一种消化酶组合物及成纤维细胞和饲养层细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种消化酶组合物及成纤维细胞和饲养层细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002]胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs，简称ES、ΕΚ或ESC细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞在组织工程与再生医学等领域极具应用价值。
[0003]然而，由于其难以获得且涉及敏感的伦理问题，使得研究一度陷入尴尬境地。2006年8月，日本Yamanaka研究小组向小鼠成纤维细胞内导入4种转录因子基因(0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4)，成功地将其重编程为ESCs样诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。2007 年底，日本 Yamanaka 小组和美国 Thomson小组相继将这一革命性技术在人类细胞中得以实现。iPSCs的研究是一项具有开创性治疗性克隆的基础研究，避开了长期以来ESCs难以获取且极易引发伦理争议的问题，为干细胞医学应用开辟了一条新的途径，被认为是干细胞领域乃至整个生物学领域的重大发现。包括英国爱丁堡大学Ian ffilmut教授在内的许多科学家均认为诱导性多能干细胞才是干细胞未来的研究方向。iPSCs细胞不仅对于干细胞研究具有重要的理论意义，而且在细胞治疗、组织器官再生、药物筛选与评价等领域极具应用价值。
[0004]现在的iPS技术较初始建立的iPS技术已成熟很多，但目前其距全能干细胞还有一定的差距，且iPS细胞的临床应用研究仅限于理论或初步试验方面。多能干细胞的潜能是巨大的，若能排除iPS细胞应用的安全隐患，提高iPS细胞的得率，进一步提高转化率则可给更多重大疾病患者带来福音。提高iPS细胞的得率，需要多方面条件的改善，正确选择和优化iPS细胞的培养体系也是至关重要的。目前iPS细胞的培养主要分为以下两种培养方式:无饲养层培养和有饲养层培养。现在市面上所售的无饲养层细胞培养基五花八门，然而iPS细胞在初期培养阶段一般都需依赖于能分泌他们在体外存活增殖所必需的生长因子的饲养层细胞。饲养层细胞所分泌的生长因子是iPS细胞培养常用的生长增殖促进剂和分化抑制剂。
[0005]目前，制备iPS细胞饲养层细胞的方法是分离出小鼠胚胎，将小鼠胚胎消化成细胞并接种。具体为:采用断颈法处死C57孕鼠，将小鼠放入75%的酒精中浸泡3-5分钟，取出小鼠，放入无菌超净台中，用镊子和剪刀依次剪开皮肤和内膜，暴露出内脏，找到胚胎，在35mm培养皿中洗涤3次，将胚胎用剪刀剪碎，用0.25%的胰蛋白酶消化15-20分钟，用含胎牛血清的培养基终止消化，300-600g离心5-10分钟；将得到的细胞沉淀用含8%?15%的胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬，采用台盼蓝染色进行细胞计数，然后接种到细胞预先用0.1?0.5 %的明胶溶液包被0.5?2小时的细胞培养瓶中，在37 °C、5 % C02培养箱中培养。然而，采用该方法获得的饲养层细胞的得率较低。因此，建立一种高效的饲养层细胞的制备方法是iPS细胞培养的关键。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明提供了一种消化酶组合物及成纤维细胞和饲养层细胞的制备方法。该消化酶组合物将胰蛋白酶和分散酶以一定比例联合使用后，在大大减少消化酶用量的情况下，反而可起到更好的消化效果，成纤维细胞的得率更高。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0008]本发明提供了一种消化酶组合物，包括胰蛋白酶和分散酶。
[0009]胰蛋白酶(EC 3.4.4.4)为蛋白酶的一种，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。
[0010]分散酶是一类中性金属蛋白水解酶，与胰酶、胶原酶相比，它的作用更加温和，所以不会损伤细胞。此外，分散酶也可以用于组织分离。
[0011]本发明研究发现，与单独使用胰蛋白酶或分散酶相比，将胰蛋白酶和分散酶以一定比例联合使用后，在大大减少消化酶用量的情况下，反而可起到更好的消化效果，成纤维细胞的得率更高。
[0012]作为优选，以酶活力单位U计，胰蛋白酶与分散酶的酶活力比值为(1000?2000):
(1 ?10)ο
[0013]在本发明提供的一些实施例中，以酶活力单位U计，胰蛋白酶与分散酶的酶活力比值为1250:2.2。
[0014]在本发明提供的另一些实施例中，以酶活力单位U计，胰蛋白酶与分散酶的酶活力比值为100:lo
[0015]在本发明提供的另一些实施例中，以酶活力单位U计，胰蛋白酶与分散酶的酶活力比值为2000:lo
[0016]本发明还提供了该消化酶组合物在制备成纤维细胞中的应用；该消化酶组合物包括胰蛋白酶和分散酶；作为优选，以酶活力单位U计，胰蛋白酶与分散酶的酶活力比值为(1000?2000):(1?10);在本发明提供的一些实施例中，以酶活力单位U计，胰蛋白酶与分散酶的酶活力比值为1250:2.2 ;在本发明提供的另一些实施例中，以酶活力单位U计，胰蛋白酶与分散酶的酶活力比值为100:1 ;在本发明提供的另一些实施例中，以酶活力单位U计，胰蛋白酶与分散酶的酶活力比值为2000:1。
[0017]在本发明提供的一些实施例中，成纤维细胞为动物胚胎成纤维细胞。
[0018]在本发明提供的一些实施例中，成纤维细胞为胎龄为10?15天的小鼠胚胎成纤维细胞。
[0019]本发明还提供了一种成纤维细胞的制备方法，包括:
[0020]将动物胚胎剪碎，加入胰蛋白酶和分散酶进行消化，终止消化后去除未消化的组织，获得成纤维细胞。
[0021]作为优选，消化的时间为15?20min。
[0022]作为优选，胚胎为胚胎躯干。为了保证成纤维细胞的纯度，本发明中所用胚胎为去除头、四肢和内脏的胚胎躯干。
[0023]作为优选，动物胚胎为胎龄为10?15天的小鼠胚胎。
[0024]作为优选，以酶活力单位U计，胰蛋白酶的用量为1000?2000U/胚胎，分散酶的用量为1?10U/胚胎。
[0025]作为优选，在将动物胚胎剪碎与加入胰蛋白酶和分散酶进行消化之间，还包括加入胰蛋白酶继续剪1?3min。
[0026]本发明还提供了一种饲养层细胞的制备方法，包括:
[0027]将动物胚胎剪碎，加入胰蛋白酶和分散酶进行消化，终止消化后去除未消化的组织，获得成纤维细胞；
[0028]采用丝裂霉素C处理成纤维细胞，经消化、细胞培养，获得饲养层细胞。
[0029]作为优选，成纤维细胞为P3代成纤维细胞。
[0030]作为优选，细胞培养为在37°C、体积分数为5%的C02条件下培养24h。
[0031]在本发明提供的一些实施例中，丝裂霉素C处理的条件为:在37°C、体积分数为5%的C02条件下采用丝裂霉素C处理2?3h。
[0032]在本发明提供的一些实施例中，采用丝裂霉素C处理成纤维细胞后，采用胰蛋白酶消化1?2min。
[0033]作为优选，细胞培养的细胞浓度为(1?10) X 107/Lo
[0034]优选地，细胞培养的细胞浓度为5.0 X 107/L。
[0035]本发明提供了一种消化酶组合物及成纤维细胞和饲养层细胞的制备方法。该消化酶组合物包括胰蛋白酶和分散酶。本发明至少具有如下优势之一:
[0036]1、本发明将胰蛋白酶和分散酶以一定比例联合使用后，在大大减少消化酶用量的情况下，可起到更好的消化效果，成纤维细胞的得率更高；
[0037]2、成纤维细胞分离过程中只保留胚胎的躯干，得到的成纤维细胞的纯度更高。
【附图说明】
[0038]图1示P。代MEF的形态；
[0039]图2示饲养层细胞的制备流程；
[0040]图3示饲养层细胞的活力曲线图。
【具体实施方式】
[0041]本发明公开了一种消化酶组合物及成纤维细胞和饲养层细胞的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0042]术语解释:
[0043]饲养层细胞:是指一些特定细胞(如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外养的细胞)，经有丝分裂阻断剂(常用丝裂霉素)处理后所得的细胞单层。饲养层细胞大部分可用MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)经处理获得。
[0044]成纤维细胞(fibroblast):是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。
[0045]本发明提供的消化酶组合物及成纤维细胞和饲养层细胞的制备方法中所用实验动物、消化酶、试剂等均可由市场购得。在本发明实施例中，胰蛋白酶的酶活力为250U/mg，分散酶的酶活力为1.lU/mgo小鼠类型:C57BL/6。
[0046]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0047]实施例1胚胎成纤维细胞的制备
[0048]从广东省医学实验动物中心购买13天的C57孕鼠，采用断颈法处死小鼠，将小鼠放入75%的酒精中浸泡3-5分钟，取出小鼠，放入无菌超净台中，用一套干净的镊子和剪刀剪开皮肤，换一套干净的镊子和剪刀，剪开皮肤内膜，暴露出内脏，找到胚胎，一般8-10个胚胎/孕鼠，在35mm培养