专利名称：食品及饮料中芒果源性成分快速筛查试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于食品及饮料中植物源性成分芒果DNA检测技术，具体地说是使用实时荧光PCR反应技术对食品及饮料中芒果进行快速筛选与检测的方法，方法包括DNA的提取、实时荧光PCR扩增和结果判定。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、重复性好。
背景技术：
芒果mango,学名Mangifera indica Linn.,别名檬果、潘果、闷果、蜜望、望果、面果和庵波罗果，属漆树科(Anacardiaceae)芒果属。芒果不仅果肉丰厚甜美，而且有助于美容养颜和减肥，有“热带果王”之誉称。全世界约有1000多个芒果品种，而且芒果经常被加工成芒果汁、食品、雪糕、酸奶、糖等。芒果肉质香甜可ロ是深受人们喜爱的热带水果。芒果虽然味美营养丰富，但因其性湿热，多食不但无益反而有害，尤其是有些人对芒果会有敏感症状，因此芒果也是常见的水果过敏原之一。近年来因芒果过敏的患者越来越多，出现ロ 疮，水果疹，口腔麻痒，严重的会出现哮喘和过敏性休克等症状。芒果食品加工品在进行加エ处理后中，往往失去芒果可鉴别的形态特征，为芒果食品鉴别带来不便。随着芒果制品及饮料不断扩大，不法制造商为节约成本，采用食品添加原料以次充好，冒充纯天然果汁制造水果加工品，扰乱加工市场。为了保护公众权益，建立可靠的芒果的检测方法迫在眉睫。食品中是否混有芒果源性成分，尚没有ー个快速的判定方法。大部分消费者需求判断含有芒果源性成分的方法，少数消费者由于对芒果过敏需求不含芒果成分的食品加工品。消费者的生活质量需要过硬的检测方法和依据来保证。
发明内容
本发明的目的是针对芒果ITS2基因设计ー组特异性引物，建立ー种在食品及饮料中快速筛选和检测芒果源性成分实时荧光PCR检测方法，以克服基于外部形态检测方法在食品加工产品检测中的局限性，为食品及饮料中芒果产品检测提供快速检测的方法。本发明的主要原理为设计ー组可以特异地识别芒果序列的引物对和探针，完善实验体系和反应条件，通过实时荧光PCR反应使靶DNA快速累积到IO9 101°拷贝，经过荧光扩增曲线、Ct值判别扩增結果。本发明中建立的成熟的实验方法可保证在食品、饮料等加工制品中检出芒果源性成分。该方法省略了琼脂糖电泳等过程，可以直接用荧光PCR观察扩增曲线进行判读，简单而快速特别适用于ー些检测ー线的单位。快速检测芒果源性成分的试剂盒包括PCR扩增反应液、阳性对照DNA两种特征性部分；反应体系总体积为25 μ L，其中含样品DNA(10yg/mL-100yg/mL)2yL，芒果引物对(10ymol/L)各 O. 5 μ L，芒果探针(10ymol/L) I μ L，Taq DNA聚合酶(5U/ μ L) 0. 5 μ 1，dNTP (10 μ mol/L) 2 μ L，10 X PCR缓冲液2. 5 μ L,水补足至总体积25 μし也可采用商品化的实时荧光PCR扩增体系，反应预混液Real time Mix 10 μ L、10 Ii mol/L上游引物0. 5 u L>10 u mol/L下游引物0. 5 u L>10 u mol/L探针I u L和模板成分2 U I,加ddH20 (灭菌双蒸水)补足至25 ii I。本发明涉及的实时荧光PCR扩增检测用的引物和探针，其序列如下(I)上游引物5’ -TCTGAGTTCTCGGTGACGCTTTC-3 ；(2)下游引物5’ -CCGGTCTCTAGGGTCGAAGAGC-3’ ；(3)探针序列5’ -FAM-ATCCTGTCGTGCGGTTGCGITCTCC-TAMRA-3’。在实际应用中，上游引物、下游引物和探针的体积比为1 : I : 2。阳性对照DNA为含有芒果源性成分的DNA提取液。 实时荧光PCR检测食品加工产品中芒果成分的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)(I)待检样品DNA的提取A.称取0. Ig样品，转至I. 5mL离心管中。加入600 U L预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65°C水浴保温IOmin ；B.在管中加入等体积酚/氯仿600 u L，上下颠倒充分混匀，抽提2min ；C. 12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置IOmin后，12000g离心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60 ii L RNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L缓冲液,上下颠倒混匀10次；E.取出离心柱，将离心柱放置在I个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min ；F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加A 200 u L洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；G.在离心柱中加入200ii L70%こ醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤ー次；H. 12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；I.将离心柱放置在一个新的I. 5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50 ii L洗脱缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。(2) PCR 扩增A.在扩增反应管中加入 Real time Mix 10 ii L、10 ii mol/L 上游引物 0. 5 ii L、10 V- mol/L下游引物0. 5 ii L、10 ii mol/L探针I ii L、ddH20(灭菌双蒸水)补足至25 ii I,混匀；B.在扩增反应管中加入待检样品DNA2 ii L (约200ng)，混匀；C.在荧光PCR仪中进行PCR反应40-45个循环，程序为预变性95°C 3min，40-45 个循环95°C 15s，60°C 30s。(3)结果检测实时荧光PCR反应结束后，仪器自动分析数据，得出Ct值和扩增曲线。总体看曲线拐点清楚，指数其明显，扩增曲线整体平行性好，基线无上扬现象，方由Ct值判断結果。根据荧光信号的Ct值进行判断，当待测样品的基因检测Ct值大于或等于45，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中未检出芒果基因，样品中不含有芒果源性成分。
当待测样品的结构特异性基因检测Ct值小于或等于36，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中检出芒果基因，样品中含有芒果源性成分。当待检测样品结构特异性基因检测Ct值大于36小于45，应重做实时荧光PCR检测，若重做后Ct值仍小于45，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中检出芒果基因；若重做后Ct值大于45，且阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中未检出芒果基因。
图I多个品种芒果的ITS2基因片段实时荧光PCR图谱。图2不同稀释度台芒DNA溶液的实时荧光PCR扩增图及2种未知浓度芒果果汁饮料扩增图。·
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进ー步说明。实施例I按照以下程序进行检測(I)待测可能含芒果成分样品DNA的提取A.称取O. Ig样品，转至I. 5mL离心管中。加入600 μ L预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65°C水浴保温IOmin ；B.在管中加入等体积酚/氯仿600 μ L，上下颠倒充分混匀，抽提2min ；C. 12000g离心5min,吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置IOmin后，12000g离心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60yL RNA酶，37°C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 μ L缓冲液,上下颠倒混匀10次；Ε.取出离心柱，将离心柱放置在I个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min ；F.将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加Λ 200 μ L洗液，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；G.在离心柱中加入200μ L70%こ醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤ー次；H. 12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液；I.将离心柱放置在一个新的I. 5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50 μ L洗脱缓冲液，37°C放置2min后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。(2)待测含芒果成分饮料PCR扩增A.在扩增反应管中加入荧光PCR反应预混液Real time Mix 10 μ L、10 μ mol/L上游引物O. 5 μ L、10 μ mol/L下游引物O. 5 μ L、10 μ mol/L探针I μ L、ddH20(灭菌双蒸水)补足至25 μ 1，混匀；B.在扩增反应管中加入待检样品DNA 2 μ L (约200ng)，混匀；C.在ABI 7900荧光PCR仪中进行PCR反应，程序为
95°C 3min，45 个循环95で 15s,60°C 30s。(3)结果检测实时荧光PCR反应结束后，仪器自动分析数据，得出Ct值和扩增曲线。总体看曲线拐点清楚，指数其明显，扩增曲线整体平行性好，基线无上扬现象，由Ct值判断結果。 根据荧光信号的Ct值进行判断，待测样品的基因检测Ct值位于20-36之间，阳性对照和空白对照结果正常，判断为样品中检出芒果基因。
权利要求
1.快速检测芒果源性成分的试剂盒包括Pc R扩增反应液、阳性对照D N A两种特征性部分 P C R扩增反应液总体积为25iiL，其中含样品DNA(10iig/mL-100iig/mL)2iiL，芒果引物对(10iimol/L)liiL，芒果探针(10umol/L)luL, Taq DNA 聚合酶(5U/u L) 0. 5 U I,dNTP(10umol/L)2u L, 10 XPCR缓冲液2. 5 y L，水补足至总体积25 yし也可采用商品化的实时荧光PCR扩增体系，反应预混液Real time Mix 10 y L、10 y mol/L上游引物0. 5 y L、10 u mol/L下游引物0. 5 u L>10 u mol/L探针I ii L和模板成分2 ii I,加ddH20(灭菌双蒸水)补足至25u I0 本发明涉及的实时荧光PCR扩增检测用的引物和探针，其序列如下 (1)上游引物5’-TCTGAGTTCTCGGTGACGCTTTC-3 ；· (2)下游引物5’-CCGGTCTCTAGGGTCGAAGAGC-3’ ； (3)探针序列5’-FAM-ATCCTGTCGTGCGGTTGCGITCTCC-TAMRA-3’。
在实际应用中，上游引物、下游引物和探针的体积比为1 : I : 2。
阳性对照DNA为含有芒果源性成分的DNA提取液。
2.芒果源性成分快速检测方法包括食品DN A的提取、实时荧光P C R扩增和结果判定。
食品DNA提取 采用酚-氯仿DNA提取方法或等同采用相同方法的DNA提取试剂盒。
PCR扩增 在荧光PCR仪中进行PCR反应40-45个循环，程序为 预变性 950C 3min, 40-45 个循环95°C 15s，60。。30s。
结果判定 实时荧光PCR反应结束后，仪器自动分析数据，得出Ct值和扩增曲线。总体看曲线拐点清楚，指数其明显，扩增曲线整体平行性好，基线无上扬现象，方由Ct值判断結果。
当待测样品的基因检测Ct值大于或等于45，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中未检出芒果基因，样品中不含有芒果源性成分。
当待测样品的结构特异性基因检测Ct值小于或等于36，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中检出芒果基因，样品中含有芒果源性成分。
当待检测样品结构特异性基因检测Ct值大于36小于45，应重做实时荧光PCR检测，若重做后Ct值仍小于45，阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中检出芒果基因；若重做后Ct值大于45，且阳性对照和空白对照结果正常，则可判断为样品中未检出芒果基因。
全文摘要
本发明属于食品及饮料中芒果源性成分的快速筛查试剂盒与检测技术，具体是使用实时荧光PCR技术检测芒果的ITS2基因基因片段。本发明针对芒果源性成分采用实时荧光PCR技术，快速、灵敏、特异地检测内含基因，从而筛选食品及饮料中是否含芒果源性成分。该快速筛查试剂盒及检测技术用于检测混合样品中可能含有过敏原芒果成分，也可以用于检测样品中是否不含有芒果成分。该方法快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、重复性好。
文档编号C12Q1/68GK102839212SQ20121026857
公开日2012年12月26日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者刘彩霞, 高宏伟, 孙敏, 龚方, 徐彪, 梁成珠 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心