一种标记干细胞的方法及对应的磁力引导装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种标记干细胞的方法及对应的磁力引导装置。利用超顺磁氧化铁纳米颗粒的铁磁性，采用磁力引导靶向技术使目标干细胞在靶组织定向富集，具有安全有效，方法简便等优点，随着干细胞治疗方法的推广，具有广泛的应用前景；同时，磁力引导设备为内径呈梯度变化的U形磁铁组成，在使用中，随着血液流动，磁力强度呈梯度变化，从而可以有效缓解甚至避免由于磁力过大引起的细胞堵塞问题，相对比无变化磁场引导等方法，进一步提高安全性。
【专利说明】一种标记干细胞的方法及对应的磁力引导装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学、生物【技术领域】，尤其涉及一种带磁性的干细胞的标记方法及对应的磁力引导装置。
【背景技术】
[0002]外周血管病变是糖尿病主要的慢性并发症之一，同时也是导致糖尿病患者截肢的主要原因。近几年，随着干细胞生物学的研究深入，干细胞移植修复缺血组织及血管侧枝循环重建已成为外周血管缺血治疗的研究热点。该治疗方法是基于干细胞具有高度的可塑性，即在一定条件下，能够分化成为不同的细胞谱系的细胞，如血管内皮细胞等。在治疗过程中，将干细胞植入病变部位，并通过其分化形成新的血管细胞，修复受损部位，从而改善或恢复外周组织的血供，达到治疗外周血管病变的目的。
[0003]有报道指出，干细胞治疗方法的效果与干细胞在病变部位富集程度有密切关系。目前，临床上经常使用两种方法增加局部细胞集聚:一种是静脉注射法，该方法通过将将干细胞注射入外周静脉血管内，通过血液循环，使干细胞到达靶组织区域。然而该方法为全身给药无特意选择性，靶组织区域的干细胞浓度较低，治疗效果不甚理想。另一种方法与此相对，在病变部位直接注入干细胞，采用此方法时，干细胞直接被注入到靶组织区域，保证了干细胞的集聚浓度，但此直接注入方法需要手术实现，操作复杂，患者创伤大，康复时间长。综上所述，设计一种安全有效并且简便的干细胞局部富集方法用于治疗外周血管病变具有非常重要的临床意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种标记干细胞的方法及对应的磁力引导装置，大大提高了安全性。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0006]一种标记干细胞的方法，该方法包括:
[0007]基于内吞作用、胞吞作用、胞饮作用、基于超声原理或基于电穿孔原理使具有铁磁性的纳米颗粒进入干细胞，完成对干细胞的标记，获得带铁磁性的干细胞。
[0008]所述的具有铁磁性的纳米颗粒包括:超顺磁氧化铁SP1纳米颗粒。
[0009]一种用于引导所述带磁性的干细胞的磁力引导装置，所述磁力引导装置包括:多个内径呈梯度变化的U形磁铁，形成磁场强度呈梯度变化的磁场，且所述多个内径呈梯度变化的U形磁铁通过无磁性有机多聚物固定封装。
[0010]在有磁性引导时，带铁磁性的干细胞在磁场的作用下向目标区域定向富集。
[0011]由上述本发明提供的技术方案可以看出，利用超顺磁氧化铁纳米颗粒的铁磁性，采用磁力引导靶向技术使目标细胞在靶组织定位富集，具有安全有效，方法简便等优点，随着干细胞治疗方法的推广，具有广泛的应用前景；同时，磁力引导设备为内径呈梯度变化的U形磁铁组成，在使用中，随着血液流动，磁场呈梯度变化，从而可以有效缓解甚至避免由于磁力突然过大引起的SP1堵塞问题，从而进一步提高安全性。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
[0013]图1为本发明实施例一提供的一种标记干细胞的方法的流程图；
[0014]图2为本发明实施例二提供的磁力引导装置的示意图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
[0016]实施例一
[0017]本发明实施例一提供一种标记干细胞的方法，该方法基于内吞作用、胞吞作用、胞饮作用、基于超声原理或基于电穿孔原理使具有铁磁性的纳米颗粒进入干细胞，完成对干细胞的标记，获得带铁磁性的干细胞。
[0018]在本发明实施例中，所述标记方法可以使用简单的共同孵育，或受体介导胞吞，或使用协助内吞的转染试剂，或使用超声标记的方法，或使用电穿孔(电击法)等方法，使具有铁磁性纳米颗粒可以进入到干细胞内；所述具有铁磁性的纳米颗粒包括:SP10(超顺磁氧化铁)纳米颗粒，或其他基于Fe且具有铁磁性的纳米颗粒。
[0019]示例性的，下面以SP1纳米颗粒为例简述各种标记方法:
[0020]1、直接孵育，如图1所示，主要包括如下两个步骤:
[0021]步骤11、将干细胞与SP1纳米颗粒放置于容器中共同孵育2小时，直至所述SP1纳米颗粒进入所述干细胞。
[0022]步骤12、再使用生理盐水对所述干细胞进行洗涤，获得内含铁磁性颗粒的干细胞。
[0023]2、受体介导胞吞。将SP1与特定的受体(如多聚阳离子HIV tat肽结合或与抗转铁蛋白受体的单克隆抗体等)结合，将复合物与干细胞共同培养，通过和干细胞膜表面相应的受体结合，形成内饮小泡，使SP1转运进入细胞，使细胞得以标记。
[0024]3、转染试剂介导标记。将转染试剂与细胞及SP1共同培养，使SP1颗粒通过融合进入细胞，从而促使细胞内化，用于标记细胞。
[0025]4、电穿孔方法(也称电击法)。利用脉冲电场改变细胞膜的通透性达到使SP1颗粒进入细胞。该方法通过将细胞膜置于高强度的电脉冲下，引起局部短暂的屏障失稳，细胞膜在搅动中形成微孔，使培养液中的SP1颗粒进入细胞，从而标记细胞。
[0026]5、超声标记(也称声穿孔法)。其方法是使用超声波对干细胞悬浮液进行辐照，使细胞膜可以对大分子暂时开放，在此期间SP1进入细胞内，而后细胞膜再封闭起来，从而达到标记细胞的目的。
[0027]上述方法中利用带有磁性的纳米颗粒对干细胞进行标记，之后可以根据干细胞带有磁性的特点可以利用磁性进行引导，使得干细胞在磁场作用下定向富集于靶组织。
[0028]本发明实施例中，所述干细胞为具有特定细胞表面标记，具有多种分化潜能的细胞，细胞来源可以是人脐带、脐带血、骨髓以及脂肪及其他器官；下面简述获得人脐带间充质干细胞过程。
[0029]I)选择健康产妇于手术中无菌采集的剖宫产胎儿的脐带(事先经患者同意)，用预冷的双抗PBS冲洗脐带外表面，去除表面的凝血块。
[0030]2)用止血钳夹住脐带两端开口，放入过滤除菌的75%医用酒精中，浸泡约lmin。
[0031]3)取出酒精浸泡的脐带，洗去残余酒精，将脐带剪成2-3cm的小段，放入新的PBS中。
[0032]4)分离脐带:用组织镊去除脐带的两根动脉、一根静脉，以及外膜，分离出华通胶质组织,放入加入PBS中。
[0033]5)收集分离出的所有华通胶组织，剪刀剪碎，用PBS清洗胶体小组织块两次，加入培养基，分瓶培养。
[0034]6) 3-5天以后，对胶体组织换液一次。
[0035]7) 5-7天后，hUMSC会由胶体小组织块长出，并携带胶体组织块贴壁。
[0036]8)3天后，用0.125%的Trypsin消化细胞，所得细胞悬液按照常规细胞培养步骤进行培养，即可得到人脐带间充质干细胞。
[0037]利用内吞作用使得干细胞带有磁性。本发明实施例中，采用包裹葡聚糖的SP1 (超顺磁氧化铁)纳米颗粒使用经FDA批准的商品化造影剂Ferridex 1.V (AdvancedMagnetics, Inc.)，也可以使用其他的合成的基于Fe且具有铁磁性的造影剂。即将利用前述方法得到的干细胞与Ferridex 1.V共同孵育2小时,此时SP1纳米颗粒进入干细胞；再经生理盐水洗涤干细胞，得到带标记的可收到磁场引导的干细胞。
[0038]本发明实施例中，所述SP1纳米颗粒直径在15-200纳米左右，由于SP1具有铁磁性，因而进入干细胞后，所述干细胞也具有铁磁性。
[0039]根据干细胞带有磁性的特点可以利用磁性进行引导，使得干细胞在磁场作用下定向富集于靶组织，当无磁性引导时，干细胞被定向引导的能力，细胞中的SP1颗粒进入代谢循环，不会特异性滞留于靶组织区，对机体无毒副作用。本方法具有安全有效，方法简便等优点，随着干细胞治疗方法的推广，具有广泛的应用前景。
[0040]实施例二
[0041]本发明实施例提供一种磁力引导装置，该装置可以引导实施例一所述的带磁性的干细胞。
[0042]如图2所示，所述磁力引导装置包括:多个内径呈梯度变化的U形磁铁，形成磁场强度呈梯度变化的磁场，且所述多个内径呈梯度变化的U形磁铁通过无磁性有机多聚物固定封装。
[0043]示例性的，材料选用铷铁硼等用磁性材料，外围尺寸300X250X82mm，宽端U形内径为230mm,窄端U形内径为142mm。
[0044]本发明实施例中，所述磁力引导装置为内径呈梯度变化的U形磁铁组成，两磁极间距离逐渐变小，磁极逐渐变厚。此时，在两磁极间形成磁场且随磁极间距离变小，逐渐增强，磁场强度可以使带有磁性的干细胞具有良好的富集效果，增加干细胞在该部位的锚定，增加干细胞存活率，增强干细胞治疗效果；另外，梯度磁场还可以有效缓解甚至避免由于磁力突然加大引起的SP1堵塞问题，相比于无梯度磁场强度变化的引导，安全性得到显著提闻。
[0045]示例性的，下面以具体示例为例进行说明。
[0046]本发明实施例中，使用下肢动脉腔内注射干细胞至靶组织区，细胞浓度为109/肢干细胞。
[0047]1)1%利多卡因行股动脉区域的局部麻醉，成功后穿刺同侧股动脉或者对侧股动脉，放置5F动脉鞘管后备用。
[0048]2)将患者下肢放置于磁力引导装置中，本装置使用铷铁硼等永磁性材料可提高磁场强度，使干细胞在下肢缺血区聚集；前宽后窄设计可形成梯度场，避免磁力引导细胞时产生的堵塞现象。
[0049]3)用导丝和导管到下肢动脉，交换导丝送入球囊到病变部位，充盈球囊，阻断动脉，将干细胞混合液推入动脉腔内，之后放松球囊并撤除。
[0050]4)退出动脉鞘管，压迫穿刺口 15-20分钟后包扎穿刺口。
[0051]将下肢缺血部位定位于磁力引导装置中，使缺血下肢位于磁场中，在带有磁性的干细胞注入体内的后，沿血液循环分布于体内的各级血管，由于下肢处于磁场中，内含铁磁性粒子的干细胞将受到磁力引导，增加在下肢血管的集聚，更多的锚定在此区域血管，从而使细胞富集于此区域，加强此区域的干细胞治疗效果。
[0052]本发明上述实施例中，利用超顺磁氧化铁纳米颗粒的铁磁性，采用磁力引导靶向技术使标记的干细胞在靶组织定位富集，具有安全有效，方法简便等优点，随着干细胞治疗方法的推广，具有广泛的应用前景；同时，磁力引导设备为内径呈梯度变化的U形磁铁组成，在使用中，随着血液流动，磁力逐渐增大，从而可以有效缓解甚至避免由于磁力过大引起的SP1堵塞问题，从而进一步提高安全性。
[0053]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
【权利要求】
1.一种标记干细胞的方法，其特征在于，该方法包括: 基于内吞作用、胞吞作用、胞饮作用、基于超声原理或基于电穿孔原理使具有铁磁性的纳米颗粒进入干细胞，完成对干细胞的标记，获得带铁磁性的干细胞。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述具有铁磁性的纳米颗粒包括:超顺磁氧化铁3？10纳米颗粒。
3.一种用于引导权利要求1-2任一项所述带磁性的干细胞的磁力引导装置，其特征在于，所述磁力引导装置包括:多个内径呈梯度变化的V形磁铁，形成磁场强度呈梯度变化的磁场，且所述多个内径呈梯度变化的V形磁铁通过无磁性有机多聚物固定封装。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于， 在有磁性引导时，带铁磁性的干细胞在磁场的作用下向目标区域定向富集。
【文档编号】C12N5/0775GK104357384SQ201410597230
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】南翔, 邱本胜 申请人:中国科学技术大学