亲和力较强；FR-^只表达在活化的巨噬细胞表面和起源于造血细胞的恶性肿瘤细胞表面；FR-y被证实是一种造血组织的分泌蛋白，对叶酸的亲和力比FR-α低很多；FR_S在人的组织中表达量低， 很难在组织中被发现，其可能在调节性T细胞表面表达。在小鼠中，FR-α被称为叶酸结合蛋白I (Folbpl或FRl)，FR-β被称为叶酸结合蛋白2 (Folbp2/FR2)，叶酸结合蛋白3 (Folbp3)，也称为FR4，与人FR- δ高度同源，具有调节叶酸摄取的功能，同时FR4还与免疫相关，如FR4可以诱导脾脏和胸腺相关的淋巴组织和淋巴细胞。调节性T细胞(Regulatory T cells, Tregs)对于维持自身的免疫耐受和体内免疫自稳非常重要。在对Tregs的分子标记进行研究时发现FR4在天然Tregs上高表达，而且在维持细胞表型中起着非常重要的作用。在以前的研究中，我们鉴别了一种FR4 mRNA剪接异构体，其保留了野生型FR4基因的内含子3，简称为FR4v。目前，FR4的其他mRNA剪接异构体未见报道，发现FR4的mRNA剪接异构体为研究细胞的免疫调节和摄取叶酸奠定基础，同时为细胞分选提供更多的标记物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW ；本发明的目的之二在于提供mRNA剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质；本发明的目的之三在于提供含mRNA剪接异构体FR4/W的重组表达载体；本发明目的目的之四在于提供叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质的应用。为实现上述发明目的，技术方案为
I.叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。2.所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 7 所示。3.含所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW的重组表达载体。优选的，所述重组载体由叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W用XhoI和XbaI酶切后与经同样酶切的pCI-neo载体连接而成。4.所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W编码的蛋白质在细胞分选中作为细胞标记物的应用。
本发明中的剪接异构体是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点组合)产生不同的mRNA剪接异构体，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。本发明的有益效果在于本发明公开了叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W，为叶酸结合蛋白3新的剪接异构体，与叶酸结合蛋白3成熟的mRNA相比却失189bp的外显子3，根据三联密码子原理删除189bp后不会改变FR4的正确翻译，因此本发明获得的mRNA剪接异构体FR4/W能正确翻译为分子量为21kDa的蛋白质。FR4/W蛋白作为一种新蛋白质，能够作为细胞筛选的新标记物，同时为研究细胞对叶酸的摄取和免疫调节奠定了理论基础。
图I为FR4基因及其剪接异构体的PCR扩增结果。图2为FR4ZW的核苷酸与氨基酸的对照图。图3为小鼠脾细胞蛋白印迹结果图。图4为分离纯化的脾脏T细胞亚群结果图。图5为F0XP3阳性的⑶4+⑶25+T淋巴细胞亚群结果图。图6为RT-PCR分析脾脏T细胞亚群、⑶4+ T淋巴细胞亚群和⑶4+CD25+ T淋巴细胞亚群中FR4，FR4v和FR似？的mRNA表达水平结果图(第一泳道为Marker ;第二泳道为⑶4+CD25+ T淋巴细胞亚群，第三泳道为⑶4+ T淋巴细胞亚群，第四泳道为脾细胞亚群)。图7为分选的⑶8+T淋巴细胞、⑶4+CD25T淋巴细胞和⑶4+⑶25+T淋巴细胞中FR似 和FR4蛋白的蛋白表达结果(第一泳道为⑶8+T淋巴细胞亚群蛋白印记；第二泳道为⑶4+CD25—T淋巴细胞亚群蛋白印记；第三泳道为⑶4+⑶25+T淋巴细胞亚群蛋白印记)。图8为不同浓度的叶酸刺激⑶4+⑶25+ Tregs细胞增殖能力结果图(叶酸浓度分别为 O ng/mL, 2 ng/mL, 4 ng/mL, 6 ng/mL, 8 ng/mL 和 10 ng/mL)。图9为转染pCI-neo-FR4和pCI-neo_FR4/W质粒的细胞中FR4蛋白和FR4ZW的表达量。图10为⑶3抗体、⑶28抗体、IL-2和FA刺激条件下，对过表达FR4和FR似？蛋白细胞的增殖力影响结果图。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例I FR4不同剪接异构体的克隆与分析
实验材料为6到8周的雌性BALB/c小鼠，购买于中国医学科学院实验动物研究所(北京)，将购买的实验小鼠在无菌的条件下进行饲养。利用TRIzol 试剂盒(Invitrogen,USA)从BALB/c小鼠的脾细胞中提取RNA，然后将制备的RNA逆转录为第一链cDNA，具体步骤按RT-PCR试剂盒(TaKaRa，Japan)说明书进行。根据报道的小鼠的叶酸结合蛋白3 (命名为FR4)基因序列(Genbank No.NM_022888)设计扩增FR4基因编码序列(coding sequence, CDS)的引物，上游引物为 mFR4_F :5’-atggcacagtggtggcagat-3’ (SEQ ID NO. I),下游引物为 mFR4_R :5’-tcagggatggaacaacaggc-3’(SEQ ID NO. 2)。以制备的第一链 cDNA 为模板，mFR4_F 和mFR4-R分别为上、下游引物进行PCR扩增，PCR反应条件为98°C 10秒，68°C 40秒，30个循环。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图I所示。由图I可知，PCR扩增产物有3条目的片段，分别回收3条目的片段，然后分别连接pMD19-T载体，连接反应按试剂盒说明书进行。将PCR扩增产物亚克隆入pMD19-T载体后，送生工生物工程(上海)有限公司测序。测序结果显示，利用mFR4-F和mFR4-R为引物进行PCR扩增获得的3条目的条带，为FR4基因mRNA的3种不同剪接异构体，分别为具有735 bp的FR4编码序列(简称为FR4)、具有843bp的多了内含子3的FR4 (简称为FR4v)和具有546bp的缺少外显子3的FR4 (简称为FR4ZW)，其中FR4的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，FR4ZW的核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示。对FR4ZW核苷酸序列分析显示，编码546核苷酸的序列相当于FR4缺失189bp的外显子3的核苷酸序列，缺失189bp的外显子3为FR4的63个三联密码子，缺失后并不会改变FR4ZW mRNA的正确的翻译，如图2所示。并且成熟的FR4/W，FR4v和FR4 mRNA都是来自相同的前体mRNA。
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为了验证对FR4/W是否能翻译为蛋白质，将小鼠脾细胞进行蛋白印迹实验，并用抗-FR4抗体(Abeam, United Kingdom)进行检测，结果如图3所示。由图3可知，蛋白印迹出现两个条带，分子量分别约为28kDa和2 lkDa，分别对应于FR4和FR4/W翻译的蛋白质。因此，FR4/W蛋白能在小鼠脾细胞中成功表达，其分子量为21kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。实施例2、pCI-neo-FR4和pCI-neo_FR4似质粒的获得
以实施例I中获得的含的FR4或FR4/W片段的pMD19-T为模板，设计带酶切位点的引物，上游引物为:5’ -ccRctcRaRRCcaccatRRcacaRtRRtRRcaRat-3’ (SEQ ID NO. 8),下划线处为 XhoI 酶切位点，下游引物为:5’ -CRtRRRtRctctaRatcaRRRatRRaacaacaRRC-3’ (SEQ IDNO. 9)，下划线为XbaI酶切位点，然后进行PCR扩增，扩增产物分别用XhoI和XbaI进行双酶切，然后分别连接经同样酶切的pCI-neo载体上，得pCI-neo-FR4和pCI-neo-FR4ZW。实施例3流式细胞术
为了检测FR4/W在不同的T细胞亚群中是否存在不同的分布，通过流式细胞术分选三类高纯度的特异性T淋巴细胞亚群，具体为
从小鼠中分离小鼠脾细胞，将大约I X IO8脾细胞被染上荧光素FITC标记CD4抗体(anti-CD4-FITC)，荧光素 PE 标记 CD25 抗体(anti-CD25_PE)和 PerCP_Cy5. 5 标记 CD8 抗体(anti-CD8_ PerCP_Cy5. 5)，上述抗体购自美国eBioscience公司，抗体染色严格按试剂说明书操作步骤进行。然后用流式细胞仪(BD Biosciences, USA)进行分选，主要分选条件为按CD4\CD25抗体的同型对照抗体的荧光值划定阳性和阴性的界限，将被分选的细胞划分为⑶4+CD25+Treg细胞和⑶4+CD25—T细胞，然后进行分选。最终将小鼠淋巴细胞分选为三类细胞表面标记有⑶8抗体的为⑶8+T淋巴细胞亚群；细胞表面标记有⑶4，无⑶25抗体标记的为⑶4+⑶25_T淋巴细胞亚群和细胞表面标记有⑶4和⑶25的⑶4+CD25+T淋巴细胞亚群，分选结果如图4所示。由图4可知，分选的⑶8+Τ淋巴细胞亚群、⑶4+CD25_T淋巴细胞亚群和⑶4+⑶25+T淋巴细胞亚群的纯度分别达到99. 3%, 99. 0%和98. 3%。将分选出来的⑶4+⑶25+T淋巴细胞亚群再进行F0XP3的胞内染色，使用eBioscience公司F0XP3染色试剂盒染色，染色步骤按说明书进行。然后进行流式检测，结果如图5所示。由图5可知，在分离的⑶4+⑶25+T淋巴细胞亚群中，F0XP3阳性细胞的纯度达到约91%，这表明绝大部分CD4+CD25+ T淋巴细胞亚群是调节性T细胞(Regulatory T cells，Tregs)，命名为CD4+CD25
+ Tregs0利用RT-PCR分析脾脏T细胞亚群、⑶4+ T淋巴细胞亚群和⑶4+CD25+ T淋巴细胞亚群中 FR4, FR4v 和 FR4/W 的 mRNA,检测引物为，上游引物5’ -gggacaaactgctcagcgtct-3’(SEQ ID NO. 5)，下游引物5’-agacaccgcccactgttcct-3’ (SEQ ID NO. 6)，RT-PCR结果如图6所示。由图6可知，在脾脏T细胞亚群、⑶4+ T淋 巴细胞亚群和⑶4+CD25+ T淋巴细胞亚群中都有FR4/W，FR4v和FR4剪接异构体存在，并且FR似？的表达水平低于FR4v和FR4的表达水平。在室温下，利用蛋白提取试剂盒(T-PER Tissue Protein Extraction Reagent,Pierce, USA)对分选的⑶8+T淋巴细胞亚群、⑶4+⑶25_Τ淋巴细胞亚群和⑶4+CD25+T淋巴细胞亚群进行裂解5分钟，在4°C、12000rpm条件下离心5分钟，收集上清备用。将上清用氨基糖苷酶进行处理，然后进行蛋白印迹。将含有蛋白的上清进行SDS-PAGE电泳，转膜，抗体孵化，一抗为大鼠抗小鼠FR4 (Abeam, United Kingdom), 二抗为羊抗大鼠IgG (Abeam),同时以β-actin作为内参(一抗为兔抗鼠β-actin, 二抗为羊抗兔IgG,均购自Abcam公司)，结果如图7所示。蛋白印迹实验表明，FR4和FR4ZW蛋白在⑶4+⑶25+T淋巴细胞亚群的表达水平要高于⑶4+⑶25_T淋巴细胞亚群和⑶8+Τ淋巴细胞亚群中的表达水平。因此，FR4/W可能在⑶4+CD25 + Tregs中发挥独特的作用，可以作为一种新的标志物筛选⑶4+CD25+ Tregs 细胞。实施例4细胞增殖实验
将CD4+CD25+ Tregs细胞在含有浓度为300 U/mL的白细胞介素_2 (R&D Systems,USA), 5 μ g/mL 的 CD3 抗体(BD Biosciences)和 2 μ g/mL 的 CD28 抗体(BDBiosciences)条件下，用终浓度分别为O ng/mL,2 ng/mL,4 ng/mL,6 ng/mL,8 ng/mL和10 ng/mL的叶酸刺激CD4+CD25+ Tregs细胞，在37°C条件下孵化3天，然后用0.5 μ Ci (O. 0185 MBq) [3H]胸腺卩密唳脱氧核苷([3H]TdR ;Hartmann Analytics,Germany)标记18个小时,再用[3H]TdR的掺入数用液体闪烁计数器(Top Count ；Perkin Elmer, Germany)进行测量,每组实验都有三个副孔，结果如图8所示。由图8可知，⑶4+CD25+ Tregs细胞的增殖能力呈剂量依赖，浓度越高其能力越强。将CD4+CD25+ Tregs 细胞分别转染 pCI-neo_FR4 和 pCI-neo-FR4/W 质粒然后在预包被有浓度为5 μ g/mL的⑶3抗体和浓度为2 μ g/mL的⑶28抗体的96孔板中培养3天。然后取部分样品利用蛋白印迹检测转染pCI-neo-FR4和pCI-ne0-FR4/W质粒的细胞中FR4蛋白和FR4/W的表达量(蛋白印迹方法同实施例2)，结果如图9所示。由图9可知，转染的⑶4+⑶25+ Tregs细胞中FR4或FR4ZW蛋白的水平远高于未转染的细胞。通过配对T检验来分析转染的细胞和未转染的细胞之间，FR4和FR4/W蛋白的丰度，P值小于O. 05认为是有显著性差异。按照上述方法转染⑶4+CD25+ Tregs,并在含⑶3抗体和⑶28抗体的96孔板中培养，pCI-neo-FR4转染细胞加入300 U/mL白细胞介素-2 (IL-2)和浓度为4 ng/mL FAjfpCI-neo-FR4/W转染细胞分为3个组，第一组加入300 U/mL白细胞介素-2和浓度为4 ng/mL FA，第二组加入300 U/mL白细胞介素-2，第三组不加入白细胞介素-2和FA ;同时设置对照组，以未转染的⑶4+⑶25+ Tregs为对照，分为四个组，第一组在预包被孔中加入300 U/mL白细胞介素-2和浓度为4 ng/mL FA培养，第二组在预包被孔中加入300 U/mL白细胞介素-2培养，第三组在预包被孔中培养，第四组在未预包被的孔中加入加入300 U/mL白细胞介素-2培养；还设置培养基组(孔中只加入等量培养基)和FA组(孔中只加入等量FA)为空白对照，在培养的最后18小时内，将细胞标记上O. 5 μ Cl (O. 0185 MBq) [3H] thymidine。然后用[3H]TdR的掺入数用液体闪烁计数器(Top Count ；Perkin Elmer ；Germany)进行测量，所有的实验都有三个副孔，其结果如图10所示。由图10可知，相对于仅仅过表达了FR4/W的细胞，添加了叶酸的细胞具有更强的增殖力。在CD3抗体和CD28抗体，IL-2以及FA同时刺激条件下，过表达FR4和FR4/W的细胞均具有增强细胞的增殖力，表明两个受体至少有一个受体具有大量摄入叶酸的能力。并且，在FA存在的条件下过表达FR4相对于过表达FR4ZW使细胞的增殖能力更强。通过用配对T检验来分析不同条件下，⑶4+⑶25+ Tregs 的增殖能力。产值小于O. 05认为是有显著性差异。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W，其特征在于所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR似？的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.权利要求I所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4ZW编码的蛋白质，其特征在于所述蛋白质的氣基酸序列如SEQ ID NO. 7所不。
3.含权利要求I所述mRNA剪接异构体FR4ZW的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述重组载体由叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W用XhoI和XbaI酶切后与经同样酶切的pCI-neo载体连接而成。
5.权利要求2所述叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4/W编码的蛋白质在细胞分选中作为细胞标记物的应用。
全文摘要
本发明公开了叶酸结合蛋白3的mRNA剪接异构体FR4D3，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，编码如SEQIDNO.7所示的氨基酸序列，还公开了含有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的重组载体，本发明公开的剪接异构体FR4D3编码的蛋白质可以作为细胞分选的标记物，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/12GK102776199SQ20121026730
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者倪兵, 吴玉章, 田易 申请人:中国人民解放军第三军医大学