专利名称：不含异源成分的gM-阴性EHV突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物健康领域，特别是涉及编码gM蛋白的基因缺失且不含异源成分 (heterologous element)的马疱疫病毒(Equine Herpes Viruse) (EHV)。本发明进一步涉及包含所说病毒的药用组合物及其应用，以及预防和治疗EHV感染的方法。本发明也涉及包含EHV-I和EHV-4病毒的药用组合物，其中编码gM蛋白的基因缺失，并且不含有异源成分。
背景技术：
马疱疫病毒I (EHV-1),作为α疱疫病毒亚科(Alphaherpesvirinae)的成员，是马中病毒引起流产的主要原因，它也可引起呼吸和神经系统疾病。马疱疹病毒4(EHV-4) 也可引起呼吸系统疾病，流产，或神经系统疾病。已经鉴定出了两种类(EHV-1:菌株 Ab4p;EHV-4:菌株 NS80567)的 DNA 全序列(Telford, E. A. R. et al.，1992; Telford, E.A.R. et al. , 1998) 0然而，只鉴定出了少数与EHV毒力和免疫原特性相关的基因和基因产品O
疱疹病毒的糖蛋白，在病毒感染初期阶段，病毒粒子的细胞释放阶段，以及病毒粒子通过与相邻细胞融合而进行细胞至细胞的直接扩散阶段，都扮演了至关重要的作用。迄今为止，已经鉴定出了 11种I型单纯疱疹病毒(HSV-I)编码的糖蛋白，它们命名为 gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl, gj, gK, gL 和 gM。缺失了 gC, gE, gG, gl, gj,和 gM 的 HSV-I 突变体是活的，显示这些基因在培养细胞中对病毒复制是可有可无的。HSV-I和马疱疹病毒I的核苷酸序列比较显示，所有的已知HSV-I糖蛋白在EHV-I中都是保守的。按照当前的命名法，这些糖蛋白被以它们的HSV-I同源类似物的名字命名。已知EHV-I的gC，gE和gl不是在细胞培养物中生长所必需的，而gB和gD则是病毒在培养细胞中生长所必需的。其它 EHV-I糖蛋白对在培养细胞中病毒复制所起的作用是未知的(Flowers，C. C. et al.，1992)。 转录和蛋白分析显示，糖蛋白gB, gC, gD, gG, gH和gK可在EHV-I感染的细胞中表达。糖蛋白 gM(由基因 ULlO 表达[Baines, J. D. et al.，1991;Baines, J. D. et al.，1993])是唯一报道的非必要糖蛋白，其在所有的疱疹病毒亚家族中是保守的，并且对于人、小鼠巨细胞病毒，以及Y疱疫病毒亚科成员EHV-2,松鼠猴疱疫病毒(herpesvirus saimiri),以及EB病毒(Epstein-Barr)有记载。与许多疱疹病毒糖蛋白类似，HSV-I gM在病毒粒子和感染细胞的膜上出现。只缺失gM的HSV-I突变体在细胞培养系统中的生长滴度，与野生型病毒相比，大约减少了 10倍，而且在小鼠模型中显示出了减少的毒力(Baines，J. D. et al.，1991;MacLean, C. A. et al.，1993)。EHV-IgM 同源类似物(gp21/22a;本文中称为 EHV-IgM)第一次是被Alien和Yeargan (Allen, G. P. et al, 1987)所记载，认为其是病毒包膜的主要成分。进一步的研究显示，基因52是与HSV-1UL10同源的基因，编码450个氨基酸的 EHV-I gM 多肽(Pilling, A. et al. , 1994; Telford, E. A. R. et al.，1992)。EHV-I gM 是一个多聚体疏水蛋白，包含有8个预测的跨膜区，据报道在感染细胞和纯化病毒粒子中出现，是 Mr 为 45,000 的蛋白(Pilling, A. et al. , 1994; Telford, E. A. R. et al.，1992)。
为了控制EHV-I的病毒感染，可以采取两种不同的方法。第一种，开发修饰的活疫苗(MLVs)，包括广泛在欧洲和美国中使用的RacH株(Mayr, A. et al.，1968;Hubert, P. H. et al. , 1996) 0第二种，灭活疫苗，以及基于重组表达的病毒糖蛋白亚单位疫苗，如糖蛋白(g)B,C, D,和H，它们可对接下来在模型鼠中EHV-I的感染接种产生部分的保护作用。包含所说糖蛋白的亚单位疫苗，如gB，gC，gD，和gH，只有很弱的抗重复感染的保护作用(Awan et al.,1990, Osterrieder et al. , 1995, Tewari et al. , 1994, Stokes et al, 1996)。
本发明要解决的技术问题是，提供一种比现有技术疫苗能更好抗EHV感染的改良疫苗。
图I :不含外源序列的gM缺失EHV-IRacH病毒(H Δ gM_w)的构建
此图显示了病毒的基因图，和用于构建HAgM-W的质粒。通过插入大肠杆菌 IacZ(HAgM-IacZ)表达框或绿色荧光蛋白(GFP)表达框(HΛ gM_GFP)，首先构建“第一代”ΗΛ gM 病毒。图 A 显示了 EHV-I RacH 株的 BamHl 图谱，包含 gM_0RF 的 BamHI-HindIII 片段在图B中被放大了，显示出了该区域的基因组结构。gM缺失病毒一H Δ gM-GFP，携带有取代了 EHV-IgM基因主要部分的GFP表达框。图C记载了在Southern印迹中使用的GFP特异性探针。质粒pBH3. I携带有EHV-IBamHI-HindIII目标片段，它用于构建质粒pXuBaxA。 H Δ gM-GFP的DNA与质粒pXuBaxA共转染，得到H Δ gM_w (图D)。
限制性位点BamHl_B，Hindlll-H,Sphl-S, Hincll-Hc, Apal-A, Pstl-P
图2 :不含外源序列gM缺失的EHV-1病毒(HAgM-w)的Southern印迹
将RacH 毒株，ΗΛ gM-GFP，以及 ΗΛ gM_w 的 DNA 用 BamHl, Hindlll，或 Pstl 裂解， 然后用GFP-特异性探针(GFP)或pBH3. I的EHV-IBamHI-HindIII片段进行分析(pBH3. I)。 使用CSro借助化学发光检测DNA杂交体。分子量标记蛋白的分子量大小(Biolabs)在左侧空白处以kbp大小给出。在箭头所指处，特异性杂交体几乎是不可见的。
图3 :不含外源序列的gM缺失的EHV-4病毒的构建(E4 Δ gM_w)
本图中，描述了 EHV-4NS80567株的BamHl图谱。在放大图中，BamHl-e片段包括gM和邻近的ORFs (A)。图B描述了质粒构建体和引物位点。质粒pgM4GFP+用于构建 E4 Δ gM-GFP,即 GFP 是阳性且 gM 是阴性的 EHV-4 (B, C)。将 E4 Λ gM-GFP 与包含 3. 109bp 大小EHV-4序列、包含gM-ORF的质粒pgM4R(B)进行DNA重组，可获得E4RgM，即gM修复的(gM-r印aired) EHV-4⑷。或者将E4 Δ gM-GFP与质粒pgM4w⑶进行DNA重组，可获得 E4 Δ gM-w，即GFP和gM都是阴性的EHV-4⑶。
限制性位点BamHl-B,Pstl-P, EcoRI-E, Sall-Sa, Mlul-M, Asnl-As, EcoRV-EV
图4 :不含外源序列的gM缺失的EHV-4病毒的Southern印迹(E4 Δ gM_w)
如图所示，将EHV-4, E4RgM, E4 Δ gM-w 和 E4 Δ gM-GFP 的 DNA 用 Pstl, EcoRV 或 HindIII裂解，获得的DNA片段印迹至尼龙膜上。将平行膜与GFP特异性序列杂交，或者将平行膜与称为gM3. I的探针杂交，gM3. I探针包含来自质粒pgM4R(图3)的EHV-4特异性序列。使用CSro通过化学发光检测DNA杂交体。分子量标记蛋白的分子量大小(Biolabs) 以kbp给出ο
图5 :gM缺失的EHV-4病毒，即E4 Δ gM-w的生长特性。
细胞用列在图框中的MOI为2的不同病毒感染。病毒生长动力学以病毒滴定相对于图中所示的时间点给出，所述滴定以感染的细胞上清液中的病毒浓度确定(细胞外活性)，或者以感染细胞内的病毒浓度确定(细胞内活性)。图中显示的是两次试验的平均值， 标准误差用误差线(error bar)表示。
图6 Ε4 Δ gM-w的空斑大小
Vero 或 Vero-gM 细胞在 6 孔板上分别用 50PFU 的 EHV-4, E4RgM, E4 Δ gM-GFP 或 E4 Λ gM-w感染。确定了 150个不同空斑的最大直径，其空斑大小的平均值以相对于野生型空斑大小的百分数给出，野生型的空斑大小设置为100%。标准误差用误差线表示(A)。空斑在平板接种(P. i.)第4天用间接免疫荧光技术(抗-gD Mab20C4, I 1000)进行染色， 用Axioscope (xlOO, Zeiss, Germany)进行分析。图片进行扫描和数据处理(B)。
图7 EHV-4病毒侵入Vero细胞
EHV-4, E4RgM, E4 Δ gM_w 和 E4 Δ gM-GFP 在非补足 Vero 细胞(non complementing Vero cell) (A)或补足 Vero-gM 细胞(Complementing Vero-gMcell) (B)的情况下，可穿入 Vero细胞。在给定的时间点，穿入效率是以柠檬酸盐处理后相对于空白处理所存在的空斑数量的百分数来确定的。图中给出了两个次试验的平均值。以误差线表示标准误差。
图8 EHV-4基因组内的PCR引物序列和扩增位点
表示限制性酶识别位点的序列以粗体显示，列出了其相应的限制性酶。将PCR产物插入至给定的载体，可获得表中所示的质粒pCgM4, pgM4R, pgM4Dell或pgM4Del2。片段在EHV-4基因组中的位置，是相对于Telford等(1998)所确定的序列给出的。
图9 :马血清的Western印迹分析
将表达EHV-IgM的ccgM细胞系和Rkl3细胞裂解，在56°C加热2min (I, 2)，或者在 95°C加热5min(3) (gM是高度疏水的，已知会沸腾凝集以致其不能再进入分离胶)。同样的印迹与各种马血清(1:3000)或抗gM的兔血清温育。箭头指沸腾或未沸腾样品中的gM特异性反应。给出了血清的中和试验滴定(NT)，血清是来自病毒学诊断单位。
图10
(A)用抗EHV-IgM的多克隆抗体，对EHV-IgM和EHV_4gM进行比较。将细胞用图中显示的病毒感染(Μ0Ι为O. 5-1)，在平板接种(p. i.)的既定时刻制备细胞裂解物。将 EHV-I或EHV-4病毒粒子通过多次的葡萄糖密度梯度(sucrose cussion) (30%)离心纯化， 再重悬于PBS溶液中。将样品与含有5%2_巯基乙醇的缓冲液混合，接着加热至99°C 5min, 或者将其放置在4°C。蛋白用SDS-10%PAGE分离，印迹至硝基纤维素滤膜上。使用抗兔免疫球蛋白G(IgG)过氧化物酶偶联物(Sigma)显示抗体的结合，接着用ECLTM检测 (Pharmacia-Amersham)。
(B)从感染了 EHV-4, E4 Δ gM-w, E4 Δ gM-GFP,或 E4RgM 的 Edmin337 细胞中纯化病毒粒子，将病毒粒子进行如图A所示的Western印迹分析。接着，用抗EHV-IgB的单克隆抗体3F6或抗EHV-IgM的多克隆抗体，对病毒粒子的gB反应性与gM反应性进行比较。
本发明还涉及
I. 一种蛋白gM缺失的马疱疹病毒(EHV)，其特征在于所述EHV不含异源成分。
2.项I的EHV，其特征在于编码蛋白gM的基因缺失。
3.项I或2的EHV，通过包含下述步骤的方法获得
a)分离野生型EHV ；
b)任选与侧翼序列，构建编码EHV gM基因的质粒；
c)构建表达gM或部分gM的补足细胞系；
d)在编码gM的质粒中插入GFP编码框，将该编码gM的质粒与EHV核酸共转染至步骤b)构建的补足细胞系中，以获得含有GFP编码框插入至其gM编码序列的病毒；
e)除去GFP编码框；和
f)筛选GFP编码框被成功去除的EHV克隆。
4.项1-3任意一项的EHV，其特征在于它是EHV-1。
5.项1-4任意一项的EHV-I，其特征在于850-1 IOObp大小的gM可读框被去除。
6.权利要求1-5任意一项的EHV-I，其特征在于除了 150_200bp大小的C端编码序列和150-250bp大小的N端编码序列被保留以外，其余整个gM编码序列都被去除。
7.项1-6任意一项的EHV-I，其特征在于相应于Telford位置(1992)的gM编码序列93268-93318至94222-94322位的核苷酸被去除。
8.项1-7任意一项的EHV-I，其特征在于相应于Telford位置(1992)的gM编码序列93268-94322位的核苷酸被去除。
9.项1-8任意一项的EHV-I，其特征在于除了 184bp大小的C端编码序列和209bp 大小的N端编码序列被保留以外，其余整个gM编码序列都被去除。
10.项1-9任意一项的EHV-I，其特征在于相应于Telford位置(1992)的gM编码序列94263-93302位的核苷酸被去除。
11.项1-10任意一项的EHV-I，其特征在于它是基于EHV-IRacH株的重组突变体。
12.项1-11任意一项的EHV-1，其特征在于它是基于RacH的重组突变分离株 HΛgM-w，其保藏在ECACC/CAMR，保藏日期是 2002 年10月16日，保藏号是02101663。
13.项1-3任意一项的EHV，其特征在于它是EHV-4。
14.项1-3或13任意一项的EHV-4，其特征在于900-1150bp大小的gM可读框被去除。
15.项1-3或13-14任意一项的EHV-4，其特征在于除了 0_50bp大小的C端编码序列和150-250bp大小的N端编码序列被保留以外，其余整个gM编码序列都被去除。
16.项1-3或13-15任意一项的EHV-4，其特征在于相应于Telford位置(1998) 的gM编码序列92681-92731至93765-93865位的核苷酸被去除。
17.项1-3或13-16任意一项的EHV-4，其特征在于相应于Telford位置(1998) 的gM编码序列92681-93865位的核苷酸被去除。
18.项1-3或13-17任意一项的EHV-4，其特征在于除了 34bp大小的C端编码序列和209bp大小的N端编码序列被保留以外，其余整个gM编码序列都被去除。
19.项1-3或13-18任意一项的EHV-4，其特征在于相应于Telford位置(1998) 的gM编码序列92715-93824位的核苷酸被去除。
20.项1-3或13-19任意一项的EHV-4，其特征在于它是基于EHV_4MSVLot071398的重组突变体。
21.项1-3或13-20任意一项的EHV-4，其特征在于它是基于MSV Lot071398株和6E4 Δ gM-w分离株的，并且它是保藏在ECACC/CAMR，保藏日期为2003年01月14日，保藏号为 03011401 的 EHV-4。
22.编码项1-21任意一项的EHV的核酸。
23.包含项1-21任意一项的EHV的疫苗制品。
24.包含项22的核酸的疫苗制品。
25.项1-21任意一项的EHV在制备预防和/或治疗EHV相关疾病药物中的应用。
26.项22的核酸在制备预防和/或治疗EHV相关疾病药物中的应用。
27. 一种预防和/或治疗动物的方法，其特征在于对所述动物施用项23或24的疫苗制品，且监测其治疗效果。
28.包含至少一种项1-12任一项所述的EHV-1和至少一种项1_3或13-21任一项所述的EHV-4的疫苗制品。
29.至少一种项1-12任一项所述的EHV-1和至少一种项1_3或13-21任一项所述的EHV-4在制备治疗EHV相关疾病药物中的应用。
30. 一种预防和/或治疗动物的方法，其特征在于对所述动物施用项28的疫苗制品，且监测其治疗效果。
31.获得重组EHV的方法，包括以下步骤
g)分离野生型EHV ；
h)任选与侧翼序列，构建编码EHV gM基因的质粒；
i)构建表达gM或部分gM的补足细胞系；
j)在编码gM的质粒中插入GFP编码框，将该编码gM的质粒与EHV核酸共转染至步骤b)构建的补足细胞系中，以获得含有GFP编码框插入至其gM编码序列的病毒；
k)除去GFP编码框；和
I)筛选GFP编码框被成功去除的EHV克隆。
32.项31方法中使用的细胞系，其特征在于所述细胞系中转入了蛋白gM编码基因，并且所述细胞系表达蛋白gM。
33.项32的细胞系，其特征在于细胞系选自Vero细胞，RK-13，以及cc组成的组。
34.项31-33任意一项的细胞系，其特征在于它是gM补足细胞系VER0GM，其保藏在ECACC/CAMR，保藏日期为2003年01月28日，保藏号是03012801。发明内容
在说明书中使用的术语定义
在描述本发明的具体内容之前，必须注意到，如果上下文中没有明确地相反指示， 在本文及其附属的权利要求中使用的单数形式"a"，"an"，"the"，都包括复数内容。例如， “EHV病毒”是指包括多种这样的EHV病毒，即也包括像EHV1，4以及其它种类的所有亚种 (subspecies)细胞”是指一种或多种细胞及本领域技术人员已知的各种等同物，依此类推。如果没有相反的解释，本文中使用的所有科技术语，都与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意思相同。虽然与本文中描述的材料和方法相似或等同的任何材料和方法，都能用在本发明的实施例或试验中，但是，本文中描述了优选的方法，设备，及材料。在与本发明相关的各种出版物中，已经报道了各种细胞系，载体，及方法。为了使所述细胞系，载体，及方法能充分地记载和公开，本文中提到的所有公开出版物，都将并入本文作为参考。此不应解释为承认，由于在前发明，本发明没有权利提前上述公开。
本文中使用的术语“EHV”是指，所有的马疱疹病毒，例如α疱疹病毒亚科家族中的EHV-I种，EHV-4种。术语EH-病毒，EH病毒，EHV病毒，EHV-病毒，以及EHV都是指马疱疫病毒。
毒力本文中使用的“毒力(virulence) ”是指，EH-病毒能在靶宿主中繁殖(如马)，可有效引起以呼吸道症状、流产、或神经紊乱为特征的亚临床或临床疾病的能力。有关毒性EHV的例子是，可引起严重临床症状的野生型病毒。有关毒力因子的例子是，血红细胞裂解素(可裂解血红细胞)，粘附素(病原体通过粘附素能粘附至宿主细胞，然后开始繁殖入侵)。更具体地，本文中的“毒力”是指gM基因产物-病毒包膜的主要成分，它能使病毒穿入至宿主细胞，并且可介导病毒在细胞至细胞间的传播。
减毒本文中使用的“减毒的EH-病毒”是指，不引起EHV相关亚临床或临床疾病但有感染性的EHV。特别地，根据本发明，这样的减毒EH病毒是可复制但不能表达gM的EHV。
根据本发明，EH-病毒的“功能变异体”是指，有与本发明EHV基本相似生物活性 (功能或结构)的EHV病毒。术语“功能变异体”也包括，“片段”、“功能变异体”、“基于核酸密码子简并的变异体”、或“化学衍生物”。这样的“功能变异体”例如，可以进行一个或数个核酸的取代，缺失或插入。所说的取代，缺失或插入，可以占整个序列的10%。所说的功能变异体至少部分保持了其生物活性，如与感染性的克隆或疫苗株有相同的功能，或者甚至表现出了提高的生物活性。
“基于遗传密码子简并的变异体”是指，由于某个氨基酸可以由多个不同的核酸三联密码子编码而导致遗传密码改性的变异体。所说的变异体至少部分保留了其生物活性， 或者甚至表现出了提高的生物活性。
“融合分子”是可与，例如报告分子如辐射标记分子，化学分子如荧光标记分子，或本领域已知的其它任何分子，融合的本发明中的DNA分子或感染性的EHV病毒。
在本文中，本发明的“化学衍生物”是指，化学修饰或含有添加化学部分的本发明中的DNA分子或感染性的EHV克隆，其中添加的化学部分正常情况下不是该分子的一部分。 这样的修饰或添加部分可提高分子的溶解性，吸收性，生物半衰期等等。
如果两个分子有大体上相似的核酸序列或生物活性，那么这两个分子是“基本相同的”。因此，如果两个分子有相似的活性，那么它们被认为是本文所定义的变异体，即使它们的核酸序列不相同；有相似核苷酸序列的两个分子也认为是本发明所定义的变异体，即使它们的生物活性不同。
本文中使用的术语“疫苗”是指，包含至少一种免疫活性成分和可以添加但不是必需添加的一种或多种可添加成分的药用组合物。免疫活性成分可导致动物的免疫应答，而可添加成分则可增强所述活性成分的免疫活性。疫苗可以进一步包括药用组合物中通常使用的成分。疫苗的免疫活性成分可以包括，以原始形式存在的完全病毒粒子，或称为修饰活疫苗(MLV)中的减毒粒子，或称为灭活疫苗(KV)通过适当方法将其灭活的灭活粒子。另一形式中，疫苗免疫活性成分可以包括，所述生物体的合适成分(亚单位疫苗)。其中，这些成分，可以通过破坏整个病毒粒子或含有上述粒子的生长培养基，以及进行可产生目的结构的可选择的后续纯化步骤而获得；也可以通过，借助基于例如细菌，昆虫，哺乳动物，或其它种类的合适系统、包括合适操作的化学合成，加上可选择的后续分离和纯化步骤而获得；还可以通过使用合适的药用组合物(多核苷酸疫苗)，借助遗传物质的直接整合，将上述合成过程导入至需要疫苗的动物。疫苗可以包括，一种或同时含有多于一种的上述成分。
本文中理解的术语“疫苗”，可以是包括抗原物质的兽用疫苗，给药该疫苗可产生针对EHV所引发疾病的特异性主动免疫应答。本发明的EHV疫苗可赋予主动免疫，它可以通过母体针对疫苗所包含的免疫原的抗体被动转移至后代，有时也可针对与抗原相关的生物体。
增强免疫应答的其它成分通常是指，佐剂如氢氧化铝，矿物质，或其它油脂类；辅助分子如但不限于干扰素，白介素，或生长因子，其中辅助分子可被加入至疫苗，或通过上述添加成分分别诱导后由机体产生。
“疫苗组合物或药用组合物”，基本由一种或多种成分构成。其中，所述成分能改变所给药的生物体或存在于生物体的有机体的生理功能，如免疫功能。术语“疫苗组合物或药用组合物”，包括但不限于抗生素，抗寄生物药剂，以及通常用于达到某种其它目标的组分， 例如但不限于，可加工特性(processing trait),无菌性(sterility),稳定性,经由肠道或胃肠道途径，如口腔，鼻内，静脉内，肌肉内，皮下，皮肤内，或其它合适途径给药的可行性， 给药后的耐受性，以及缓释特性。
发明的公开
通过说明书和以权利要求表示技术方案的公开，可以解决上述的技术问题。
本发明克服了本领域的难点和偏见，即不能产生不含外源序列的马疱疹病毒。通过使用本发明的方法，可以产生用于疫苗的高质量EH病毒。蛋白gM的中间编码序列被去除，残留gM的羧基末端序列而不是氨基末端序列在一个不同的可读框中。由于编码必需蛋白UL9类似物的相邻基因(基因53)，其方向和其与编码蛋白gM的基因位置重叠，所以这就要求编码gM基因的一小部分核酸序列必须保留，以允许基因53表达，从而保留了病毒的生存能力。因此，本发明相关EHV的特征在于，编码蛋白gM的基因被去除了，而编码UL9类似物的基因表达(基因53)不受影响。术语“不受影响”不涉及UL9的某些数量或质量特性， 而只是简单地意味着基因表达不受影响，只要所述蛋白可由病毒表达并且能基本足量表达可使病毒生存。
本申请的发明人克服了现有技术中的主要难点，满足了本领域长期以来对包含重组马疱疹病毒4疫苗的迫切需求。本发明的EHV-I，EHV-4病毒可以用于有益目的，如用作疫苗。
因此，在第一个重要的具体实施方案中，本发明涉及一种马疱疹病毒(EHV)，其中编码蛋白gM的基因，及蛋白gM本身是缺失的，并且其不含异源成分。“不含异源成分”是指，外源序列，即非EHV序列，如编码IacZ或GFP的可读框，不出现在本发明所述病毒的编码序列中(称为“纯克隆(white clone)”)。因此，本发明的EHV完全由EHV序列编码。本发明的EHV不含细菌成分或编码所述细菌成分的核酸。进一步说，去除了几乎整个gM蛋白编码序列，以及其编码的所述gM蛋白。因此，优选地，本发明所述EHV其特征在于，蛋白gM 由于编码蛋白gM的基因去除而是缺失的。然而，如上所述，“编码蛋白gM基因是缺失的”也需要少量gM序列保留，以使至少重叠的基因53序列仍然存在。其它的gM序列可以被去除 (参见下文)。这可以通过分子生物技术全部完成(参见下文)，以产生重组EHV。
标记分子IacZ可用于成功去除EHV-I或4的gM基因，但是不会导致本发明病毒的成功产生(参见实施例1，2)。发明人由此发明了一种获得所述病毒的创造性方法。通过插入含有GFP标记分子的可读框，使gM基因去除，由此构建了 EH病毒。令人惊奇是，本方法很容易区分原始输入的病毒(input virus)(绿色荧光空斑)和新重组的病毒(非荧光空斑)。
优选地，EHV可以通过以下步骤获得
a)分离野生型EHV ；
b)任选与侧翼序列，构建编码EHV gM基因的质粒；
C)产生表达gM或部分gM的补足细胞系(complementing cell line)；
d)将EHV核酸与编码gM的质粒共转染至步骤b)的补足细胞系,其中质粒中gM 基因被GFP编码框插入而断开，由此，获得了携带GFP编码框插入至其gM编码序列的EH病毒；
e)去除GFP编码框；
f)筛选GFP编码框被成功去除的EHV克隆。
"lacZ"为编码β半乳糖苷酶的基因，这是本领域技术人员已知的。本发明中， “GFP”是指由生物发光水母产生的绿色荧光蛋白(GFP) (Chalfie et al.，1994)。
“补足细胞系”是指将通常不在细胞系基因组中存在的基因导入其中，并且该基因能在其中组成性表达的细胞系。有用的细胞系包括但不限于，兔肾细胞系Rkl3，细胞系 cc (Seyboldt et al.，2000)，或 Vero 细胞系(ATCC 编号 #CRL_1586)，如克隆 1008，其也在实施例I和2中公开了，以及本领域技术人员已知的任何其它细胞系。通常，补足细胞系被选择做为用于表达外源蛋白的细胞克隆。本发明的细胞系可表达病毒的缺失基因，能弥补病毒缺陷，使基因缺失的病毒能够生长。
限制性酶，DNA分子连接，PCR，转染等等，其标准的生物学使用方法，是本领域技术人员已知的(可参见例如Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork.)。
优选地，本发明EHV的特征在于，其是EHV-1。更优选地，本发明EHV-I的特征在于，缺失了 gM可读框1332个bp中的850-1100个bp。更优选地，本发明EHV-4的特征在于，缺失了 gM可读框中的900-1000个bp。同样更优选地，本发明EHV-I的特征在于，缺失 7 gM 可读框中的 960-970 个 bp (960，961，962，963，964，965，966，967，968，969 或 970 个 bp) ο最优选地，本发明EHV-I的特征在于，缺失了 gM可读框中的962个bp。
更优选地，本发明EHV-I的特征在于，除了编码gM的C末端部分的编码序列 150-200个碱基对(bp)，以及编码gM的N末端部分的编码序列150-250个bp不缺失以外，其它gM编码序列缺失。在本发明较优选的实施方案中，仅仅只保留编码gM的C末端部分的序列中93118-93267至93118-93317位的核苷酸和编码gM的N末端部分的序列中 94223-94472至94323-94472位的核苷酸，而其它gM编码序列缺失。因此，更优选地，本发明EHV-I的特征在于，缺失93268-93318至94222-94322位的核苷酸(编码gM核心部分， 核苷酸的位置根据Telford，1992计数)。在给定范围内，可以缺失任意数量的核苷酸。因此，本发明中，缺失可以从不低于第93268位核苷酸的位置开始，而不是必须从93318位核10苷酸开始。缺失可以早在94222位终止，但不晚于94322的位置。因此，本发明优选EHV-I 的特征在于，缺失对应于Telford位置(1992)的gM编码序列中的93268至94322位核苷酸。上述缺失序列的任意组合，也在本发明范围之内，例如93272至94312，93300至94300，坐坐寸寸ο
更优选地，本发明EHV-I的特征在于，除了编码gM的C末端部分的编码序列 160-190个碱基对(bp)，以及编码gM的N末端部分的编码序列190-220个bp不缺失以外， 其它gM编码序列缺失。在本发明较优选的实施方案中，仅仅只保留编码gM的C末端部分的编码序列中93118-93277至93118-93307位的核苷酸和编码gM的N末端部分的编码序列中94253-94472至94283-94472位的核苷酸，而其它gM编码序列缺失。因此，更优选地， 本发明EHV-I的特征在于，缺失93278-93308至94252-94282位的核苷酸(编码gM核心部分，根据Telford, 1992确定核苷酸序号)。
更优选地，本发明EHV-I的特征在于，除了编码gM的C末端部分的编码序列 180-190(180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190)个碱基对(bp)，以及编码 gM 的 N 末端部分的编码序列 200-210 (200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210)个 bp不缺失以外，其它gM编码序列缺失。在本发明较优选的实施方案中，仅仅保留编码gM的 C 末端部分编码序列中 93118-93297 至 93118-93307 (93297，93298，93299，93300，93301， 93302，93303，93304，93305，93306，93307)位的核苷酸和gM基因N末端部分编码序列中 94263-94472 至 94273-94472(94263，94264，94265，94266，94267，94268，94269，94270， 94271，94272，94273)位的核苷酸，而其它gM编码序列缺失。因此，更优选地，本发明EHV-I 的特征在于，缺失94298-94308至94262-94272位的核苷酸(编码gM核心部分，序列顺序号来自Telford，1992)。也就是说，在本发明中可以缺失上述核苷酸序列内部的任意核苷酸，例如核苷酸94299-94263，94299-94264，94300-94272,或它们的任意组合。
更优选地，本发明EHV-I的特征在于，除了编码gM的C末端部分的编码序列184 个碱基对(bp)，以及编码gM的N末端部分的编码序列209个bp不缺失以外，其它gM编码序列缺失。在本发明较优选的实施方案中，仅仅只保留编码gM的C末端部分编码序列中 93118-93301位的核苷酸和gM基因N末端部分编码序列中94264-94472位的核苷酸，而其它gM编码序列缺失。因此，更优选地，本发明EHV-I的特征在于，缺失94263至93302位的核苷酸(编码gM核心部分，序列顺序号来自Telford，1992)。在本发明最优选的实施方案中，缺失962个核苷酸的gM编码序列。非限制性的实施例I就是一个例子。
更优选地，EHV-I的特征在于，gM缺失且不含异源成分，同时它是基于选自 AB69(ATCC VR2581), EHV-1 Ts-突变株 ECACC V99061001, EHV-I 的 KyA, KyD, Abl, Ab4, RacH, RacLll或RacM的重组变体,不存在如GFP或IacZ等异源成分。更优选地，本发明EHV-I的特征在于，它gM缺失且不含如GFP或IacZ的异源成分，并且它是基于EHV-I的RacH的重组变异体。最优选地，本发明EHV-I的特征在于，它gM缺失且不含如GFP或IacZ的异源成分，并且它是实施例I中所公开的基于RacH的重组变异体分离株 H Δ gM-w。所述的本发明EHV-I H AgM-w,根据布达佩斯条约,作为专利保藏,保藏在应用微生物与研究中心(CAMR)和欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，索尔兹伯里，威尔特郡，SP4 OJG, UK。保藏日是2002年10月16日，初步确定名称为H-delta-gM-w，国际保藏单位ECACC/ CAMR给出的保藏号为02101663。具有所述被保藏的EHV-I的全部鉴定特性的EHV-1，也是优选的。
所有前述的EHV-1，比含有异源成分的病毒，如含有GFP的病毒，都有优越性。本发明所述的EHV-1，与那些仍包含异源成分的病毒相比，有更优越的细胞外感染性。这在图5 中可以得到例证(如4-12小时之间)。
在本发明作出之前，本领域的技术人员都没有制备出可用作疫苗的重组EHV-4病毒。EHV-I与EHV-4是同系物(homologous),并且有一定程度的交叉反应性。然而,本领域技术人员长期需要减毒的EHV-4病毒，因为EHV-I不能提供足够的抗EHV-4感染的保护。因此，优选地，本发明EHV的特征在于，它是EHV-4。更优选地，本发明EHV-4的特征在于，缺失gM可读框1332个bp中的900-1150个bp。更优选地，本发明EHV-4的特征在于，缺失 gM可读框的1000-1150个bp。也是更优选地,本发明EHV-I的特征在于,缺失gM可读框的 1110-1115 个bp(1110，1111，1112，1113，1114，1115)。最优选地，本发明 EHV-I 的特征在于， 缺失gM可读框的1110个bp。
更优选地，本发明EHV-4的特征在于，除了编码gM的C末端部分的编码序列0_50 个碱基对(bp)，以及编码gM的N末端部分的编码序列150-250个bp不缺失以外，其它gM 编码序列缺失。在本发明较优选的实施方案中，仅仅只保留编码gM的C末端部分编码序列中92681-92680至92681-92730位的核苷酸和gM基因N末端部分编码序列中93766-94033 至93866-94033位的核苷酸，而其它gM编码序列缺失。因此，更优选地，本发明EHV-4的特征在于，缺失92681-92731至93765-93865位的核苷酸(编码gM核心部分，核苷酸序号来自 Telford, 1998)。在给定范围内，可以缺失任意数量的核苷酸。因此，本发明中，缺失可以从不低于92681位置的核苷酸处开始，而不是必须从92731位开始。缺失可以早在93765位终止，但不能晚于93865位。因此，本发明优选EHV-4的特征在于，缺失对应于Telford序号(1998)的gM编码序列中的92681至93865位的核苷酸。上述缺失序列的任意组合，都在本发明范围之内，例如92672至93801, 92700至93800，等等。
更优选地，本发明EHV-4的特征在于，除了编码gM的C末端部分的编码序列10_40 个碱基对(bp)，以及编码gM的N末端部分的编码序列190-220个bp不缺失以外，其它gM 编码序列缺失。在本发明较优选的实施方案中，仅仅只保留编码gM的C末端部分编码序列中92681-92690至92681-92720位的核苷酸和gM基因N末端部分编码序列中93806-94033 至93836-94033位的核苷酸，而其它gM编码序列缺失。因此，更优选地，本发明EHV-4的特征在于，缺失92691-92721至93805-93835位的核苷酸(编码gM核心部分，序列顺序号来自 Telford,1998)。
更优选地，本发明EHV-4的特征在于，除了编码gM的C末端部分的编码序列 30-40 (30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40)个碱基对(bp)，以及编码 gM 的 N 末端部分的编码序列 200-210 (200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210)个 bp 不缺失以外， 其它gM编码序列缺失。在本发明较优选的实施方案中，仅仅只保留编码gM的C末端部分编码序列中 92681-92710 至 92681-92720 (92710，92711，92712，92713，92714，92715，92716， 92717,92718,92719,92720)位的核苷酸和gM基因N末端部分编码序列中93816-94033 至 93826-94033(93824，93825，93826，93827，93828，93829，93830，93831，93832，93833， 93834)位的核苷酸，而其它gM编码序列缺失。因此，更优选地，本发明EHV-4的特征在于，缺失92711-92721至93823-93833位的核苷酸(编码gM核心部分，序列顺序号来自Telford, 1998)。也就是说，在本发明中可以缺失在上述核苷酸序列内部的任意核苷酸，如核苷酸94299-94257,94299-94256或94300-94257，或它们的任意组合。
更优选地，本发明EHV-4的特征在于，除了编码gM的C末端部分的编码序列34个 bp,以及编码gM的N末端部分的编码序列209个bp不缺失以外，其它gM编码序列缺失。在本发明较优选的实施方案中，仅仅只保留编码gM的C末端部分编码序列中92681-92714位的核苷酸和gM基因N末端部分编码序列中93825-94033位的核苷酸，而其它gM编码序列缺失。因此，更优选地，本发明EHV-4的特征在于，缺失92715至93824位的核苷酸(编码 gM核心部分，序列顺序号来自Telford，1998)。在本发明最优选的实施方案中，缺失1110 个核苷酸的gM编码序列。非限制性的实施例2就是一个例子。
也是更优选地，本发明EHV-4的特征在于，它gM缺失且不含如GFP或IacZ的异源成分，并且它是基于EHV-4的MSV Lot 071398株的重组变异体。最优选地，本发明EHV-4 的特征在于，它gM缺失且不含如GFP或IacZ的异源成分，并且它是基于MSV Lot 071398 株，以及实施例2中公开的E4 Δ gM-4分离株。所述的本发明EHV-I H Δ gM-w,根据布达佩斯条约用作专利用途的保藏，保藏在应用微生物与研究中心(CAMR)和欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，索尔兹伯里，威尔特郡，SP4 OJG, UK0保藏日是2003年01月14日，初步确定名称为EHV-4，国际保藏单位ECACC/CAMR给出的保藏号为03011401。具有所述被保藏的 EHV-4的全部鉴定特性的EHV-4，也是优选的。
所有前述的EHV-4，比现有技术中的其它已知病毒有更加优越的特性，因为现有技术中没有获得重组EHV-4。而且，本发明所述EHV-4，与那些仍包含异源成分如GFP的病毒相比，有更优越的细胞外感染性。这在图10中可以得到例证(例如在24小时的时候)。
本发明的另一重要方面是，如上所述编码EHV的核酸。本领域技术人员通过本领域已知的标准分子生物学方法，可以容易地确定相应序列。
本领域特别存在的难点是，如何获得本发明的EHV。本申请发明人通过将分子标记基因(IacZ)导入至gM基因，而构建了 gM阴性EHV病毒。在试图缺失gM可读框时，在通过 IacZ插入产生的EHV-I和EHV-4突变体中，所有表现型为IacZ阴性的克隆，事实上其中仍含有IacZ表达框。本申请发明人由此研究出了一种获得所述病毒的创造性方法。构建了这样一种病毒，通过插入包含GFP分子标记的表达框，将病毒中的gM基因去除。惊奇地是，使用此方法可以区分原始输入病毒(绿色荧光空斑)和新重组病毒(非荧光空斑)。也就是说，本申请发明人克服了本领域的技术难题，制备了可组成性表达EHV4-gM的VeiO细胞系(基于Vero细胞克隆1008)。所述细胞系，通过将合适gM基因的转染，以及接着对表达gM的VeiO细胞进行筛选，而得到。只有所述细胞才能使本发明人重复获得EHV4gM阴性的病毒。
本发明所述gM补足Veix)细胞系，根据布达佩斯条约用作专利用途的保藏，保藏在应用微生物与研究中心(CAMR)和欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，索尔兹伯里，威尔特郡SP4 0JG,大不列颠联合王国(UK)。保藏日期是2003年01月28日，确定的初步名称为 VERO GM,国际保藏单位ECACC/CAMR给出的保藏号为03012801。具有所述被保藏的VERO GM 细胞系所有鉴定特性的细胞系，也是优选的。
优选地，获得重组EHV的方法，可以包括以下步骤
a)分离野生型EHV;13
b)任选与两侧序列，构建编码EHV gM基因质粒；
c)产生表达gM或部分gM的补足细胞系；
d)将EHV核酸与编码gM的质粒共转染至步骤b)的补足细胞系,其中该质粒中gM 基因被GFP编码框插入而断开。由此，获得了携带GFP编码框插入至其gM编码序列的EH病毒;
e)去除GFP编码框；
f)筛选GFP编码框被成功去除的EHV克隆。
所述上述细胞，是本发明一个重要的实施方案。因此，本发明涉及用于本发明方法中的细胞系，其特征在于，编码蛋白gM基因被转染至所述细胞系，且所述细胞系表达gM。优选地，本发明涉及本发明细胞系的特征在于，它是选自VeiO细胞(Vero-gM细胞)，RK-13， 以及cc(cc-gM)组成的组。
如上述对EHV-I的公开，EHV-4中也使用分子标记IacZ代替GFP，没有成功产生本发明的病毒(参见非限制性的实施例2)。总的来说，VeiO细胞与Rkl3细胞相比，其“LacZ 阳性”细胞，染色强度较低，因此更难鉴定。而且，EHV-4与EHV-I相比，其系统复制较慢， 因此在空斑的鉴定与活病毒子代的分离之间，留下了较少时间。因此，使用GFP是获得所述 EHV-4病毒的唯一方法。用上述EHV-I中描述的方法进行操作，惊奇地是，通过确定荧光空斑，也成功鉴定出了 EHV-4gM缺失病毒。
通过收集怀疑感染EHV疾病动物的尸体肺组织，分离组织细胞中的EHV，可以完成野生型EHV的分离，这是本领域技术人员已知的。EHV-I完全基因组序列，已经由Telford 等(1992)出版了。同样地，EHV-4完全基因组序列，也由Telford等(1998)出版了。通过使用可结合靶DNA互补链的特异性引物，对DNA序列进行PCR扩增，是分子生物学的标准方法，其中该革E DNA位于目标DNA延伸段(DNA strech of inferest)的两侧。将目标DNA序列与适合用作构建体的质粒进行连接的方法，将DNA转染至真核细胞的方法， Southern杂交分析与Western杂交分析的方法,通过限制性酶定点切除DNA片段的方法， 以及选择表达目标异源基因，含有目标基因质粒，或某些基因缺失病毒的细胞系的方法， 都是本领域的公知常识。如上所述技术的标准分子生物学方法，是本领域技术人员已知的，本领域技术人员也可以在，如Sambrook etal. (1989)Molecular Cloning 一书中找到 (A Laboratory Manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York andBertram, S. and Gassen, H. G. Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1991)。
“缺失”是指，去除一个或几个核苷酸或氨基酸。
本发明另一个重要的具体实施方案是，包含本发明EHV的药用组合物或疫苗，该药用组合物或疫苗可任选与药学上可接受的载体或赋形剂组合。
本发明又一个重要部分是，包含如上所述本发明核酸的药用组合物。
优选地，本发明疫苗是指上述定义的疫苗。术语“活疫苗”是指，包含能复制的颗粒的疫苗，特别是指可复制的活病毒成分。
优选地，本发明疫苗包含，如上所述本发明gM缺失的EHV-I，如上所述本发明gM 缺失的EHV-4,或任选的其它抗原性成分(antigenetic group),以及任选药学上可接受的载体或赋形剂。所述疫苗，可以在同一个时间点以组合疫苗形式给予。最优选地，本发明所述减毒EHV-I可以首先给予，在3-4周后，接着给予本发明减毒的EHV-4。也是最优选地， 本发明所述减毒EHV-1，可以在包含2-3次基本免疫接种的典型免疫方案中，与本发明减毒 EHV-4组合给予。这样的疫苗典型免疫方案是，间隔4周进行两次免疫(基本免疫)，接着每6个月进行定期的加强免疫。然后，如上所述的本发明任何疫苗，也可以以不同时间间隔给予，例如每三个月。
技术人员可以在两次或多次施用中，选择分开给药。施用可以间隔比较短的时间， 或者以某个其他预先确定的间隔周期进行。优选地，这样的间隔可以是，一次免疫，二次免疫是在此之后间隔大约4周，和可任选三次免疫，在此之后5-6月。疫苗可给予一次，或几次，还可以间断给予，这取决于所想要的免疫持续时间和处理效果。本发明疫苗可以在母马配种(breeding)之前给予一次,在怀孕期间再给予一次，以预防与EHV相关的流产。也可免疫其他母马，如每年一次。马驹可以在出生之后立即免疫。
本发明疫苗可以通过不同给药途径给予，特别是通过静脉注射或靶组织直接注射给予，这是本领域专业人士公知的。系统给药优选，静脉内，血管内，肌肉内，动脉内，腹膜内，口腔，或粘膜(如鼻腔或呼吸道喷射或注射)途径给药。更多的局部施用也是有效的， 如皮下，皮内，肺内，或者欲处理组织的内部或附近(关节，骨，肌肉，神经，上皮组织)。本发明疫苗组合物，也可以通过植入或口服给予。最优选地，可以通过肌肉内给药。
本领域专业人士可以使用已知可注射的、生理上可接受的无菌溶液，制备如上所述应用的合适疫苗制备物。可以容易获得等渗水溶液，如盐溶液，或相应的血浆蛋白溶液， 用于制备可立即使用的溶液，用于胃肠道注射或注输。疫苗制剂，也可以是冷冻干燥制剂或干的制备物，它可以在使用之前在无菌条件下，用已知注射溶液直接重构，例如，将其作为试剂盒的一部分。本发明疫苗制剂的最终制剂，通过将本发明纯化疫苗，与无菌的生理上可接受的溶液混合，可以用于注射，注输，或灌注，其中该无菌生理上可接受的溶液，可以用已知载体物质或/和赋形剂进行补充。在疫苗制剂中，本发明每种EH病毒的使用剂量，优选是IO4-IO8TCID5ci/每个动物，IO5-IO7TCID50/每个动物，最优选是IO6TCID5tl/每个动物。
本发明进一步涉及本发明EHV在用于预防和/或治疗EHV相关疾病的药物制备中的应用。
本发明进一步涉及预防和/或治疗动物的方法，其特征在于，将本发明药用组合物应用至所述动物，然后监测治疗效果。
优选地，本发明涉及用如上所述本发明gM缺失EHV，治疗EHV感染马科动物的方法，其中，将如上所述的该减毒EHV或疫苗组合物，以本领域技术人员已知的合适剂量，给予需要的马科动物，然后监测EHV症状，如病毒血症，和白细胞减少症，和/或咳嗽，和/或发热，和/或流鼻涕，和/或腹泻，和/或抑郁，和/或流产，是否减轻。所述治疗优选可以被重复。因此，本发明涉及预防和/或治疗动物的方法，其特征在于，将本发明药用组合物应用于所述动物，然后检测治疗效果。治疗可以以可用于疫苗组合物的如上所公开的方法进行。
优选地，本发明涉及针对感染性EHV-1，EHV-4特异性结构的抗体的检测方法， 以及涉及通过免疫方法，区分野生型感染与如上所述gM缺失EHV-I或EHV-4存在的方法。免疫方法是本领域专业人士已知的，包括但不限于，ELISAs (酶联免疫分析)或 Sandwich-ELISAs，原位印记，免疫印记，放射免疫分析(放射免疫分析RIA)，基于扩散的15Ouchterlony试验,快速免疫突光分析,或Western杂交。免疫方法的实例,例如在下列文献中有记载An Introduction toRadioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers,Amsterdam. The Netherlands(1986);Bullock etal. , Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, FL Vol. 1(1982),Vol.2(1983), Vol.3 (1985);Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985)。在适合 ELISA 分析的塑料表面上，所述 ELISA可以使用但不限于，固定化的gM基因产物，gM基因产物的一部分，或者I型或4型病毒的其他任何基因产物。
本发明ELISA，包括但不限于如下步骤
a)将gM基因产物或gM基因产物片段固定在塑料支持物上；
b)用合适的洗涤缓冲液(如PBS-Tween)洗涤支持物表面；
c)将样品加入至选定孔中，用标准方法温育ELISA板；
d)洗涤ELISA板孔，然后加入与酶，如HRP (辣根过氧化物酶)偶联的合适抗体
通过加入合适的底物，接着对单孔光密度进行光度计读数，来对结合型抗体/HRP 的偶联物进行检测。合适的抗体，如兔抗马免疫球蛋白，是本领域公知的。
下列实施例用于进一步解释本发明，但是与此同时，它不应解释为是对本发明范围的限制。实施例
实施例I :gM缺失的EHV-I分离株
通过插入大肠杆菌IacZ表达框(HAgM-IacZ)或者绿色荧光蛋白(GFP)表达框 (HAgM-GFP)，取代74. 5%gM基因序列，可以构建gM阴性的EHV-1。表达标记蛋白，有利于鉴定和后续纯化重组蛋白。为了避免疫苗病毒中出现任何“非EHV-1”序列，我们决定去除标记基因序列，构建另一 gM阴性的EHV-I,即第二代gM阴性的EHV-1，“纯”(”white”) H Δ gM (H Δ gM-w)。
为此，构建了质粒pXuBaxA(图I)。首先,我们希望将pXuBaxA序列与IacZ标记病毒ΗΛ gM-lacZ重组。第一步，优化磷酸钙法介导的DNA转染，以使在铺满100-1000PFU转染上清液之后，可以得到多个白斑。接着，选择几个白斑，用于对子代病毒进行纯化，对单斑进行4-5轮分尚。
多个独立分离的IacZ表型阴性病毒群，用Southern杂交进行基因型分析，结果显示，其仍然携带有IacZ表达框序列。分离真正IacZ阴性病毒群的困难存在，致使大量IacZ 表型阴性病毒群纯化分析后，基因型都不是IacZ阴性，这是因为“lacZ-表达沉默”。因此， 纯化得到的许多IacZ表型阴性的病毒群，分析后其基因型并不是阴性。因此，构建“纯”gM 阴性RacH病毒的策略，需要通过改变共转染中的gM阴性EHV-1，即使用插入GFP表达框构建的gM阴性EHV-I。使用GFP表达病毒，有助于区分原始输入病毒(绿色荧光蛋白斑)和新重组病毒(非荧光斑)，由此提高了分离表型GFP阴性斑的效率。对“原始”gM阴性RacH 的这一改变，认为不会影响预期重组病毒的基因型，因为(i)第一代HAgM病毒，除了标记不同以外，它们的基因型在遗传上是相同的，( )重组目标区的最终基因型，是由重组质粒pXuBaxA决定的。
为了构建质粒pXuBaxA(获得“纯” gM阴性EHV-1必需的构建体)，将质粒pBH3. I 在EHV-lgM1352bp可读框内的962bpApal_Hincll片段切除(图1D)。质粒ρΒΗ3· I携带有 EHV-I的、围绕gM基因的BamHI-Hindlll片段(Seyboldt等，2000)。为了防止任何截短gM 产物表达，选择Apal和Hincll限制性内切酶，以使对平头末端进行修复连接之后，剩余的 gM序列C末端(183bp)与剩余的N末端序列(208bp)不在阅读框内。
将EHV-IgM 表达细胞系 ccgM(Seyboldt 等,2000;从 Dr. N. Osterrieder 处获得)维持在补加了 5-10%胎牛血清的极限培养基中(Biochrom，经Y射线辐射过的)。将 5-10 μ g pXuBaxA 质粒(图 ID)，分别与 H Δ gM-lacZ 或 H Λ gM_GFP2 μ g DNA，通过磷酸钙介导，共转染至ccgM细胞，获得同源重组的EHV-I。
用质粒pBH3. IBamHI-HindIII片段特异性的毛地黄毒苷标记探针，对ΗΛ gM_GFP DNA进行后续分析(图2)，显示，
⑴用BamHI消化，得到2. 757bp和9. 043bp的片段；
(ii)用 Hindlll 消化，得到 10. 006bp 和 825bp 的片段；
(iii)用 Pstl 消化，得到 5. 415bp 和 4. 474bp 的片段；
使用的限制性酶(BamHl，Hindlll, Pstl)，确实切在GFP标记表达框序列内部，与各自不含GFP标记表达框的DNA相比，片段的限制性酶切图谱改变了。
GFP探针可结合i-iii中各自的第一片段，在RacH或HAgM-w DNA中没有检测到 GFP特异性序列。
在RacH DNA中，可以检测到预期的BamHI片段(11. 166bp)，Hindlll片段 (10. 199bp)，和Pstl(9.257bp)片段，它们在去除掉962bp gM序列之后，其大小相应地减少 7 (分别减少至 10. 204bp, 9. 237bp 和 8. 279bp;图 3B)。
对gM阴性病毒(H Δ gM-w或H Λ gM-GFP)和RacH病毒，进行一步法生长动力学检测，该gM阴性病毒如图I图解所述构建。在24孔板中将Rkl3细胞用感染复数(MOI)为2 的上述各种病毒感染。将上清液和感染细胞，分别在各个感染时间点(0，4，8，12，16，20，24h P. i.)收获。低速离心去除上清液中的细胞破碎物，在细胞相关感染性(cell-associated infectivity)分析之前冷冻-解冻细胞。所有病毒滴定浓度，分别用Rkl3或ccgM细胞在 24孔板中确定。结果(数据未显示)概括如下与RacH感染细胞的滴定相比，两种HAgM 病毒的细胞相关感染性都有所降低，在Rkl3细胞中降低I. 6(4h p. i.)至45(20hp. i.)倍 (细胞内感染)。与RacH滴定相比，两种HAgM病毒细胞外病毒滴定，都大大降低了 186倍 (HAgM-w)或650倍(HAgM-GFP) (12h p. i.时测定)(细胞外感染)。这也证实了 gM在 RacH病毒外释(virus egress)中起到作用。
实施例2 gM缺失的EHV-4分离株
与构建gM阴性EHV-I相类似，选择IacZ选择性标记筛选EHV-4。要分离gM阴性 EHV-4,必需构建组成性表达EHV-4gM的Vero细胞系。将Vero细胞克隆C1008 (ATCC保藏号CRL-1586)维持在极限培养基中，该培养基补加了 5-10%胎牛血清(Biochrom，进行了 Y射线辐射处理)。将I μ gpCgM4质粒(图3B)与O. I μ g pSV2neo质粒(赋予对G418的抗性;Neubauer等,1997)，通过Effectene (Qiagen)介导，转染至Vero细胞，可以得到 Vero-gM重组细胞系。细胞克隆首先进行G418抗性筛选(Calbiochem),然后再进行gM阴性EHV-4互补试验(trans-complementation)筛选。重组细胞系每隔五次传代后,在其培养基中加入G418(500y g/ml)。所有细胞周期性地，通过PCR分析支原体，通过FACS法分析牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原。筛选得到的细胞克隆命名为Vero-gM，这将在下文试验中使用。
将EHV-4DNA与pgM4 β +质粒(图3B)共转染至Vero-gM细胞。重组获得了多个 “IacZ阳性”斑，将其分离重培养。但是缺失突变EHV-4的后续纯化，与EHV-I相比，其结果是更加困难而且更慢，因为(i)Veix)细胞“lacZ-阳性”斑比Rkl3细胞，在染色强度上一般较弱，因此更难鉴定，(ii)EHV-4系统复制比EHV-I慢，因此留下了更少的时间用于阳性斑鉴定和分离子代活病毒。
所有分离的IacZ阳性斑，在第一轮纯化之后标记会消失，这就迫使我们寻找其他解决办法。因此，我们也决定用GFP-标记分子对EHV-4进行标记。第一步，构建pgM4GFP+ 质粒(图3B)，用于与EHV-4DNA重组。通过在Vero-gM细胞系上进行三轮分离单个斑，纯化所获GFP-阳性斑。选择均一 GFP-阳性的病毒群，将病毒DNA进行Southern杂交分析(图 4)。将所获的病毒DNA，E4 Δ gM-GFP (图3C)，与质粒pgM4R或pgM4w (图3B)进行共转染。 质粒pgM4R用于构建gM-修复型(gM-repaired) EHV-4,即E4RgM(图3A)。质粒pgM4w是产生gM和标记基因双阴性EHV-4，即E4 Δ gM-w的基础(图3D)。E4RgM和E4 Δ gM-w病毒群， 可以通过对GFP阴性表型病毒进行分离得到，之后在Vero或Veix)-gM细胞上进行纯化，最后进行Southern杂交分析(图4)。为了在真核细胞中表达EHV_4gM，构建了质粒pCgM4 (图 3B)。用图8所示引物和Taq聚合酶(ΜΒΙ-Fermentas)，使用PCR对EHV_4gM的全长ORF进行扩增。将所获的PCR产物,插入至pcDNA/Amp(invitrogene)载体。
对EHV-4的91. 699-94. 808的核苷酸片段(Telford等，1998)进行PCR扩增，将扩增产物插入至pGEM3Zf+ (Promega),这样就得到了质粒pgM4R (图3B;图8)。该质粒用于构建gM-修复型EHV-4，即E4RgM(图3A)。
要构建质粒pgM4 0+(图3B),需要选择多步策略,该质粒初始设计删除1352bp EHV-4gM中的lllObp。第一步，用PFU聚合酶(Stratagene)使用PCR，对DNA重组所必需的两侧翼序列，分别进行扩增。通过引物序列，引入其他克隆步骤必需的限制性位点(图 8)。将 PCR 产物插入至 pTZ18R (Pharmacia)载体，得到质粒 pgM4Dell 和 pgM4Del2(图 8)。 第二步，用Sall和BamHl消化，将3. 9kbp大肠杆菌IacZ表达框从质粒ptt264A+中释放 (Osterrieder等,1996),再将其插入至质粒pgM4Dell,得到质粒pgM4Dell β +。然后，用 PstI和SalI限制性酶，将来自pgM4Del2的EHV-4特异性序列导入至pgM4Dell β +，以使所获质粒pgM4 β +中标记基因表达框在侧翼被EHV-4特异性序列包围(图3B)。
之后，将质粒pgM4 β +用Sail和BamHI消化，再一次释放IacZ表达框，将所得的 5’ -末端用Klenow聚合酶补平，再对其进行重新连接，由此得到一构建体。将该构建体命名为pgM4w(图3B)。再考虑gM序列N末端208nt和残留C末端33nt之间的移码突变。
要产生质粒pgM4GFP+(图3B)，需要用Sall和BamHl限制性酶切位点，将IacZ表达框从pgM4 β +中去除(图3B)，替换上GFP表达框(包含CMV启动子和SV40-polyA)，该 GFP表达框是通过Asnl和Mlul消化，从载体pEGFP-Cl中(Clontech)移出的。限制性酶产生的末端，用Klenow聚合酶补齐为平头末端。
所有正确扩增的PCR产物，都用循环测序法(MWG Biotech)，将测序结果与EHV-4株NS80567 (Telford等，1998)的公开序列进行比较，而得到确认。
在Vero-gM细胞系上，对EHV-4进行重组。将质粒pgM4 β +或pgM4GFP+(图3B) 与EHV-4DNA共转染，就产生了第一代的gM-阴性EHV-4 (图3C)。将质粒pgM4w (图3B)与 gM阴性EHV-4DNA进行组合，就得到了 E4 Λ gM-w (图3D)。最后，将质粒pgM4R (图3B)与 E4 Δ gM-GFP DNA共转染至Vero细胞，就分离得到了 gM修复EHV-4，即E4RgM(图3A)。
将EHV-4, E4RgM, E4 Δ gM-w,和 E4 Δ gM-GFP 的 DNA，用 PstI, EcoRV,或 HindIII 酶切，再将所得DNA片段印记在尼龙薄膜上。将平行膜上的DNA片段用GFP特异性序列(与图2中所用序列相同)或gM3. I探针进行杂交，该gM3. I探针包含来自质粒pgM4R(图3B) 中的EHV-4特异性序列。
所获消化结果如下(图4):
⑴对E4 Δ gM-GFP DNA来说，当用PstI酶切时，GFP探针检测到了 5. 531bp大小的片段；当用EcoRV酶切时，则检测到了 8. 383bp大小的片段；当用HindIII酶切时，检测到了 4. 528bp大小的片段。当与gM3. I探针反应时，除检测到与上述相同的片段以外，还检测到了 I. 792bp大小片段(PstI)和I. 801bp大小片段(EcoRV);而使用HindIII酶切时，则还检测到了 826bp和5. 487bp大小的片段。
(ii)无论是亲本EHV-4，还是修复病毒E4RgM，或者是E4 Δ gM-w,它们都不携带任何的GFP特异性序列。
(iii)EHV-4 和 E4RgM 中检测到的 gM3. I 反应性 DNA 片段分别是 6. 806bp (Pstl)， 7. 874bp+l. 801bp(EcoRV)，4. 837bp+5. 487bp(Hindlll)。
(iv) gM和GFP双阴性病毒E4 Δ gM-w,它不与GFP序列杂交，但是却与相应的EHV-4 特异性序列(gM3. I)杂交。后一探针检测到的片段，与野生型病毒相比，缺乏IllObp大小的 gM序列，即分别是5. 696bp (Pstl) ,6. 764bp+l. 801bp (EcoRV), 3. 727bp+5. 487bp (Hindlll)。 所有这些病毒DNA在用Hindlll裂解时，还存在另一个126bp大小gM3. I探针的特异性片段(图2C)，但是这片段太小而没有在Southern杂交中显示。
E4 Δ gM-GFP和E4 Δ gM-w病毒都失去了表达gM的能力，另夕卜，E4 AgM-W还失去了标记基因序列。
a)在培养细胞上进行病毒培养
将如上详述各种突变病毒的生长特性在Vero和Vero-gM细胞上进行比较。将细胞接种在24孔板中，以1-2的MOI感染，在不同p. i.时间点确定细胞外(细胞外感染)和细胞内(细胞内感染)的病毒滴定(图5)。修复E4RgM病毒的生长特性，与EHV-4相同， 都很好，而E4 Λ gM-w和E4 Δ gM-GFP细胞外病毒滴度在非补足细胞系中令人惊奇地受到抑制。在多次试验中(两个独立试验的平均值)，细胞外感染性在24h p. i.之前根本没有检测到。即使在P. i. 30小时，也仅仅在细胞外只观察到非常低的滴定(最低稀释10-1时最大值为I. 5个空斑/ml)，尽管细胞显示出严重的细胞病变效应。然而，细胞内感染方面的差距没有达到100倍，而且在p. i. 24小时达到顶峰(EHV-4与E4 Λ gM-w相差84倍)。检测至Ij 的细胞内感染只在一个时间点有延迟(P. i. 12h相对于15h)。将上述结果一起考虑，可以惊奇地显不，EHV-4缺失gM序列，将大大影响病毒在体外的复制，但是gM表达不是复制所必需的。特别是gM缺失后，细胞外感染性病毒的数量减少了，直接感染邻近细胞的能力减弱了，这一点可以从噬菌斑大小反应出来。
b)卩遼菌斑大小
测量了EHV-4, E4RgM, E4 Δ gM-w, E4 Δ gM-GFP 感染 Vero 或 Vero-gM 细胞 150 个噬菌斑的直径，计算出噬菌斑的平均直径，以相对于野生型噬菌斑直径大小的相对百分数表示， 野生型噬菌斑设为100%。结果清楚显示，gM阴性病毒在Vero细胞中能够感染和复制，但是其噬菌斑的最大直径大大减小，不足野生型斑直径的20%(图6)。亲本或修复病毒感染，则有与野生型病毒感染类似的斑大小，这表明观察到的表型确实是由gM缺失引起的。这一点也可以通过下述事实得到进一步确证，E4 Δ gM-w和E4 Δ gM-GFP形成噬菌斑的能力，可以完全在Vero-gM细胞系上重建(数据未显示)。
c)病毒侵入试验
本试验中，将评估EHV_4gM对EHV-4细胞侵入动力学的影响。在允许病毒4°C吸附细胞的条件下，将100PFU的各种病毒，亲本EHV-4，gM修复病毒E4RgM，gM缺失突变病毒，和 E4AgM-GFP病毒(见图3)，加入至6孔板中的Vero细胞。90min后，相应地接种培养基用新鲜培养基取代，通过改变培养温度至37°C开始病毒侵入试验。在温度改变后的各种不同时间点(开始时刻=Omin),用柠檬酸盐缓冲液(pH3. O)处理细胞使细胞外感染性通过pH条件失活。用PBS代替柠檬酸盐缓冲液，相应地洗涤平行试验样品，以使在每个时间点将“吸附感染性(adsorbed infectivity) ” 与“侵入感染性(penetrated infectivity) ” 进行比较。在甲基纤维素覆盖下温育细胞4天后，计算噬菌斑数量。
d)几组试验的数据结果
图7A表示在非补足Vero细胞中繁殖的基因型和表型都是gM阴性的病毒，而图 7B表示表型上得到弥补的E4 Δ gM-w和E4 Δ gM-GFP的动力学，因为病毒生长在表达gM的 Vero-gM细胞上。
在侵入试验开始40min后，感染性的亲本EHV-4 (E4RgM)平均有52. 8% (56. 7%) 受到细胞保护而未受到细胞外酸处理失活(图7A，空心圈)，然而gM阴性病毒只有 33. 7%(Ε4 Δ gM-w-实心方块)和38. 5%(Ε4 Δ gM-GFP-实心三角)受到保护。在入侵动力学曲线晚期，不同曲线开始相互交叉，最大入侵率在入侵时间150min到达，在61. 7%_78. 9%之间。这表明，分析条件有某些变化导致了观察结果的轻微差异(图7A)。
当gM阴性病毒在补足性Vero-gM细胞上生长时，则没有观察到入侵效率差异(7B)。gM阴性EHV-I入侵动力学曲线，在Vero细胞上延迟了大约20%(RacLll 株;Osterrieder 等,1996) -40% (KyA 株;Seyboldt 等,2000)，与之相反，它在 Vero-gM 补足细胞上的入侵率则得到了保留。由此可以得到以下结论(i)gM阴性病毒在表型补足细胞和非补足细胞上的动力学曲线存在差异(图7A-B)，(ii)但是gM缺失对EHV-4入侵能力的影响实际上可以忽略。
实施例3 :用gM特异性血清试验对马血清中的抗gM抗体进行分析
要确定gM是否能用作区分野生型病毒感染和gM缺失疫苗接种的血清学标志，需要对几个设想进行验证。首先，必须验证野生病毒感染的马血清中是否含有gM特异性抗体。对这个初步验证，可以选择Western杂交试验，因为该系统可以鉴定特异性反应，该特异性反应是相对于背景反应来说的。当使用高度中和血清反应时(EHV-1和/或EHV-4中和滴定浓度在1:128-1 :256之间)，得到了如下结果(数据未显示)=EHV-IgM表达细胞系 ccgM裂解物在马血清中检测到了特异性信号，以及将血清稀释至I :3000其效果似乎更好。
然后，对所有12匹参与EHV-IgM疫苗试验的马驹血清(6匹免疫，6匹对照)进行 Western杂交gM反应性分析。在每匹马中取三种不同的血清进行试验进行免疫试验前取血清(Pre)，二次免疫后4周取血清(V2)，抗感染试验后2周取血清(C)。
Western杂交分析(图9)结果总结如下(i)马血清都显示出对EHV-I的中和活性，所有检测都是gM阳性，(ii)在已知未接触EHV-I或用gM缺失EHV-I免疫的任一分析样品中，没有检测到gM反应性，(iii)用gM阳性攻击病毒感染进行了免疫试验的马匹之后， gM可以在12匹马中的10匹清楚地检测到，(iv)抗EHV-I抗体的滴定浓度，似乎不与gM反应强度直接相关。
由于马血清有很高的背景反应，所以进行血清学试验非常困难。基于获自马血清的间接免疫荧光(HF)数据证实，要么建立一个间接的或可阻断背景反应的试验系统，要么提供高纯度的gM多肽用于ELISA试验中。为此，建立如下的ELISA法。将纯化的gM多肽或完全gM多肽固定至96孔板固相支持物上，把孔板包被，以确保俘获蛋白的良好附着。 为了有利于试验分析，将非特异性结合位点用干燥的牛奶(dry milk)或与其类似的物质封闭，以阻止非特异性的结合。接着，用合适的洗涤缓冲液(如PBS-Tween)洗涤塑料表面，以除去过多阻断剂。之后，将测试样品加入至选定板孔中，ELISA板在37°C用标准方法温育， 以使测试样品中抗体结合至固定的俘获蛋白上。再后，将ELISA板孔用洗涤缓冲液彻底清洗几次，之后，再加入合适的酶偶联的抗马抗体，如HRP (辣根过氧化物酶)偶联的抗体。最后，加入合适底物，对结合抗体/HRP偶联物进行检测，之后用光学计对每个孔的光密度进行读数。将所得数据结果与相同分析试验中使用的阳性、阴性对照进行比较。
实施例4 EHV-4gM的鉴定
尽管EHV_4gM的预测氨基酸序列与EHV-lgM有86. 7%的一致性(Telford 等，1998),但是特别地，抗 EHV-IgM 的抗体 Mab 13B2 (Allen 和 Yeargan, 1987)在 Western 杂交中只与型特异性蛋白(type-specific protein)反应(Crabb等，1991)。然而，为了鉴定本研究中EHV-4的同源物是否可与EHV-I抗体反应，使用其他抗EHV-IgM抗体Seyboldt 等，2000;Day, 1999)对纯化的EHV-4病毒粒子，EHV-4感染的细胞裂解物，Vero-gM细胞裂解物，进行了检测。Vero-gM细胞是重组的细胞系，可以在IE-HCMV启动子调控下合成 EHV-4gM。所有抗EHV-IgM单克隆抗体与EHV_4gM的反应性，都在Western杂交检测限度以下，而平行EHV-I样品则总可以迅速反应(数据未显示)。只有在兔中产生的抗His-标记EHV-IgM衍生多肽(氨基酸376-450; Seyboldt等，2000)的多克隆抗血清与异源gM有足够强的反应，使其可用于鉴定EHV-4gM(图10A)。使用该抗体，在纯化的EHV-4病毒粒子中观察到大约50，000-55，000分子量处有特异性反应。根据预测的gM蛋白具有疏水性，所以检测到的gM蛋白在煮沸后将会凝集。与上述特异性反应相反的是,重组Vero-gM细胞中表达的gM形式，其分子量主要在大约46，000-48, 000之间，这些结果表明，EHV-4的gM蛋白的加工与EHV-I所显示的有某些相似性，这一点已经在上文中作出了说明(Osterrieder 等,1997;Rudolph 和 Osterrieder, 2002)。
做了几个试验用于分析gM缺失EHV-4表型。为了比较其他糖蛋白的表达情况，将 Vero细胞用EHV-4，E4RgM, E4 Δ gM-w,或E4 Λ gM-GFP感染，其裂解物进行Western杂交分析。结果显示，缺失gM并不影响晚期蛋白gB或gD的产生，这表明病毒复制的早期步骤基本上不受缺失的影响。21
在另一试验中，对野生型，修复型，gM缺失型EHV-4病毒粒子制备物进行分析显示，在gM阴性病毒中根本检测不到gM反应性，而在对照病毒粒子中则蛋白可容易地进行反应。用对照的抗gB杂交探针显示，各种制备物中病毒粒子确实存在(图10B)。
参考文献
Allen, G. P.，Yearganj Μ.，Costa, L. R. R. and Cross, R.，1995. Major histocompatibility complex class I-restricted cytotoxic T-Iymphocyte responses in horses infected with equine herpesvirusl. J. Virol. 69, 606-612.
Alien，G. P. and Yearganj M. R. , 1987. Use of Agtll and monoclonal antibodies to map the genes for the six majorglycoproteins of equineherpesvirusl. J. Virol. 61, 2454-2461.
Awan，A. R.，Chong，Y.-C. and Field, H. J. , 1990. The pathogenesis of equine herpesvirus type I in the mouse:A new model for studying host responses to the infection. J. Gen. Virol. 71，1131-1140.
Baines, J. D. and Roizmanj B. , 1991. The open reading frames UL3, UL4, UL 10 and UL 16 are dispensable vor the replication of herpes simplex virus I in cell culture. J.
Virol. 65, 938-944.
Baines, J. D. and Roizmanj B. , 1993. The UL IOgene of herpes simplex virus I encodes a novel viral glycoprotein, gM, which is present in the virion and in the plasma membrane of infected cells. J. Virol. 67, 1441-1452.
Chalfie M，Tu Y,Euskirchen G,Ward WW,Prasher DC,1994. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science 263，802-805.
Crabbj B. S. ; Alien，G. P.，Studdertj M. J.，1991. Characterization of the majorglycoproteins of equine herpesviruses 4 and I and asinine herpesvirus 3using monoclonal antibodies. J. Gen. Virol. 72，2075-82.
Day,L. 1999. Characterization of selectedglycoproteins of equine herpesvirus-1: immune responses in the murine model. Ph. D. thesis. University of Leeds, Leeds, United Kingdom.
Flowers, C. C. and Oi Callaghan, D. J. , 1992. The equine herpesvirus typel (EHV-1) homo I og of herpes simplex virus type I US9 and the nature of a major deletion wethin the unique short segment of the EHV-1 KyA strain genome. Virologyl90, 307-315.
Hubert, P. H.，Birkenmaier, S.，Rzihaj H. J. and Osterrieder, N.，1996. Alterations in th eequine herpesvirustype-1 (EHV-1)strain RacH during attenuation. J. Vet. Med. B43，1-14.
Kyhse-Andersenj J. , 1984.Electroblotting of multiple gels : a simple apparatus without tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose. J. Biochem.
Biophys. MethodslOj 203—210.
Laemmlij U. K. , 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature227, 680-685.
MacLeanj C. A.，Robertson, L. M. andjamieson，F. E.，1993. Characterization of the ULlO gene product of herpes simplex virus type I and investigation of ist role in vivo. J. Gen. Virol. 74，975-983.
Malik, A. K.，Martinez, R.，Muncy, L，Carmichael, E. P. and Weller, S. K.，1992. Geneti°C analysis of the herpes simplex virus type I UL9gene:isolation of a LacZ insertion mutant and expression in eukaryoti°C cells. Virology190 (2),702-715.
Mayrj A.，Pettej J.，Petzoldtj K. and Wagenerj K.，1968. Untersuchungen zur Entwicklung eines Lebendimpfstoffes gegen die Rhinopneumonitis(Stutenabort)der Pferde. J. Vet. Med. B15，406-418.
Neubauer，A .，Beer, M.，Brandmuller，C .，Kaaden，0 . - R. and Osterriederj N. , 1997. Equineherpesvirus I mutantsdevoid of glycoprotein B or Mare apathogeni°C for mice but induce protection against challenge infection. Virology 239，36-45.
Osterrieder, N.，Wagner, R.，BrandmulIerj C.，Schmidt, P.，Wolf, H. and Kaadenj 0. -R. , 1995.Protection against EHV-Ichallenge infection in the murine model after vaccination with various formulations of recombinant glycoproteingpl4(gB) · Virology208,500—510.
Osterrieder，N.，Neubauerj A.，BrandmulIer，C.，Braun, B.，Kaadenj 0. -R. and Baines,J.D.,1996.The equine herpesvirus I glycoproteingp21/22a,the herpes simplex virus type I gM homolog, is involved in virus penetration and cell-to-cell spread of virions. Journal of virology,Junel996, p. 4110-4115.
Osterrieder，N. ; Neubauer, A . ; F a k I e r , B . ;Brandmuller， C. ; Seyboldtj C. ; Kaadenj 0. R. ;Baines, J. D. , 1997. Synthesis and processing of the equine herpesvirus I glykoprotein M. Virology232, 230-239.
Pilling, A.，Davison, A. J.，Telford, E. A. R. and Meredith, D. M.，1994. The equine herpesvirus type I glycoprotein homologous to herpes simplex virus type I glycoprotein M is a major constituent of the virus particle. J. Gen. Virol. 75, 439-442.
Rudolph, J. ; Seyboldtj C. ; Granzow, H. ; Osterriederj N.，2002. The gene 10(UL49. 5)product of equine herpesvirus I is necessary and sufficient for functional processing of glycoproteinM. J. Virology76, 2952-2963.
Sambrookj J.，Fritschj D. F. and Maniatisj T.，1989. Molecular Cloning:A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Seyboldtj C. , 2000. Structuraland functional analysis of the equine herpesvirus type I glycoprotein M. Doctoral thesis, Ludwig-Maximilians-Universit y, Munich, Germany.
Seyboldtj C. ; Granzow, H. ; Osterriederj N. 2000. Equine herpesvirusl (EHV-1) Glycoprotein M:Ef f ect of deletions of transmembrane domains. Virology278, 477-489.
Stokes, A.，Alberj D. G.，Greensillj J.，Amellalj B.，Carvalho, R.，Taylor, L. A.，Doelj T. R.，Telford, E. A. R.，Watson, M. S.，McBride, K. and Davison, A. J.，1992. The DNA sequence of equine herpesvirus-1. Virologyl89,304-316.
Telford, E. A. R.，Watson, M. S.，Perry, J.，Cullinanej A. A. and Davison, A. J.，1998. The DNA sequence of equine herpesvirus-4. Journal of Gen. Virol. 79，1197-1203.
Tewarij D.，Whalley, J. M.，Love, D. N. and Field, H. J.，1994. Characterisation of immune responses tobaculovirus expressed equine herpesvirus type I glycoproteins D and H in a murine model. J. Gen. Virol. 75，1735-1741.
应用微生物与研究中心
和
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该文件证明H-Λ-gM-w，保藏号为02101663，根据1977年的布达佩斯条约，作为专利保藏，已保藏在应用微生物与研究中心(CAMR)和欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，保藏日是2002年10月16日。
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BINGER STRASSE 173单位根据细则10. 2出具
INGELHEIM
D-55216
GERMANY
权利要求
1.一种蛋白gM缺失的马疱疹病毒(EHV)，其特征在于所述EHV不含异源成分。
2.编码权利要求I的EHV的核酸。
3.包含权利要求I的EHV的疫苗制品。
4.包含权利要求2的核酸的疫苗制品。
5.权利要求I的EHV在制备预防和/或治疗EHV相关疾病药物中的应用。
6.权利要求2的核酸在制备预防和/或治疗EHV相关疾病药物中的应用。
7.一种预防和/或治疗动物的方法，其特征在于对所述动物施用权利要求3或4的疫苗制品，且监测其治疗效果。
8.获得重组EHV的方法，包括以下步骤 a)分离野生型EHV； b)任选与侧翼序列，构建编码EHVgM基因的质粒； c)构建表达gM或部分gM的补足细胞系； d)在编码gM的质粒中插入GFP编码框，将该编码gM的质粒与EHV核酸共转染至步骤b)构建的补足细胞系中，以获得含有GFP编码框插入至其gM编码序列的病毒； e)除去GFP编码框；和 f)筛选GFP编码框被成功去除的EHV克隆。
9.权利要求8方法中使用的细胞系，其特征在于所述细胞系中转入了蛋白gM编码基因，并且所述细胞系表达蛋白gM。
全文摘要
本发明涉及不含异源成分的gM-阴性EHV突变体。本发明涉及动物健康领域，特别是涉及编码gM蛋白的基因缺失且不含异源成分的马疱疹病毒(EHV)。本发明进一步涉及包含所说病毒的药用组合物及其应用，以及预防和治疗EHV感染的方法。本发明也涉及包含EHV-1和EHV-4病毒的药用组合物，其中编码gM蛋白的基因缺失，并且不含有异源成分。
文档编号C12N5/06GK102978168SQ201210272159
公开日2013年3月20日 申请日期2003年7月16日 优先权日2002年7月19日
发明者安东尼.纽鲍尔, 克里斯蒂娜.齐格勒 申请人:贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司