专利名称：利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法
技术领域：
本发明涉及细胞分选方法，具体涉及利用F0XP3为标记物分选Treg细胞的方法。
背景技术：
调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)是T细胞的一个亚群,能抑制对自身或外源抗原有害的的免疫反应。Treg细胞表达⑶4，⑶25和转录因子F0XP3(forkhead box P3，Scurf in)。其中F0XP3主要表达于胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴器官和组织，在小鼠中特异性表达于⑶4+⑶25+T细胞，而不表达于⑶8+T细胞。在人类F0XP3不仅可表达于⑶4+⑶25+T细胞，还可表达于⑶8+⑶28-T细胞，但在⑶4+T细胞中的表达明显高于⑶8+T细胞。
目前，F0XP3是目前公认的调节性T细胞的最敏感的标志。但是F0XP3定为于细胞内，对Treg细胞进行F0XP3染色，必须要经过细胞固定和通透，对细胞会有一定损坏，所以在现有技术中进行Treg细胞的流式细胞术分选时，通常会选取CD4和CD25这作为标记物进行标记，而不会选取F0XP3为标记物。为了提高分选Treg细胞的灵敏度，急需一种流式细胞术分选Treg细胞的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供利用F0XP3为标记物分选Treg细胞的方法，其灵敏度高，分选的Treg细胞亚群纯度高。为实现上述发明目的，技术方案为
利用F0XP3为标记物分选Treg细胞的方法，具体步骤为
A.收集外周血单核细胞，用PBS液重悬，然后加入细胞表面标记物⑶4抗体和⑶25抗体，在温度为10-28°C条件下孵育；然后用PBS洗涤，离心收集细胞，得洗涤细胞；
B.将步骤A所得洗涤细胞中加入F0XP3固定破膜剂洗涤，然后用F0XP3固定破膜剂重悬细胞，避光孵育，离心收集沉淀；然后用F0XP3固定破膜剂重悬细胞；然后加入荧光标记的F0XP3抗体，室温避光反应，得F0XP3抗体标记的细胞；
C.将步骤B所得F0XP3抗体标记的细胞加入细胞染色液重悬细胞，上流式细胞仪进行分选。优选的，所述步骤a是将收集的外周血单核细胞在4 V预冷的PBS液重悬至浓度为
IX IO5 I X IO7个/100 μ L，加入CD4抗体和CD25抗体至终浓度分别为O. 125-0. 25 μ g/106细胞，在温度为10-28°C条件下孵育20-40分钟，然后用PBS洗涤细胞三次，洗涤后在转速大于1000转/分钟条件下，离心至少5分钟。优选的，所述步骤a中，加入⑶4抗体和⑶25抗体至终浓度分别为O. 2 μ g/106细胞，在温度为18°C条件下孵育30分钟，洗涤后在转速为1100转/分钟条件下，离心8分钟。优选的，所述步骤B中，所述避光孵育时间为30-50分钟，加入所述荧光标记的F0XP3抗体至抗体终浓度为O. 125-0. 25 μ g/106细胞。优选的，所述步骤B中，所述避光孵育时间为40分钟，加入所述荧光标记的F0XP3抗体至抗体终浓度为O. 2 μ g/106细胞。
本发明的有益效果在于本发明公开的利用F0XP3为标记物分选Treg细胞的方法，其方法简单，不需要特殊试剂；突破了传统的Treg细胞分选方法，同时用CD4、CD25和F0XP3这三个标记物标记Treg细胞，灵敏度高，分选的Treg细胞纯度高，其纯度大于99. 0%。
图I为利用F0XP3为标记物分选细胞的结果图。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。其中F0XP3固定破膜剂、荧光标记的F0XP3和细胞染色液均购自eBioscience公司。
实施例I
利用F0XP3为标记物分选Treg细胞的方法，具体步骤为
A.收集外周血单核细胞约IXIO6个，用IOOyL在4°C预冷的PBS液重悬，然后加入细胞表面标记物⑶4抗体和⑶25抗体，至⑶4抗体和⑶25抗体的终浓度分别为O. 2 μ g/106细胞，在温度为18°C条件下孵育30分钟；然后用PBS洗涤细胞三次，每次洗涤后在转速为1100转/分钟条件下离心8分钟，弃上清，得洗涤细胞；
B.将步骤A所得洗涤细胞中加入ImL1XF0XP3固定破膜剂洗涤，然后加入ImLI XF0XP3固定破膜剂重悬细胞，室温避光孵育40分钟，离心后弃上清；用IOOyL 1XF0XP3破膜剂重悬细胞；然后加入荧光标记的F0XP3抗体，至抗体终浓度为O. 2 μ g/106细胞，室温避光反应30分钟，得F0XP3抗体标记的细胞；
C.将步骤B所得F0XP3抗体标记的细胞加入O.35mL I X细胞染色液重悬细胞，上流式细胞仪进行分选。本实施例为本发明的最佳实施例。实施例2
利用F0XP3为标记物分选Treg细胞的方法，具体步骤为
A.收集外周血单核细胞约IX IO5个，用100 μ L在4°C预冷的PBS液重悬，然后加入细胞表面标记物⑶4抗体和⑶25抗体，至⑶4抗体和⑶25抗体的终浓度分别为O. 125 μ g/106细胞，在温度为28°C条件下孵育20分钟；然后用PBS洗涤细胞三次，每次洗涤后在转速为1500转/分钟条件下离心5分钟，弃上清，得洗涤细胞；
B.将步骤A所得洗涤细胞中加入O.5mL 1XF0XP3固定破膜剂洗涤，然后加入O. 5mL
IXF0XP3固定破膜剂重悬细胞，室温避光孵育30分钟，离心后弃上清；用100 μ L 1XF0XP3破膜剂重悬细胞；然后加入适量荧光标记的F0XP3抗体，至抗体终浓度为O. 125 μ g/106细胞，室温避光反应30分钟，得F0XP3抗体标记的细胞；
C.将步骤B所得F0XP3抗体标记的细胞加入O.2mL I X细胞染色液重悬细胞，上流式细胞仪进行分选。实施例3
利用F0XP3为标记物分选Treg细胞的方法，具体步骤为A.收集外周血单核细胞约IXIO7个，用IOOyL在4°C预冷的PBS液重悬，然后加入细胞表面标记物⑶4抗体和⑶25抗体，至⑶4抗体和⑶25抗体的终浓度分别为O. 25 μ g/106细胞，在温度为10°C条件下孵育40分钟；然后用PBS洗涤细胞三次，每次洗涤后在转速为1000转/分钟条件下离心10分钟，弃上清，得洗涤细胞；
B.将步骤A所得洗涤细胞中加入O.75mL I XFOXP3固定破膜剂洗涤，然后加入O. 75mL
IXFOXP3固定破膜剂重悬细胞，室温避光孵育50分钟，离心后弃上清；用100 μ L 1XFOXP3破膜剂重悬细胞；然后加入适量荧光标记的FOXP3抗体，至抗体终浓度为O. 25 μ g/106细胞，室温避光反应30分钟，得FOXP3抗体标记的细胞；
C.将步骤B所得FOXP3抗体标记的细胞加入O.5mL I X细胞染色液重悬细胞，上流式细胞仪进行分选。上述实施例1-3流式细胞仪分选的主要条件为，按⑶4\OT25\F0XP3抗体的同型对照抗体的荧光值划定阳性和阴性的界限，将被分选的细胞划分为F0XP3+Treg细胞和F0XP3—T细胞，然后进行分选，结果如图I所示。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.利用F0XP3为标记物分选Treg细胞的方法，其特征在于，具体步骤为 A.收集外周血单核细胞，用PBS液重悬，然后加入细胞表面标记物⑶4抗体和⑶25抗体，在温度为10-28°C条件下孵育；然后用PBS洗涤，离心收集细胞，得洗涤细胞； B.将步骤A所得洗涤细胞中加入F0XP3固定破膜剂洗涤，然后用F0XP3固定破膜剂重悬细胞，避光孵育，离心收集沉淀；然后用F0XP3固定破膜剂重悬细胞；然后加入荧光标记的F0XP3抗体，室温避光反应，得F0XP3抗体标记的细胞； C.将步骤B所得F0XP3抗体标记的细胞加入细胞染色液重悬细胞，上流式细胞仪进行分选。
2.根据权利要求I所述利用F0XP3为标记物分选Treg细胞的方法，其特征在于所述步骤a是将收集的外周血单核细胞在4°C预冷的PBS液重悬至浓度为IX IO5 I X IO7个/100 μ L，加入CD4抗体和CD25抗体至终浓度分别为O. 125-0. 25 μ g/106细胞，在温度为10-28°C条件下孵育20-40分钟，然后用PBS洗涤细胞三次，洗涤后在转速大于1000转/分钟条件下，离心至少5分钟。
3.根据权利要求2所述利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法，其特征在于所述步骤a中，加入⑶4抗体和⑶25抗体至终浓度分别为O. 2 μ g/106细胞，在温度为18°C条件下孵育30分钟，洗涤后在转速为1100转/分钟条件下，离心8分钟。
4.根据权利要求I所述利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法，其特征在于所述步骤B中，所述避光孵育时间为30-50分钟，加入所述荧光标记的FOXP3抗体至抗体终浓度为 O. 125-0. 25 μ g/ΙΟ6 细胞。
5.根据权利要求4所述利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法，其特征在于所述步骤B中，所述避光孵育时间为40分钟，加入所述荧光标记的FOXP3抗体至抗体终浓度为O. 2 μ g/ΙΟ6 细胞。
全文摘要
本发明公开了利用FOXP3为标记物分选Treg细胞的方法，具体为，收集外周血单核细胞，用PBS液重悬，然后加入细胞表面标记物CD4抗体和CD25抗体，在温度为10-28℃条件下孵育；然后用PBS洗涤，离心收集细胞，得洗涤细胞；将所得洗涤细胞中加入FOXP3固定破膜剂洗涤，再用FOXP3破膜剂重悬细胞，避光孵育，离心收集沉淀；然后用FOXP3破膜剂重悬细胞；再加入荧光标记的FOXP3抗体，室温避光反应，最后加入细胞染色液重悬细胞，上流式细胞仪进行分选，本发明公开的分选方法，其灵敏度高，分选的Treg细胞纯度高，其纯度大于99.0%。
文档编号C12N5/0783GK102766597SQ201210268148
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者倪兵, 吴玉章, 田易 申请人:中国人民解放军第三军医大学