专利名称：簇毛麦6vl染色体上抗秆锈病基因连锁标记、引物对及用法的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物信息学和植物遗传育种科学技术领域，具体涉及簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记引物对及其用法。
背景技术：
小麦(Triticum aestivum L.)是全球三大粮食作物之一 ,也是我国总产第一的粮食作物，是保障我国粮食安全的重要决定因素之一。小麦在其生育进程中常会受到生物或非生物胁迫的影响。小麦杆镑病(Puccinia graminis f. sp. tritici Eriks. &E. Henn.)是一种世界性小麦病害，起源于乌干达的Ug99是一种致毒性极高，在全球范围内抗源极少的杆锈病生理小种。Ug99及其衍生物已克服了全球小麦生产中广泛利用的几个抗杆锈病基因的抗性，导致世界范围内绝大部分小麦品种对杆锈病缺乏抗性。已有研究表明，小麦二倍体近缘野生种簇毛麦(Dasypyrum vi I losum (L.)Candarge)的大部分种质对杆锈病生理小种Ug99表现较高的抗性,其抗杆锈病基因被定位于簇毛麦6VL上。美国堪萨斯州立大学通过远缘杂交和染色体工程手段获得了中抗杆锈病生理小种Ug99的小麦-簇毛麦易位系T6AS. 6VL(见参考文献Qi LL, Pumphrey MO, FriebeB, Zhang P, Qian C, Bowden RL, Rouse MN, Jin Y, Gill BS. A novel Robertsoniantrans location event leads to transfer of a stem rust resistance gene (Sr52)effective against race Ug99 from Dasypyrum villosum into bread wheat. Theor ApplGenet, 2011，123:159-167)。T6AS. 6VL易位系是在普通小麦遗传背景中由簇毛麦6V染色体长臂(6VL)替换了普通小麦6A染色体的长臂(6AL)，从而形成6AS. 6VL易位染色体。由于簇毛麦与普通小麦亲缘关系较远，在杂种后代中6VL和6AL间不发生染色体重组，T6AS. 6VL易位染色体始终以易位的形式出现在后代中，因此，由簇毛麦6VL控制的抗杆锈病性状及其载有的全部DNA序列均以协同传递的方式出现在后代中。现有技术中追踪抗病染色体的细胞学方法主要包括染色体分带(C-banding)和基因组原位杂交(GISH)，但这些技术成本高、效率低，特别是在小麦育种实践中对大群体进行辅助选择工作量巨大。ESTCexpres sed sequence tag,表达序列标签)是指从植物不同组织来源的cDNA文库中随机挑选克隆，对其5’和3’端进行测序获得的短cDNA序列。基于EST的STS标记(sequence-tagged site, STS),即EST-STS标记，是直接依据已定位于基因组物理图上的EST序列设计引物，对基因组进行扩增，从中寻找与目的基因连锁或具有染色体特异性的EST标记。由于EST-STS标记直接来源于表达基因序列，保守性较高，特别有利于界定物种之间的差异(见参考文献La Rota M, Sorrells ME. 2004. Comparative DNA sequenceanalysis of mapped wheat ESTs reveals the complexity of genome relationshipsbetween wheat and rice. Funct Integr Genomics, 4:34-46)。因此，基于比较基因组学原理，利用普通小麦EST图谱，可以开发与普通小麦部分同源的簇毛麦特定染色体的特异性分子标记。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记及所用引物对，为小麦-簇毛麦T6AS. 6VL易位系在小麦抗杆锈病育种中的应用提供一种新型、实用的标记辅助选择方法。本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记引物对，是根据普通小麦bin-Map图谱第6部分同源群长臂的EST序列BE471191为模板设计得到的，所述弓I物对中的一条弓I物的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. I所示，所述引物对中的另一条引物的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列 SEQ ID NO. 2 所示。 本发明还提供一种簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记，是采用引物对SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2自簇毛麦DNA中扩增出来的一段358bp的核苷酸序列，所述358bp DNA片段的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. 3所示；所述引物对从簇毛麦DNA中扩增出来的358bp DNA片段位于簇毛麦6VL染色体FLO. 64-1. 00的区段内(图
2)可特异地追踪簇毛麦6VL染色体及其携带的抗小麦杆锈病基因。所述引物对从普通小麦DNA中扩增出的230bp DNA条带位于6AL染色体上，可特异地追踪6AL染色体。本发明还提供一种簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记引物对的用法，采用上述的引物对对以小麦-簇毛麦T6AS. 6VL抗杆锈病易位系为亲本的分离群体进行PCR扩增及其产物检测，若所述扩增产物出现6VL特异的358bp条带而不出现6AL特异的230bp条带，则所述待测植物为含有I对T6AS. 6VL易位染色体的抗杆锈病纯合体；若所述扩增产物同时出现358bp和230bp条带，则所述待测植物为含有单个T6AS. 6VL易位染色体的抗杆锈病杂合体；若所述PCR扩增产物中仅扩增出230bp条带，则所述待测植物不含T6AS. 6VL易位染色体，相应丧失对杆锈病的抗性。所述PCR扩增的反应体系10uL (微升)反应体系中含约10 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmo IL-1MgCl2JOOmmol ΓΜΝΤΡ，左右引物终浓度各为O. 2umol Λθ·5υTaq DNA聚合酶；所述PCR扩增的反应程序94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，32个循环；72°C延伸10分钟；所述PCR扩增的产物检测PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。本发明的有益效果是本发明标记6VL-358在鉴定簇毛麦6V染色体长臂时特异性强，拓宽了小麦EST的使用范围。根据普通小麦已定位的EST序列开发的EST-STS标记，由于标记序列来自表达基因，在物种内部具有很高的保守性，在物种间也有较高的同源性，特别有利于鉴别物种间DNA序列的微小差异，本发明标记6VL-358即可显著区分普通小麦与簇毛麦间的DNA差异，无论杂交组合涉及何种亲本，只要后代中出现358bp条带，就可以确定材料中具有簇毛麦6VL染色体。本发明标记6VL-358与6VL上抗小麦杆锈病基因完全连锁，因此利用本发明标记引物对追踪以T6AS. 6VL易位系为亲本的抗小麦杆锈病性状时，凡是能扩增出358bp条带的材料，都对杆锈病表现抗病；凡是不能扩增出358bp条带的材料，则丢失由6VL染色体控制的杆锈病抗性。本发明的标记为共显性标记，可同时扩增簇毛麦6VL特异的358bp条带和小麦6AL特异的230bp条带，对于在育种早代(如F2代)筛选出纯合抗杆锈病基因型特别有效凡是扩增出358bp条带而不具230bp条带的单株即为抗杆锈病纯合单株，它具有一对纯合的T6AS. 6VL易位染色体。本发明的标记引物对对PCR条件的要求较为宽泛，容易为育种实践利用标记引物与模板的结合能力强，具有较宽泛的退火温度，其最佳设计退火温度为60°C，但在52 62°C的较大范围内均有较好的扩增效果。同时，由于目标条带较短，只有358bp，在PCR反应时，在同等时间内可运行较多的循环数，有利于提高标记辅助选择的效率。本发明标记的辅助选择方法与染色体分带(C-banding) 、基因组原位杂交(GISH)等细胞学筛选方法相比，本发明成本低、效率高，容易在小麦育种实践中实现在大群体中进行标记辅助选择。
图I为以不同待测植物DNA模板为底物用本发明中的6VL-358标记引物进行扩增得到的产物电泳结果图。其中M =MarkerU :普通小麦中国春(AABBDD)、2 簇毛麦(VV)、3 :硬簇麦(AABBVV),4 :普通小麦-簇毛麦6V (6A)代换系、5 :普通小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位系、6 6VL缺失系(DSdel6VL，断裂位点FL. 64),7 13 :普通小麦分别添加I对簇毛麦1V、2V、3V、4V、5V、6V、7V染色体的添加系DNA模板。图2为本发明6VL-358标记在簇毛麦6V染色体上的物理定位模式图。图3为本发明所扩增得到的簇毛麦6VL染色体上与抗小麦杆锈病基因连锁的DNA片段，图中下划线分别表示正反引物序列。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用到的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例I1、EST序列的获得根据美国农部网站http://wheat. pw. usda. gov的信息,搜索定位于普通小麦第6部分同源群长臂的EST序列。2、引物的设计与合成将步骤I搜索的EST序列,利用Primer Premier5. O软件进行引物的设计，引物由上海联合基因有限公司合成。3、簇毛麦6VL染色体特异性标记的筛选I)种质材料普通小麦中国春(AABBDD)、簇毛麦(Dasypyrum villosum, W)、硬簇麦(T. durum-H. villosa amphiploid, AABBVV)、小麦-簇毛麦6V(6A)二体代换系DS6V(6A)、小麦-簇毛麦易位系T6VS. 6AL、6VL缺失系DSdel6VS (断裂位点FL0. 64)、小麦-簇毛麦IV 二体添加系(DA1V)、小麦-簇毛麦2V 二体添加系(DA2V)、小麦-簇毛麦3V 二体添加系(DA3V)、小麦-簇毛麦4V 二体添加系(DA4V)、小麦簇毛麦5V 二体添加系(DA5V)、小麦-簇毛麦6V 二体添加系(DA6V)、小麦-簇毛麦7V 二体添加系(DA7V)。上述种质材料均为公知公用种质材料，由南京农业大学提供。2)利用步骤2设计合成的EST-STS引物，对上述种质材料DNA进行多态性扩增分析。PCR试剂组成10uL反应体系中含约10 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmolL-1MgCl2^OOmmol Γ1 dNTP，左右引物终浓度各为 O. 2umol L_1,0. 5U Taq DNA 聚合酶。PCR程序为94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，32个循环；72°C延伸10分钟；4°C保存。PCR产物检测PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。3)筛选出的6VL特异性分子标记6VL-358对簇毛麦 6VL染色体表现特异性，具体如图I各条带所示簇毛麦、硬簇麦、DS6V(6A)、DA6V等具有完整6VL染色体的材料均能扩增出358bp的条带，其它不具完整6VL染色体的材料均没有该条带，说明标记6VL-358确为簇毛麦6VL染色体特异性标记。由于该标记在6VL缺失系DSdel6VL (断裂位点FL. 64)中缺失，进而将6VL-358定位到簇毛麦6VLFL. 64的远侧端区域，如图2所示。实施例2簇毛麦6VL染色体特异性标记在标记辅助选择育种中的应用待测材料为中国春(公知公用)与抗杆锈病T6AS. 6VL易位系(公知公用)杂交组合的分尚群体。用实施例I中所述的引物对对上述待测材料DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增的反应体系10uL反应体系中含约10 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmoI T1MgC 12,200mmol Γ1 dNTP，左右引物终浓度各为 O. 2 μ mo I Λθ·5υ Taq DNA 聚合酶;PCR扩增的反应程序94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，32个循环；72°C延伸10分钟。PCR扩增的产物检测PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。对组合“中国春/T6AS. 6VL易位系”的F2群体111个单株的的分子标记检测显示，22株含有I对纯合T6AS. 6VL易位染色体的单株都能扩增出358bp条带但不具有230bp条带，表现为6VL-358标记阳性，为小麦杆锈病抗病纯合体；43株仅含有I条T6AS. 6VL易位的单株可同时扩增出358bp和230bp条带，为抗病杂合体；46株不含T6AS. 6VL易位的单株不能扩增出358bp条带，表现为6VL-358标记阴性，对小麦杆锈病表现感病。
权利要求
1.一种簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记的引物对，其特征在于，所述引物对中的一条引物的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. I所示，所述引物对中的另一条引物的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. 2所示。
2.一种簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记，其特征在于，是采用引物对SEQID NO. I和SEQ ID NO. 2自簇毛麦DNA中扩增出来的一段358bp的核苷酸序列，所述358bpDNA片段的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO. 3所示。
3.根据权利要求2所述一种簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记，其特征在于，所述引物对扩增出的标记为共显性标记，既可扩增出簇毛麦6VL染色体特异的的358bp条带，也可扩增出普通小麦6AL染色体特异的230bp条带，用于区分抗病单株为纯合还是杂八口 ο
4.一种簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记引物对的用法，其特征在于，采用权力要求I至3任一项所述的引物对对以小麦-簇毛麦T6AS. 6VL抗杆锈病易位系为亲本的分离群体进行PCR扩增及其产物检测，若所述扩增产物出现6VL特异的358bp条带而不出现6AL特异的230bp条带，则所述待测植物为含有I对T6AS. 6VL易位染色体的抗杆锈病纯合体；若所述扩增产物同时出现358bp和230bp条带，则所述待测植物为含有单个T6AS. 6VL易位染色体的抗杆锈病杂合体；若所述PCR扩增产物中仅扩增出230bp条带，则所述待测植物不含T6AS. 6VL易位染色体，相应丧失对杆锈病的抗性。
5.根据权利要求4所述的簇毛麦6VL染色体上抗杆锈病基因连锁标记的用法，其特征在于 所述PCR扩增的反应体系IOuL反应体系中含约10 20ng模板DNA，IXPCR buffer,I.5mmol L-1MgCl2JQQmmol ΓΜΝΤΡ，左右引物终浓度各为 O. 2umol L_1,0. 5U Taq DNA 聚合酶； 所述PCR扩增的反应程序94 V预变性3分钟；94 V变性30秒，60 V退火30秒，72 °C延伸45秒，32个循环；72°C延伸10分钟； 所述PCR扩增的产物检测PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。
全文摘要
本发明公开了簇毛麦6V染色体长臂(6VL)特异性标记6VL-358的引物对序列及其用法，可用于小麦遗传背景中6VL染色体的追踪及其控制的抗小麦秆锈病性状的标记辅助选择。所述引物对中的一条引物的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.1所示，所述引物对中的另一条引物的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO.2所示。利用所述引物对对小麦-簇毛麦T6AS.6VL抗秆锈病易位系为亲本的分离群体进行PCR检测时，若扩增产物中含有358bp条带，则所述待测植物对秆锈病表现抗病；若扩增产物中不含358bp条带，则所述待测植物丧失由6VL染色体控制的秆锈病抗性。本发明标记为共显性标记，特别有利于在育种早代筛选出抗秆锈病纯合体。
文档编号C12Q1/68GK102816760SQ20121026831
公开日2012年12月12日 申请日期2012年7月30日 优先权日2012年7月30日
发明者别同德, 王春梅, 张勇, 张晓祥, 高德荣, 李海凤, 吕国锋 申请人:江苏里下河地区农业科学研究所