专利名称：分离重组人干扰素α1b异构体的纯化工艺及其检测方法
技术领域：
本发明涉及含肽的医药配制品，特别是涉及蛋白质的分离纯化技术，尤 其是涉及用Q Sepharose High Performance强阴离子交换介质，利用缓慢的pH梯度洗脱， 把重组人干扰素α Ib与其相关蛋白质、异构体高分辨分离的方法。
背景技术：
干扰素(Interferon，IFN)是一种广谱抗病毒剂，具有广谱的抗病毒、抗 增殖以及免疫调节活性。干扰素已批准用于治疗许多疾病，包括慢性乙型肝炎、慢性丙型肝 炎、多发性硬化症、毛细胞白血病等。干扰素一般分成I型和II型，I型包括α、β、ω干扰素，II型包括Υ干扰素。 其中干扰素α 1可分为IFNa la、IFNa lb、IFNa Ic等亚型，干扰素a 2可分为IFNa 2a、 IFNa 2b、IFNa 2c等亚型。1986年美国FDA批准Roche公司的重组人干扰素a 2a和 Schering公司的重组人干扰素α 2b上市，1990年重组人干扰素β上市，1993年重组人干 扰素Y上市。干扰素α 1的DNA序列和氨基酸序列首先由Nagata等发表于1980年(Nature 287 :401-408)。干扰素α 1由166个氨基酸组成，其第114位氨基酸为Ala。侯云德等人 将Nagata等从正常人白细胞克隆的IFNa 1命名为IFNa lb。干扰素a D的DNA序列和氨基酸序列首先由Geoddel等发表于1981年(Nature 290:20-26)。干扰素aD由166个氨基酸组成，其114位氨基酸为Val。侯云德等人将由 Goeddel等从人髓母样细胞系(KG-1)克隆的IFN a D命名为IFNa la。黎孟枫等(自然科学进展，1992(2) :175_179)从中国汉族人胎肝细胞DNA中克隆 出一种干扰素α 1新变种，IFNa l/158Val，即与Nagata等克隆的IFNa 1的cDNA序列比 较，在第472位核苷酸为G，而不是T，导致第158位氨基酸为Val，而不是Leu。侯云德等人 将从正常中国人克隆的IFNa l/158Val命名为IFNa lc。IFNa Ia与IFNa Ib仅在第114位氨基酸有区别。IFN a Ic与IFN a Ib仅在第158 位氨基酸有区别。IFNa Ic与IFNa Ia在第114位和158位两个氨基酸有区别，见表1。 表1. IFNa 1亚型的区分及核苷酸、氨基酸序列比较干扰素a 1含有第1、29、86、99以及139位氨基酸的5个半胱氨酸残基。在其天然 构象中，干扰素a Ib在Cys1-Cys99之间，及Cys29-Cys139之间形成两对分子内二硫键。由于 在Cys86残基留下游离的巯基，因此分子间的游离巯基易形成二聚体，影响纯化的效果。二 硫键之间的错配，例如Cys1与Cys86形成二硫键，或者只形成一对二硫键，其它三个半胱氨酸游离，均会产生异构体。而干扰素α Ib的任何氨基酸氧化、乙酰化、脱酰胺以及个别氨基 酸脱落，均会产生干扰素α Ib的相关蛋白质。由于干扰素α Ib的相关蛋白质、异构体与干扰素α Ib的理化性质很相似，实验证 明应用单克隆亲和层析、疏水层析均无法把二者分离。现有技术重组人干扰素α Ib纯化工艺方法包括以下两种工艺方法1 步骤为离心一盐酸酸化一离心一碱中和一硫酸铵盐析一离心一硫酸 铵盐析一离心一S^hadex G-25脱盐一CM Sepharose F. F弱阳离子交换层析一单克隆抗 体亲和层析一S印hacryl S-100分子筛层析。具体实施步骤如下1、勻浆裂解菌体重组人干扰素α Ib是通过大肠杆菌(E. coli)工程菌的发酵来 制备的，目标蛋白在胞内可溶性表达，发酵完毕离心收集菌体，保存在-30°C。纯化前，取出 冻存的菌体解冻，加入Tris-EDTA(50mmol/L Tris-HCl、5mmol/L EDTA)溶液，菌悬液浓度 10g/ml左右，用搅拌机拌勻，搅拌速度850rpm。用压力为50MPa的高压均质机(勻浆机) 勻浆两次，每次1.5小时。用蠕动泵把勻浆液泵入CEPA ZlOl高速连续流离心机，离心机转 速14000rpm，收集上清液。2、盐酸酸化在勻浆上清液中逐步加入3mol/L HC1，搅拌机转速850rpm，pH值调 至2. 3。用连续流离心机离心，离心机转速14，OOOrpm,离心后收集上清。3、碱中和用3mol/LNaOH中和pH值至7. 2，作用时间IOmin04、35%硫酸铵盐析依据上清液体积计算35%硫酸铵饱和度所需量，加 (NH4)2S04，搅拌机转速850rpm至硫酸铵溶解。静置2小时后离心，离心机转速14，OOOrpm， 收集上清液。5、90%硫酸铵盐析根据上清液体积计算90%饱和度所需硫酸铵量，加 (NH4) 2S04,搅拌机转速850rpm至硫酸铵溶解，放置过夜后离心，离心机转速14，OOOrpm,收 集沉淀，用5L AAB (醋酸钠-醋酸CH3COONa-CH3COOH缓冲液)溶解沉淀。6、离心用高速冷冻离心机，转速4000rpm，离心7min，收集上清。7、Sephadex G-25脱盐把上清上到G-25柱，收集目标峰。用Sephadex G-25可 以实现在线清洗，脱盐快速，省时。8,CM Sephrose F. F弱阳离子交换层析用pH4. 4的0. 005mol/L AAB (醋酸钠-醋 酸 CH3COONa-CH3COOH 缓冲液)平衡 2CV，用 0. 2mol/L AAB (醋酸钠-醋酸 CH3COONa-CH3COOH 缓冲液)洗脱，当记录仪出峰时开始收集，峰至基线附近时结束收集。9、单克隆抗体亲和层析用分子量为8k、总面积为2m2的超滤膜超滤磷酸盐缓冲 液PBS溶液和甘氨酸-盐酸Gly-HCl溶液。上样、清洗用PBS清洗10CV。洗脱用0. lmol/L Gly-HCl (ρΗ2· 5)洗脱，出峰时 收集，峰至基线附近结束收集，用3mol/LNa0H调整pH至7. 0左右。10,Sephacryl S-100分子筛层析上样、洗脱、收集，观察记录图谱，当上升至半峰 高时开始收集，当峰降至半峰略低时，结束收集，收集液即为IFNα Ib原液。该工艺方法1所获得重组人干扰素α Ib原液所有检测项目均符合《中国药典》的 规定，采用SEC-HPLC方法检测，纯度达99%以上，但采用RP-HPLC方法检测，有两个主峰， PKpeek 1)比例约为65%，P2(peek 2)比例约为35%，证明本工艺方法无法把重组人干扰 素α Ib与其相关蛋白质、异构体分离开来。
工艺方法2 见中国专利ZL200410050936. 1，名称为“重组人干扰素α Ib的纯 化工艺”。其步骤为Streamline DEAE弱阴离子凝胶扩张床吸附一单克隆抗体亲和层析 —SephacrylS-IOO分子筛层析。Streamline凝胶是在普通琼脂糖凝胶的基础上，加入石英 成分，增加了密度，并形成一定的密度梯度，柱塞可上下升降，增加柱床体积，这些独特的设 计使得Streamline凝胶可在从下向上的平衡缓冲液的作用下形成稳定的扩张柱床，可以 将来经澄清的带杂质的菌体勻浆液直接上样。在上样过程中，杂质从凝胶颗粒之间洗掉，而 蛋白质等生物分子则吸附在凝胶上，经清洗后，再将凝胶沉降下来，降下柱塞，减少柱床体 积，洗脱目标蛋白，减少收集体积，浓缩样品。扩张床吸附的优点在于，可直接将未经澄清的 菌体勻浆液直接上样，不必经过离心，扩张床一步就起到澄清、浓缩和初步纯化的作用，大 大简化了纯化工艺。其具体实施步骤如下1、勻浆裂解菌体取出冻存的菌体解冻，加入PH值为7. 4的Tris-HCl缓冲溶液， 菌悬液浓度5g/ml左右，用搅拌机拌勻。用压力为50MPa的高压均质机勻浆两次。2、STREAMLINE DEAE 扩张床吸附层析(Expanded Bed Adsorption)层析柱STREAMLINE200，Φ 200mm X 100cm，凝胶STREAMLINE DEAE，柱床体积 4. 5L，层析系统扩张床吸附手动纯化系统，由两台WATS0N-MARL0W蠕动泵，气泡捕捉器，紫 外检测仪，记录仪，手动阀门以及硅胶管道组成。平衡流速300cm/h, IOCV 的 STREAMLINE 平衡液(pH7. 4,50mM Tris-HCl)平衡 STREAMLINE 柱。上样100L菌体勻浆液，流速300cm/h上样。清洗用pH7. 4、50mM Tris-HCl的平衡液，流速300cm/h清洗柱床，洗至紫外吸收
接近基线。洗脱用0. 4M NaCl、pH7. 4的50mMTris-HCl洗脱液，进行一步洗脱，收集洗脱峰。再生用0. 5MNa0H-lMNaCl再生液，注射用水，清洗STREAMLINE DEAE凝胶。3、单克隆抗体亲和层析层析柱Φ 90mmX 70cm，蠕动泵，紫外检测仪，记录仪。单 抗胶 MCAb-S印harose F. F.。平衡用磷酸盐缓冲液PBS平衡单抗柱。上样将扩张床吸附层析洗脱收集液上样至单抗柱。清洗用PBS清洗柱内未吸附的杂质。洗脱用0. lmol/L甘氨酸-盐酸Gly-HCl (pH2. 5)洗脱液将吸附在柱上的干扰素 洗脱下来，收集洗脱峰，用3mOl/LNa0H调整pH值至7. 0左右。再生用Tris-HCl，0. 5mol/L NaCl-0. lmol/L CH3COONa 清洗残留的柱内杂质。用 PBS平衡单抗柱。4、Sephacryl S-100 分子筛层析层析柱 Φ 130mmX70cm。平衡用PBS平衡3个柱床体积。上样将亲和层析洗脱收集液上到分子筛柱内。洗脱用PBS洗脱样品，收集干扰素主峰，即为IFN α Ib原液。再生用0. 5Μ NaOH再生分子筛柱。所获得重组人干扰素α Ib原液所有检测项目均符合《中国药典》的规定，采用 SEC-HPLC方法检测，纯度达99%以上，但采用RP-HPLC方法检测，有两个主峰，Pl比例约为35%, P2比例约为65%，证明本工艺方法也无法把重组人干扰素α Ib与其相关蛋白质、异 构体分离开来。由上述现有技术工艺方法1和2可见，其纯化过程中都使用了单克隆抗体亲和层 析，而在使用单克隆抗体亲和层析纯化干扰素α Ib的过程中，单抗胶上的鼠IgG有脱落的 可能，进而造成干扰素α Ib原液污染。因此，需要增加除去鼠IgG的纯化步骤才能使原液
质量更高。虽然上述工艺方法1和2纯化得到的干扰素α Ib原液都能符合《中华人民共和 国药典》2005年版三部“注射用重组人干扰素α lb”原液纯度检定标准的分子筛高效液 相色谱法(SEC-HPLC)的要求，重组人干扰素α Ib呈一个主峰，主峰面积不低于总面积的 95%。但是参照欧洲药典的重组人干扰素α 2原液纯度检定标准的反相高效液相色谱法 (RP-HPLC)来检定经上述工艺方法1和2纯化所得到的重组人干扰素α Ib原液，则呈两个 主峰，除了重组人干扰素α Ib之外，还有其相关蛋白质、异构体。重组人干扰素α Ib的相 关蛋白质、异构体，可能是氨基酸修饰，例如乙酰化，可能是个别氨基酸脱落，也可能是蛋白 质分子内二硫键错配。因此，除去重组人干扰素α Ib中的相关蛋白质、异构体，对于提高药 品质量具有非常重要的意义。申请号为CN200410069391. 9的专利申请也公开了一种重组人干扰素α Ib的纯化 工艺，其重组人干扰素α Ib在质粒构建时，使用的载体与过去的可溶性表达菌种使用的载 体不一样，其工程菌在发酵表达过程中，形成包涵体，而不是大肠杆菌胞内可溶表达；其纯 化过程包括包涵体离心、沉淀，包涵体变性和包涵体复性等步骤；其疏水柱层析使用Phenyl Sepharose FF，分辨率不高，使用常规的盐梯度洗脱，也不能很好地分离重组人干扰素alb 相关蛋白质、异构体。总而言之，利用单克隆抗体亲和层析的方法纯化效率高，但可能有鼠IgG脱 落等缺点，用这种纯化方法获得的重组人干扰素a Ib原液，用分子筛高效液相色谱法 (SEC-HPLC)检测只有一个主峰，但是用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测有两个主峰， 即Pl (重组人干扰素a Ib峰)及P2 (重组人干扰素a Ib相关蛋白质、异构体峰)。这种原 液符合《中国药典》的SEC-HPLC检测的标准，但如果参考《欧洲药典》的RP-HPLC的检测方 法，达不到单一主峰的纯度。并且，在检测重组人干扰素a Ib的方法中，现有技术还没有用 于检测的RP-HPLC方法。因此，为除去重组人干扰素a Ib的相关蛋白质、异构体，以获得符合类似《欧洲药 典》干扰素a 2反相高效液相色谱法(RP-HPLC)标准的重组人干扰素a lb，满足临床应用 的需要，有必要发明新的纯化方法分离除去干扰素a Ib的相关蛋白质、异构体及检测其结 果的RP-HPLC检测方法。发明内容本发明要解决的技术问题在于避免上述现有技术的不足之处，克服本 领域技术人员的偏见，在经过Streamline扩张床吸附、单克隆抗体亲和层析或者经过酸 化、硫酸铵盐析、CM弱阳离子交换层析和单克隆抗体亲和层析初步纯化的基础上，应用Q SepharoseHP层析和缓慢的pH梯度洗脱方法，一是除去使用单克隆抗体亲和层析过程中可 能脱落的鼠IgG，二是克服已有的干抗素α Ib纯化方法生产出来的原液用分子筛高效液相 色谱法(SEC-HPLC)检测为单峰，而用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测为两个主峰的缺 陷，从而提供一种分离除去干扰素α Ib的相关蛋白质、异构体的纯化工艺方法，达到反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测结果为单一主峰的目的，进一步提升药品质量。为书写表述简洁方便，本发明中部分化学物质名称采用了代号或行业内简称来替 代，声明如下TE缓冲液即Tris-EDTA，Tris为三羟甲基氨基甲烷，EDTA为乙二胺四乙酸；Tris-HCl 用盐酸调整pH的三羟甲基氨基甲烷溶液；PBS 磷酸盐缓冲液；Gly-HCl 甘氨酸-盐酸CV CoIumn Volume 柱床体积QHP Buffer A :pH 5. 5,0. 04mol/L 的醋酸铵-醋酸缓冲液 CH3C00NH4-CH3C00H，简 写为 NH4Ac-HAc ；QHP Buffer B :pH4. 0,0. 04mol/L 的醋酸铵-醋酸缓冲液 CH3C00NH4-CH3C00H，简写 为 NH4Ac-HAc,电导为 5. 2ms/cm ；QHP Buffer C :pH 5. 5、0. 04mol/L 的醋酸钠-醋酸缓冲液 CH3COONa-CH3COOH,简写 为 NaAc-HAc ；QHP Buffer D :ρΗ4· 0,0. 04mol/L 的醋酸钠-醋酸缓冲液 CH3COONa-CH3COOH,简写 为 NaAc-HAc ；QHP 高盐 Buffer :ρΗ6· 0、0· 02mol/L 的 CH3C00NH4+2mo 1/L 的 NaCl，CH3COONH4 简写 为 NH4Ac。本发明解决所述技术问题实际采用的技术方案是提出一种用Q Sepharose HP层 析和PH梯度洗脱把重组人干扰素α Ib与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法，用于 在经过细菌破碎、Streamline扩张床吸附和单克隆抗体亲和层析初步纯化处理的基础上， 经过高分辨的QHP强阴离子交换层折，利用缓慢的pH梯度洗脱，除去重组人干扰素α Ib的 相关蛋白质、异构体，获得高纯度的重组人干扰素α Ib的纯化工艺方法，包括如下步骤Α.勻浆裂解菌体菌体加入pH值为7. 4的Tris-HCl缓冲溶液，菌悬液浓度5g/ml 左右，用压力为50MPa的高压均质机勻浆两次；B. STREAMLINE DEAE 扩张床吸附层析平衡用pH7. 4 的 50mM Tris-HCl 平衡液平衡 STREAMLINE 柱；上样将勻浆液进行上样；清洗用pH7. 4的50mM Tris-HCl平衡液，洗至紫外吸收接近基线；洗脱用0. 4M的NaCl和pH7. 4的50mM Tris-HCl洗脱液，0-100% B梯度洗脱，收 集洗脱峰；再生用0. 5M NaOH-IM NaCl再生液、注射用水，清洗STREAMLINE DEAE凝胶；C.单克隆抗体亲和层析单抗胶为MCAb-S^harose F. F.；平衡用PBS平衡单抗柱；上样将扩张床吸附层析洗脱收集液上样至单抗柱；清洗用PBS清洗柱内未吸附的杂质；洗脱用pH2. 5的0. lmol/L甘氨酸-盐酸Gly-HCl洗脱液将吸附在柱上的干扰素 洗脱下来，收集洗脱峰；再生用Tris-HCl，0. 5mol/L NaCl-O. lmol/L CH3COONa 清洗残留的柱内杂质，用PBS平衡单抗柱；D.Q Sepharose HP层析，利用缓慢的pH梯度洗脱目标蛋白；平衡用ρΗ5· 5 的 0. 04mol/L CH3C00NH4_CH3C00H 缓冲液平衡 QHP 柱；上样用无热原水稀释样品，使电导低于7mS/cm ；用pH5. 5 的 0. 04mol/L CH3C00NH4_CH3C00H 缓冲液平衡至 UV、pH 和 Cond 三线走 平；用pH4. O的0. 04mol/L CH3C00NH4_CH3C00H缓冲液梯度洗脱，洗脱梯度为O 100% B，25 30CV，利用缓慢的pH梯度把相关蛋白质、异构体分离开来；收集目标峰根据UV280nm检测峰形，收集洗脱峰；边收集边加入0. 5mol/LNa2HP04 调节PH值至7. 0左右；再生依次用pH6. 0 的 0. 02mol/L CH3C00NH4+2mol/L NaCl、0. 5mol/L NaOH、注射 用水、pH5. 5的0. 04mol/L CH3C00NH4-CH3C00H缓冲液清洗残留在QHP柱内的杂质；E.超滤浓缩；F. Sephacryl S-100 分子筛层析平衡用PBS平衡；上样将超滤浓缩液上到分子筛柱内；洗脱用PBS洗脱样品，除去干扰素聚体，收集干扰素主峰，即为IFNa Ib原液。上 述技术方案中，所述步骤B的STREAMLINE DEAE扩张床吸附层析中的洗脱是用0. 12 0. 15M NaCl、pH7. 4的50mM Tris-HCl进行一步法洗脱，收集洗脱峰。所述步骤D中用pH4. 0的0. 04mol/L CH3C00NH4-CH3C00H缓冲液梯度洗脱是分步 PH梯度程序，即先0-20% B 5min，后20% -50% B，20CV进行洗脱。本发明还可以采用另一种技术方案完成提出一种用Q Sepharose HP层析和pH 梯度洗脱把重组人干扰素α Ib与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法，用于在经过 细菌破碎、酸化、硫酸铵盐析、CM弱阳离子交换层析、单克隆抗体亲和层析初步纯化处理的 基础上，经过高分辨的QHP强阴离子交换层析，利用缓慢的PH梯度洗脱，除去重组人干扰素 α Ib的相关蛋白质、异构体，获得高纯度的重组人干扰素α Ib的纯化工艺方法，包括如下 步骤Α.勻浆裂解菌体菌体加入 50mmol/LTris-HCl、5mmol/L EDTA 的 Tris-EDTA 溶液 溶解，菌悬液浓度10g/ml左右，用压力为50MPa的高压勻浆机勻浆两次；高速连续流离心 机，转速14，OOOrpm离心处理，收集上清液；B.盐酸酸化在勻浆上清液中逐步加入3mol/LHCl，pH值调至2. 3，静置2小时。 用连续流离心机离心，离心机转速14，OOOrpm，离心处理后收集上清液；C.碱中和用 3mol/LNaOH 中和 pH 值至 7. 2 ；D. 35%硫酸铵盐析依据上清液体积计算35%硫酸铵饱和度所需量，搅拌至硫酸 铵溶解，静置2小时后离心，离心机转速14，OOOrpm，收集上清液；E. 90%硫酸铵盐析根据上清液体积计算90%饱和度所需硫酸铵量，搅拌机至硫 酸铵溶解，放置过夜后离心处理，离心机转速14，OOOrpm ；收集沉淀，用5LCH3C00Na-CH3C00H 缓冲液溶解沉淀；F.离心处理用高速冷冻离心机，转速4，OOOrpm,离心7min，收集上清液；
G. Sephadex G-25脱盐柱平衡，把上清液上到G-25柱，收集目标峰；H. CM Sephrose F. F 弱阳离子交换层析上样，用 ρΗ4· 4 的 0. 005mol/ LCH3COONa-CH3COOH 缓冲液平衡 2CV，用 0. 2mol/L CH3COONa-CH3COOH 缓冲液洗脱、收集目标 峰；I.单克隆抗体亲和层析上样、清洗用PBS清洗IOCV ；洗脱用pH2.5的0. lmol/L甘氨酸-盐酸Gly-HCl洗脱，出峰时收集，峰至基线附 近结束收集，用3mol/LNa0H调整pH至7. 0 ；J.Q Sepharose HP层析，利用缓慢的pH梯度洗脱目标蛋白；用pH4. 0 的 0. 04mol/L CH3C00NH4_CH3C00H缓冲液梯度洗脱；洗脱梯度0 100% B，25 30CV，利用缓慢的pH梯度把相关蛋白质、异构体分离开来；L.超滤浓缩；M. Sephacryl S-100分子筛层析上样、洗脱、收集，收集液即为重组人干扰素 α Ib原液。上述技术方案中，所述步骤J中的梯度洗脱是分步梯度洗脱，即先0-20% B 5min, 后20% -50% B，20CV进行洗脱程序。所述CH3C00NH4-CH3C00H 缓冲液可以替换为 CH3COONa-CH3COOH 缓冲液。所述步骤M中的分子筛层析柱是SuperdeX75。为了检测本发明分离纯化工艺方法所得的重组人干扰素α Ib原液是否达到《欧 洲药典》的重组人干扰素α Ib原液纯度检定标准，本发明还提供了一种用于检测上述重组 人干扰素α Ib原液的反相高效液相色谱法(RP-HPLC)，其工艺条件和程序步骤如下色谱柱采用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；应用phenomenex C18柱， 4. 6mm X 250mm，CV = 4. 15ml，孔径 30nm,粒径 5 μ m ；流动相A :70% H20+30% 乙腈 ACN+0. 2%三氟乙酸 TFA ；流动相B 20% H20+80% 乙腈 ACN+0. 2%三氟乙酸 TFA ；流速l.Oml/min，进行梯度洗脱；进样量40-100 μ 1，等同于2040 μ g，于波长210nm 处检测，按面积归一化法计算重组人干扰素α Ib的纯度；洗脱梯度程序如下 上述检测方法还可以采用另外一种用于检测上述重组人干扰素α Ib原液的反相 高效液相色谱法(RP-HPLC)技术方案，其工艺条件和程序步骤如下色谱柱采用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；应用phenomenex C18柱， 4. 6mm X 250mm，CV = 4. 15ml，孔径 30nm,粒径 5 μ m ；流动相A :70% H20+30% 乙腈 ACN+0. 三氟乙酸 TFA ；流动相B 20% H20+80% 乙腈 ACN+0. 三氟乙酸 TFA ；流速1. Oml/min，进行梯度洗脱；进样量40-100 μ 1，即20-40 μ g，于波长210nm处 检测，按面积归一化法计算重组人干扰素α Ib的纯度；洗脱梯度程序如下 同现有技术相比较，本发明的有益效果在于纯化周期缩短了 20%，无需使用单 抗亲和层析，避免了单抗脱落造成的污染；且利用PH梯度洗脱分离了干扰素α Ib的相关蛋 白质和/或异构体，原液反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测达到单一主峰的纯度；进一步 提高了生产效率，降低了生产成本，提升了原液质量。
图1是本发明重组人干扰素α Ib分离纯化方法在0-100% B, 25CV梯度洗脱条件 下的QHP层析图谱；图2是本发明重组人干扰素α Ib分离纯化方法在0_100% B, 30CV梯度洗脱条件 下的QHP层析图谱；
图3是本发明重组人干扰素α Ib分离纯化方法0-20% B 5Min，20%-50% B分步 梯度条件下的QHP层析图谱；图4是本发明重组人干扰素α Ib分离纯化方法所得的重组人干扰素α Ib原液的 RP-HPLC检测方法(phenomenex柱和Vydac柱)图谱；图5是本发明重组人干扰素α Ib分离纯化方法所得的重组人干扰素α Ib的基质 辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-T0F-MS)图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详述。以下实施例中QHP缓冲液实施例1 利用Q Sepharose HP强阴离子层析和ρΗ梯度洗脱把重组人干扰素α Ib 与重组人干扰素α Ib相关蛋白质分离的高度纯化(实验窒规模)。本实施例纯化工艺方 法是在上述现有技术工艺方法1和2的单克隆抗体亲和层折步骤之后，增加Q Sepharose High Performance (QSepharose HP，简称QHP)强阴离子交换层析步骤完成的。目的是把重 组人干扰素α Ib与重组人干扰素α Ib相关蛋白质分离开来，除去相关蛋白质。层析柱和凝胶:GEHealthcare (原 Arnersham)公司 XK50 层析柱 <j5 50mmX40cm， QSepharose HP强阴离子凝胶。层析系统GE Healthcare 公司(原 Amersham 公司)AKTA explorer 100。系统处理用Unicorn V4. 0软件预先编写的清洗程序(水洗、0. 5mol/L NaOH洗、 0. 5mol/LNa0H泡30min、水洗)清洗系统，并除去系统和管道的热原。QHP柱处理把QHP柱接在柱位2，用Unicorn V4. 0预先编写的QHP柱清洗程序 (水洗、0. 5mol/L NaOH 洗、0. 5mol/L NaOH 泡 30min、高盐洗、QHP Buffer A 平衡)处理 QHP 柱，并除热原。平衡用QHPBufferA 平衡 QHP 柱 1 2CV。准备单抗收集液即取前一步单克隆抗体亲和层析初步纯化后得到的干扰素 α Ib样品。用无热原注射用水调节电导，使电导低于7mS/cm。上样设定 FlowRate :20ml/min、Flowpath :A12、Columnposition :Position 2、 Alarmpressure :0· 5MPa、Autozero UV、Record on、输入文件名，将稀释后的原液上样至QHP 柱。上样结束后，把进液管换入QHPBufferA中。QHP BufferA 平衡=Flowpath :A11，用 QHP BufferA 平衡 6CV,流速 20ml/min,至 UV、pH和Cond三线走平。QHP Buffer B梯度洗脱用QHP Buffer B开始梯度洗脱。流速20ml/min。洗脱 梯度0 100% B，25CV。利用缓慢的PH梯度把相关蛋白质、异构体分离开来。收集目标峰根据UV280nm检测峰形，收集Pl峰，当紫外吸收曲线快掉头向上时， 停止收集，做好标记，随后出现P2峰。边收集目标蛋白，边加入0. 5mol/LNa2HP04 (pH9. O左 右)调节PH值至7. O左右。QHP层析图谱见图1，在O 100% B，25CV这种梯度条件下，峰 1尚未下降到基线，就已掉头向上形成峰2峰1与峰2有部分重叠，说明这种梯度条件并不
王困相再生依次用0朋高盐8吐€61~、0.511101/1 NaOH、注射用水、QHP Buffer A清洗残留 在QHP柱内的杂质。纯化24批，本实施例纯化工艺方法得到的重组人干扰素α Ib经分子筛高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测，平均纯度为99. 5%。实施例2 重组人干扰素α Ib高度纯化(硫酸铵盐析、单克隆抗体、Q Sepharose HP法)。本实施例在现有技术工艺方法1的单克隆抗体层析步骤后加入和实施例1相同 的Q S印haroseHP层析步骤，以及超滤浓缩步骤完成；利用缓慢的pH梯度，把重组人干扰素 α Ib和与其相关蛋白质、异构体分离开。全部步骤如下(1)勻浆裂解菌体；(2)盐酸酸化；(3)碱中和；(4)35%硫酸铵盐析；(5)90%硫 酸铵盐析；(6)离心；(7)S印hadex G_25脱盐；(8)CM Sephrose F. F弱阳离子交换层析； (9)单克隆抗体亲和层析；(IO)Q Sephrose HP强阴离子交换层析；(11)超滤浓缩；(12) Sephacryl S-100分子筛层析。按照《中国药典》规定，如采用单克隆抗体亲和层析法纯化，应进行IgG残留量检 定，采用双抗体夹心酶联免疫法测定。通过本实施例工艺方法获得的重组人干扰素α Ib原 液和现有技术没有采用Q Sepharose HP柱层析纯化的鼠IgG残留量数据比较见表2。 表2.使用Q Sepharose HP前后检测数据比较从表2可见，使用Q Sepharose HP层析柱和缓慢的pH梯度洗脱后，鼠IgG残留量 和宿主蛋白残留量都检测不到，与使用Q Sepharose HP层析柱之前比较，具有意想不到的 效果。实施例3 =Streamline扩张床吸附、单克隆抗体、Q Sepharose HP法。本实施例在 现有技术工艺方法2的单克隆抗体层析步骤后加入和实施例1相同的Q Sepharose HP层 析步骤，以及超滤浓缩步骤完成；利用缓慢的PH梯度，把重组人干扰素α Ib和与其相关蛋 白质、异构体分离开。全部步骤如下(1)勻浆裂解菌体；(2) STREAMLINE DEAE扩张床吸附层析(Expanded BedAdsorption) ； (3)单克隆抗体亲和层析；(4) Q Sepharose HP强阴离子层析；(5)超滤浓 缩；(6) Sephacryl S-100 分子筛层析。通过本实施例工艺方法获得的重组人干扰素α Ib原液检测结果同实施例2。实施例4 利用Q Sepharose HP强阴离子层析和pH梯度洗脱把重组人干扰素α Ib 与其相关蛋白质/异构体分离的高度纯化(生产规模)。本实施例将现有技术工艺方法1 中的第9步单克隆抗体亲和层析替换为和实施例1相同的Q Sepharose HP强阴离子交换 层析，因QHP层析收集液体积较大，再在QHP层析步骤后增加超滤浓缩来完成。全部步骤如 下步骤1至8同现有技术工艺方法1的步骤1至8相同；后续步骤如下9、QHP强阴离子交换层析，工艺条件和操作方法如下
INDEX 层析柱 Φ IOOmmX 50cm，柱床体积 2. 0L。层析系统GE Healthcare 公司(原 Amersham Pharmacia 公司)AKTA explorer 100。系统处理用Unicorn V4. 0软件预先编写的清洗程序(同实施例1)清洗系统，并 除系统和管道的热原。QHP柱处理把QHP柱接在柱位2，用Unicorn V4. 0预先编写的QHP柱清洗程序 (同实施例1)，用0. 5mol/LNa0H和注射用水清洗QHP柱，并除热原。平衡用QHPBufferA 平衡 QHP 柱 1 2CV。样品准备用无热原注射用水调节上一步层析收集液的电导，使电导低于7ms/ cm。上样设定 FlowRate :30ml/min、Flowpath :A12、Columnposition :Position 2、 Alarmpressure :0· 5MPa、Autozero UV、Record on、输入文件名，将稀释液上样至 QHP 柱。上 样结束后，把进液管换入QHP BufferA中。QHP BufferA 平衡Flowpath :A11，用 QHP BufferA 平衡至 UV、pH 和 Cond 三线走平。QHP Buffer B梯度洗脱用QHP Buffer B开始梯度洗脱。pH洗脱梯度0 100% B，30CV。收集目标峰根据UV280nm检测峰形，收集Pl峰，当紫外吸收曲线快掉头向上时， 停止收集，随后出现P2峰。边收集边加入0.511101/1妝2朋04调节？!1值至7.0左右。QHP层 析图谱见图2，在O 100% B，30CV这种较缓的梯度条件下，峰1虽未下降到基线，但峰1 与峰2重叠较少，说明这种梯度条件还有改进的空间。再生用0朋高盐8吐€61~、0.511101/1恥0!1、注射用水、0朋Buffer A清洗残留在QHP 柱内的杂质。10、超滤浓缩将QHP收集液用Millipore公司PelliCOn-28k超滤器超滤浓缩至 600ml左右。IUSephacryl S-100分子筛层析上样、洗脱、收集，观察记录图谱，当上升至半峰 高时开始收集，当峰降至半峰略低时，结束收集，收集液即为重组人干扰素α Ib原液。实施例5 利用Streamlined Sepharose HP层析和pH梯度洗脱把重组人干扰素 α Ib与其相关蛋白质/异构体分离的高度纯化(生产规模)。步骤如下1、勻浆裂解菌体取出冻存的菌体5kg左右解冻，加入pH值为7.4的Tris-HCl 缓冲溶液IOOL左右，菌悬液浓度5g/ml左右，用搅拌机拌勻，搅拌速度850rpm。用压力为 50MPa的高压均质机勻浆两次。2、STREAMLINE DEAE 扩张床吸附层析(Expanded Bed Adsorption)层析柱STREAMLINE200，Φ 200mm X 100cm，凝胶STREAMLINE DEAE 4.5L，层析 系统扩张床吸附手动纯化系统，由两台WATS0N-MARL0W蠕动泵，紫外检测仪，记录仪，手动 阀门以及硅胶管道组成。平衡流速300cm/h, 10CV 的 50mM Tris-HCl 平衡液(pH7. 4)平衡 STREAMLINE 柱。上样100L菌体勻浆液，流速300cm/h上样。清洗用STREAMLINE平衡液，流速300cm/h清洗柱床，洗至紫外吸收接近基线。
洗脱用0. 4M NaCl，pH7. 4 的 50mM Tris_HCl，0 100% B 梯度洗脱，优选的是 0. 12 0. 15MNaCl，pH7. 4 的 50mM Tris-HCl 一步洗脱，收集洗脱峰。用 0. 5M NaOH-IM NaCl 再生液，注射用水，再生凝胶。3、QHP强阴离子交换层析INDEX 层析柱 Φ IOOmmX 50cm，柱床体积 2. 0L。层析系统GE Healthcare 公司(原 Amersham Pharmacia 公司)AKTA explorer 100。系统处理用Unicorn V4. 0软件预先编写的清洗程序(同实施例1)清洗系统，并 除系统和管道的热原。QHP柱处理把QHP柱接在柱位2，用Unicorn V4. 0预先编写的QHP柱清洗程序 (同实施例1)，用0. 5mol/LNa0H和注射用水清洗QHP柱，并除热原。平衡用QHP Buffer A 平衡 QHP 柱 1 2CV。稀释收集液用无热原注射用水调节上一步层析收集液的电导，使电导低于7ms/ cm左右。上样设定 FlowRate :70ml/min、Flowpath :A12、Columnposition :Position 2、 Alarmpressure 0. 5MPa、Autozero UV、Record on、输入文件名，将稀释后的扩张床吸附层 析洗脱收集液上样至QHP柱。上样结束后，把进液管换入QHP BufTerA中。QHP BufferA 平衡Flowpath :A11，用 QHP BufferA 平衡 6 8CV，至 UV、pH 和 Cond 三线走平，流速70ml/min。QHP Buffer B梯度洗脱用QHP Buffer B开始梯度洗脱。采用分步梯度，先0_20% B 5min，然后 20% -50% B，20CV。收集目标峰根据UV280nm检测峰形，收集Pl峰，当紫外吸收曲线快掉头向上时， 停止收集，随后出现P2峰。边收集边加入0.511101/1妝2朋04调节？!1值至7.0左右。QHP层 析图谱见图3，在分步0-20% B 5min,20% -50% B，20CV这种缓慢的梯度条件下，峰1基本 下降到基线，峰1与峰2重叠很少，这种缓慢的梯度条件更有利于把重组人干扰素α Ib与 其相关蛋白质分离开来。再生用QHP 高盐 Buffer、0. 5mol/LNa0H、H20、QHPBufferA 清洗残留在 QHP 柱内的 杂质，流速30ml/min。4、超滤浓缩将QHP收集液用Millipore公司PelliCOn-28k超滤器超滤浓缩至 600ml左右。5、Sephacryl S-100 分子筛层析层析柱 Φ 130mmX 70cm，柱床体积 12L。平衡用PBS平衡3个柱床体积。上样将QHP层析洗脱收集液上到分子筛柱内，上样流速15ml/min。洗脱用PBS洗脱样品，洗脱流速15ml/min，收集干扰素主峰，即为重组人干扰素 α Ib原液。再生用0. 5Μ的NaOH洗0. 5CV再生分子筛柱。用PBS洗3CV。实施例6 重组人干扰素α Ib的高度纯化(Streamline、Q Sepharose HP、 Superdex法)。本实施例以实施例3为基础，仅将实施例3中的第6步S印hacryl S-100 分子筛层析替换为Superdex 75分子筛层析，工艺条件XK16层析柱为Φ 16mmX 100cm,柱床体积200ml。其余步骤相同。实施例7 重组人干扰素α Ib的高度纯化(醋酸钠缓冲液)。本实施例以实施例2为基础，仅将其中的QHP BufferA替换为QHP BufferC、QHP BufferB替换为QHP BufferD即可，其余步骤相同。实施例8 反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测方法(采用phenomenex柱)。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；应用phenomenex C18柱， 4. 6mmX 250mm, CV = 4. 15ml,孑L 径 30nm，粒径 5 μ m。流动相 A 70 % H20+30 % ACN(乙 腈)+0.2% TFA(三氟乙酸)，0.45μπι滤膜抽滤，除去溶液中的杂质。流动相B :20% H20+80% ACN(乙腈)+0. 2% TFA(三氟乙酸)，0. 45 μ m滤膜抽滤，除去溶液中的杂质。流速 1. Oml/min，在室温条件下，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序设置见表3。 表3进样量40 100 μ 1 (等同于20 40 μ g)，于波长210nm处检测。按面积归一化 法计算重组人干扰素α Ib纯度。检测结果为单一主峰。图谱如图4所示。实施例9 反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测方法(采用Vydac柱)。色谱柱采 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；应用Vydac C18柱，4. 6mmX 250mm, CV = 4. 15ml，孔径 30nm，粒径 5μπι。流动相 A :70% H20+30% ACN(乙腈)+0· 1% TFA(三氟乙酸)，0145 μ m 滤 膜抽滤，除去溶液中的杂质；流动相B :20% H20+80% ACN(乙腈)+0. 1% TFA(三氟乙酸)， 0. 45 μ m滤膜抽滤，除去溶液中的杂质。流速1. Oml/min,在室温条件下，进行梯度洗脱，梯 度洗脱程序设置见表4。
1 表 4进样量40 100 μ 1 (等同于20 40 μ g)，检测波长210nm。按面积归一化法计 算重组人干扰素α Ib纯度。检测结果为单一主峰。图谱如图4所示。为了验证采用phenomenex柱或采用Vydac柱的反相高效液相色谱法(RP-HPLC) 检测方法检测结果的正确性，本申请人还采用了质谱法检测重组人IFNa Ib的精确分子 量，以此来确认结果的正确性。实施例10 质谱法检测重组人IFN α Ib的精确分子量通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱法(MALDI-T0F-MS)测定IFN α -Ib的 精确分子量，分子量的测定是在Applied Biosystems Voyager-DE质谱仪上进行的。辐照 具有芥子酸基质的试样板上的样品。用在337nm操作的氮激光器通过可变衰减器衰减激光 束并聚焦于试样靶。用25，000V偏转电压加速在离子源产生的离子。然后利用飞行时间质 谱分析器并依据其m/z鉴别这些离子。MALDI-T0F-MS检测大分子蛋白的分子量，精确度达 到万分之一。可通过质谱法检测蛋白的分子量，与理论分子量比较，确证是否为目标蛋白。 根据氨基酸分子量计算，重组人IFNa Ib在没有形成两对二硫键之前，理论分子量为19386 道尔顿，每两个半胱氨酸的巯基(SH)各脱去一个H，形成一对二硫键(-S-S-)，四个半胱氨 酸共脱去4个H，H的分子量为1，分子量共减去4，因此，形成两对二硫键的重组人IFN α Ib 的理论分子量为19382道尔顿。实际测得的分子量为19381道尔顿，如图5所示，与理论分 子量非常吻合，也证明本发明纯化所得的Pl为重组人IFNα lb。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的详细说明，不能认定本发明 的具体实施只局限于这些说明。对于所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思 的前提下，还可以做出若干推演或替换，都应视为属于本发明所提交的权利要求书确定的 专利保护范围。
权利要求
一种用Q Sepharose HP层析和pH梯度洗脱，把重组人干扰素α1b与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法，用于在经过细菌破碎、Streamline扩张床吸附和单克隆抗体亲和层析初步纯化处理的基础上，经过高分辨的QHP强阴离子交换层析，利用缓慢的pH梯度洗脱，除去重组人干扰素α1b的相关蛋白质、异构体，获得高纯度的重组人干扰素α1b，包括如下步骤A.匀浆裂解菌体菌体加入pH值为7.4的Tris HCl缓冲溶液，菌悬液浓度5g/ml左右，用压力为50MPa的高压均质机匀浆两次；B.STREAMLINE DEAE扩张床吸附层析平衡用pH7.4的50mM Tris HCl平衡液平衡STREAMLINE柱；上样将匀浆液进行上样；清洗用pH7.4的50mM Tris HCl平衡液，洗至紫外吸收接近基线；洗脱用0.4M的NaCl和pH7.4的50mM Tris HCl洗脱液，0 100％B梯度洗脱，收集洗脱峰；再生用0.5M NaOH 1M NaCl再生液、注射用水，清洗STREAMLINE DEAE凝胶；C.单克隆抗体亲和层析单抗胶为MCAb Sepharose F.F.；平衡用PBS平衡单抗柱；上样将扩张床吸附层析洗脱收集液上样至单抗柱；清洗用PBS清洗柱内未吸附的杂质；洗脱用pH2.5的0.1mol/L甘氨酸 盐酸Gly HCl洗脱液将吸附在柱上的干扰素洗脱下来，收集洗脱峰；再生用Tris HCl，0.5mol/L NaCl 0.1mol/L CH3COONa清洗残留的柱内杂质，用PBS平衡单抗柱；D.Q Sepharose HP层析，利用缓慢的pH梯度洗脱目标蛋白；平衡用pH5.5的0.04mol/L CH3COONH4 CH3COOH缓冲液平衡QHP柱；上样用无热原水稀释样品，使电导低于7ms/cm；用pH5.5的0.04mol/L CH3COONH4 CH3COOH缓冲液平衡至UV、pH和Cond三线走平；用pH4.0的0.04mol/L CH3COONH4 CH3COOH缓冲液梯度洗脱，洗脱梯度为0～100％B，25～30CV，利用缓慢的pH梯度把相关蛋白质、异构体分离开来；收集目标峰根据UV2g0nm检测峰形，收集洗脱峰；边收集边加入0.5mol/LNa2HPO4调节pH值至7.0；再生依次用pH6.0的0.02mol/L CH3COONH4+2mol/L NaCl、0.5mol/L NaOH、注射用水、pH5.5的0.04mol/L CH3COONH4 CH3COOH缓冲液清洗残留在QHP柱内的杂质；E.超滤浓缩；F.Sephacryl S 100分子筛层析平衡用PBS平衡；上样将超滤浓缩液上到分子筛柱内；洗脱用PBS洗脱样品，除去干扰素聚体，收集干扰素主峰，即为IFNα1b原液。
2.根据权利要求1所述的用QSepharose HP层析和pH梯度洗脱，把重组人干 扰素α Ib与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法，其特征在于所述步骤B的STREAMLINEDEAE扩张床吸附层析中的洗脱是用0. 12 0. 15M NaCl、pH7. 4的50mM Tris-HCl进行一步法洗脱，收集洗脱峰。
3.根据权利要求1所述的用QSepharose HP层析和pH梯度洗脱，把重组人干扰素 α Ib与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法，其特征在于所述步骤D中用pH4. O的 0. 04mo 1 /LCH3C00NH4-CH3C00H缓冲液梯度洗脱是分步pH梯度程序，即先0_20% B 5min,后 20% -50% B，20CV 进行洗脱。
4.一种用Q Sepharose HP层析和pH梯度洗脱，把重组人干扰素α Ib与其相关蛋白 质、异构体分离纯化的工艺方法，用于在经过细菌破碎、酸化、硫酸铵盐析、CM弱阳离子交换 层析、单克隆抗体亲和层析初步纯化处理的基础上，经过高分辨的QHP强阴离子交换层析， 利用缓慢的PH梯度洗脱，除去重组人干扰素α Ib的相关蛋白质、异构体，获得高纯度的重 组人干扰素α lb，包括如下步骤A.勻菜裂解菌体菌体加入50mmol/LTris-HCl、5mmol/L EDTA的Tris-EDTA溶液溶 解，菌悬液浓度10g/ml，用压力为50MPa的高压勻浆机勻浆两次；高速连续流离心机，转速 14，OOOrpm离心处理，收集上清液；B.盐酸酸化在勻浆上清液中逐步加入3!1101/1^(14!1值调至2.3，静置2小时。用连 续流离心机离心处理，离心机转速14，OOOrpm，离心处理后收集上清液；C.碱中和用3mol/LNaOH中和pH值至7.2 ；D.35%硫酸铵盐析依据上清液体积计算35%硫酸铵饱和度所需量，搅拌至硫酸铵溶 解，静置2小时后离心处理，离心机转速14，OOOrpm，收集上清液；E.90%硫酸铵盐析根据上清液体积计算90%饱和度所需硫酸铵量，搅拌机至硫酸铵 溶解，放置过夜后离心处理，离心机转速14，OOOrpm ；收集沉淀物，用5LCH3C00Na-CH3C00H缓 冲液溶解沉淀物；F.离心处理用高速冷冻离心机，转速4，OOOrpm,离心处理7min，收集上清液；G.Sephadex G-25脱盐柱平衡，把上清液上到G-25柱，收集目标峰；H.CM Sephrose F. F弱阳离子交换层析上样，用pH4. 4的0. 005mol/ LCH3COONa-CH3COOH 缓冲液平衡 2CV，用 0. 2mol/L CH3COONa-CH3COOH 缓冲液洗脱、收集目标 峰；I.单克隆抗体亲和层析上样、清洗用PBS清洗IOCV ；洗脱用pH2. 5的0. lmol/L甘氨酸-盐酸Gly-HCl洗脱，出峰时收集，峰至基线附近结 束收集，用3mol/LNaOH调整pH至7. 0 ；J.Q Sepharose HP层析，利用缓慢的pH梯度洗脱目标蛋白；用ρΗ4· 0的0. 04mol/L CH3C00NH4-CH3C00H缓冲液梯度洗脱；洗脱梯度0 100% B， 25 30CV，利用缓慢的pH梯度把相关蛋白质、异构体分离开来；L.超滤浓缩；M. Sephacryl S-100分子筛层析上样、洗脱、收集，收集液即为重组人干扰素α Ib原液。
5.根据权利要求4所述的用QSepharose HP层析和pH梯度洗脱，把重组人干扰素 α Ib与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法，其特征在于所述步骤J中的梯度洗脱是分步梯度洗脱，即先0-20% B 5min，后20% -50% B，20CV进行洗脱程序。
6.根据权利要求4所述的用QSepharose HP层析和pH梯度洗脱，把重组人干扰素 α Ib与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法，其特征在于所述CH3C00NH4-CH3C00H 缓冲液可以替换为CH3COONa-CH3COOH缓冲液。
7.根据权利要求4所述的用QSepharose HP层析和pH梯度洗脱，把重组人干扰素 α Ib与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法，其特征在于所述步骤M中的分子筛层 析柱是 Superdex75。
8.一种用于根据权利要求1或4分离纯化工艺方法生产出来的高纯度重组人干扰素 α Ib的反相高效液相色谱检测方法，其特征在于色谱柱采用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；应用phenomenex C18柱， 4. 6mm X 250mm，CV = 4. 15ml，孔径 30nm,粒径 5 μ m ；流动相A 70% H20+30%乙腈ACN+0. 2%三氟乙酸TFA ；流动相B :20% H20+80%乙腈ACN+0. 2%三氟乙酸TFA ；流速1. Oml/min,进行梯度洗脱；进样量40-100 μ 1，即20-40 μ g，于波长2IOnm处检 测，按面积归一化法计算重组人干扰素α Ib的纯度；洗脱梯度程序如下时间(miη)流动相B% (V/V)0-1281-528-335-2033-3720-3037-4330-4843-6048-506050-50. 160-2850.1-6028
9. 一种用于根据权利要求1或4分离纯化工艺方法生产出来的高纯度重组人干扰素 α Ib的反相高效液相色谱检测方法，其特征在于色谱柱采用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；应用phenomenex C18柱， 4. 6mm X 250mm，CV = 4. 15ml，孔径 30nm,粒径 5 μ m ；流动相A :70% H20+30%乙腈ACN+0. 三氟乙酸TFA ； 流动相B :20% H20+80%乙腈ACN+0. 三氟乙酸TFA ；流速1. Oml/min,进行梯度洗脱；进样量40-100 μ 1，即20-40 μ g，于波长2IOnm处检 测，按面积归一化法计算重组人干扰素α Ib的纯度；洗脱梯度程序如下
全文摘要
一种用QHP层析和pH梯度洗脱把重组人干扰素α1b与其相关蛋白质、异构体分离纯化的工艺方法及原液检定方法。在经过细菌破碎、目标蛋白捕获、离子交换层析和单克隆抗体亲和层析初步纯化干扰素α1b基础上，进一步经过高分辨的QHP强阴离子交换层析，利用缓慢的pH梯度洗脱，除去重组人干扰素α1b的相关蛋白质、异构体，获得高纯度的重组人干扰素α1b。参照《欧洲药典》的“重组人干扰素α2检定规程”的反相高效液相色谱法来检定经所述方法纯化所得到的重组人干扰素α1b呈一个主峰。本发明分离纯化方法有益效果在于，可以提高重组人干扰素α1b质量，并且在使用单克隆抗体亲和层析的纯化工艺中，可以除去鼠IgG。
文档编号C07K1/16GK101928341SQ201010215778
公开日2010年12月29日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者何毅华, 何社辉, 何询, 陈克尧 申请人:深圳科兴生物工程有限公司