专利名称：一种重组人表皮生长因子工程菌的构建和筛选方法
一种重组人表皮生长因子工程菌的构建和筛选方法技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种高效胞内可溶表达重组人表皮生长因子 (以下简称为h EGF)工程菌的构建和筛选方法。
背景技术：
人表皮生长因子(Human epidermal growth factor, hEGF)是含有53个氨基酸残基的单链多肽，分子量为6216道尔顿；hEGF序列包含6个半胱氨酸残基,可以形成三对分子内二硫键，这些二硫键稳定了 hEGF的构象，对其发挥生物学功能起到了重要作用。
在体内，hEGF诱导上皮发展，促进血管生成，抑制胃酸分泌。在体外，hEGF是成纤维细胞，上皮细胞和内皮细胞的促细胞分裂剂，可以促进表皮细胞的集落形成。目前，hEGF 在医疗和化妆品行业具有广泛的应用。
hEGF广泛存在于人的体液中，早期主要从尿液中提取(Starkey，R. H. et al.， Science, 189，800-802，1975)，由于hEGF在体液中的含量很小，直接提取成本很高，目前主要通过基因工程菌表达纯化，常用的方法包括分泌表达和胞内表达。hEGF的分泌表达， 虽然表达量较高，但是hEGF的同质性和完整性受到影响，使得下游的纯化步骤复杂化。而在胞内表达时，现有做法是把hEGF基因以质粒的形式引入大肠杆菌胞内，但在发酵条件下，菌株的质粒丢失现象较为明显，严重影响了 hEGF的得率(Wong, DK-H et al. , J. Ind. Microbiol. Biot.，21，31-36，1998)。如果能把hEGF基因直接引入大肠杆菌的基因组，那么它的丢失几率会大大降低，但在此之前没有这方面的报道。
此外，在胞内表达hEGF时，由于大肠杆菌的胞内为还原性环境，不利于hEGF分子内三对二硫键的形成，所得的hEGF均以包涵体的形式存在，为了获得有活性的hEGF，需要经历一个复杂的变复性过程，影响hEGF的产率。
有研究表明，利用Origami (DE3)宿主菌和SUMO标签表达融合蛋白可解决原蛋白可溶率低的问题(Su, Z.et al.，Protein Pept. Lett.，13，785-792，2006)。在此之前没有把SUMO标签应用到hEGF表达上的报道。发明内容
本发明的目的是为了解决现有重组表皮生长因子胞内表达可溶率低和发酵培养中的质粒丢失问题，提供一种高效、稳定、高可溶性表达hEGF工程菌的构建和筛选方法。
本发明的hEGF工程菌构建过程如下
一、通过PCR技术获得包含卡那霉素抗性基因，通过化学合成方法获得大肠杆菌 cspA基因功能元件；
二、对编码SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，获得适合在大肠杆菌中大量表达的序列0PT-SUM0-hEGF ；
三、将第一步和第二步所得的片段连入pET21质粒中，得到pET-Kan-cspA-SE质粒;
四、以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板，构建转座体；
五、将转座体转入大肠杆菌Origami 2 (DE3)；
六、筛选出高表达SUMO-hEGF的菌株；
其中步骤二中根据大肠杆菌偏爱密码子设计的大量表达重组hEGF的优化序列 OPT-SUMO-hEGF 如序列表中 SEQ ID NO 3 所示。
本发明的重组hEGF工程菌同已有文献报道的重组hEGF工程菌相比，具有以下优点(1)本发明采用转座反应，将编码hEGF的基因整合于大肠杆菌的基因组中，由于没有使用质粒，从根源上避免了发酵条件中由于质粒丢失而导致的产量下降的问题，极大的提高了工程菌的稳定性；(2)本发明采用大肠杆菌抗冻基因cspA的功能元件，低温诱导表达 hEGF,显著的提高了 hEGF表达的可溶率；此外，低温诱导有利于保证hEGF的同质性，从一定程度上简化了后续的纯化操作。综上所述，按本发明所述方法得到的菌株基因组稳定、表达的人表皮生长因子可溶率高，适合大规模工业化生产。
图I为cspA基因功能元件排列顺序图
图2为pET-kan-cspA-SE质粒物理图谱
图3为高可溶表达菌株SE-26摇瓶培养后表达SUMO-hEGF的结果。图中I道为诱导前的样品，2道为低温诱导48小时后的全菌蛋白，3道为低温诱导48小时后超声破碎菌体并离心后的上清。
具体实施方式
本发明的重组hEGF工程菌构建具体过程如下
I.包含卡那霉素抗性基因和cspA基因功能兀件的构建
I. I卡那霉素抗性基因片段的获得
I. I. I设计引物，序列如下
引物Kan-lj' -ggcaaattagatctcttttctacggggtctgacg-31 (SEQID NO I)
引物Kan-〗』' -aatttgcccatatgcgatttcggcctattggtta-31 (SEQID NO :2)
I. I. 2PCR反应获得卡那霉素抗性基因片段
PCR反应使用的DNA聚合酶Vent购自NEB公司，pET42a质粒购自默克密理博公司，PCR反应体系如下
成分ThermoPoI缓冲液dNTP混合物引物Kan_1引物Kan-2Vent DNA聚合酶 pET42a质粒PCR反应的条件为变性94°C，30秒；退火56°C，30秒；延伸72°C，I分20秒； 循环数30
I. 2cspA基因功能兀件的犾得
cspA基因功能元件的序列如序列表中SEQ ID NO :3所示。各功能元件的排列顺序如图I所示。该序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。
2.编码SUMO-hEGF基因片段的获得
对编码酵母SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，获得了适合在大肠杆菌中大量表达的序列OPT-SUMO-hEGF如序列表中SEQ ID N0:4所示。该序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。
系如下
3. pET-Kan-cspA-SE 质粒的获得 3. IpET-Kan质粒的获得 3. I. 1ρΕΤ21质粒的双酶切PET21质粒购自默克密理博公司，Bgl II和Nde I内切酶购自NEB公司，双酶切体
成分pET21质粒 10XNEB Buffer 3 Bgl Il Nde I用量 10μ 5μH2O
37°C酶切3小时。2μ 31 μ6
权利要求
1.一种重组人表皮生长因子(hEGF)工程菌的构建和筛选方法，其特征在于重组hEGF工程菌的构建和筛选方法按以下步骤进行一、通过PCR技术获得卡那霉素抗性基因，通过化学合成方式获得大肠杆菌cspA基因功能元件；二、对编码SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，然后进行化学合成获得适合在大肠杆菌中大量表达的序列OPT-SUMO-hEGF ;三、将第一步和第二步所得的片段连入pET21质粒中，得到pET-Kan-cspA-SE质粒；四、以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板,构建转座体；五、将转座体转入大肠杆菌Origami 2 (DE3);六、筛选出融合蛋白SUM0_hEGF表达量高的菌株。
2.根据权利要求I所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于在适合的PCR反应条件下，获得卡那霉素抗性基因。
3.根据权利要求2所述的利用PCR方法获得卡那霉素抗性基因所用的初始质粒为pET42a0
4.根据权利要求2所述的利用PCR方法获得卡那霉素抗性基因所用的引物序列如下 引物 Kan-1 :5' -ggcaaattagatctcttttctacggggtctgacg-3! (SEQID NO 1)引物 Kan_2 :5' -aatttgcccatatgcgatttcggcctattggtta-3! (SEQID NO 2)
5.根据权利要求I所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于cspA基因功能元件的序列为ggcaaattca tatgaaggaa tggtgtggcc gattaatcat aaatatgaaaaataattgtt gcatcacccg ccaatgcgtg gcttaatgca catcaaattgtgagcggata acaatttgat gtgctagcgc atatccagtg tagtaaggcaagtcccttca agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattcctttaacgcttcaaa atctgtaaag cacgccatat cgccgaaagg cacacttaattattaagagg taatacacca tgaatcacaa aRtRRRatcc aagctttaRRtaatctctgc ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcggggatttttttat ttgttttcag gaaataaata atcgatcgcg taataaaatctattattatt tttgtgaaga ataaatttgg gtgcaatgag aatgcgcaggccctttcgtc tcRCRCctcR aRRcagtctο
6.根据权利要求I所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于选用PET21为初始质粒来构建pET-Kan-cspA-SE质粒。
7.根据权利要求6所述的选用pET21为初始质粒构建pET-Kan-cspA-SE质粒，该结构构建需要以下步骤通过双酶切和连接，把卡那霉素抗性基因片段插入PET21质粒构建ρΕΤ-Kan质粒；通过双酶切和连接，把cspA基因片段插入ρΕΤ-Kan质粒构建pET-Kan-cspA质粒；通过两步酶切和连接，把OPT-SUMO-hEGF序列插入pET-Kan_cspA质粒构建ρΕΤ-Kan-cspA-SE 质粒。
8.根据权利要求7所述的构建pET-Kan-cspA-SE质粒的步骤中，根据大肠杆菌偏爱密码子设计的表达高的重组hEGF的优化序列OPT-SUMO-hEGF为RRcaaattRR atccatRcac caccaccacc accacggtat gtctgactctgaagttaacc aggaagcgaa accggaagtt aaaccggaag ttaaaccggaaacccacatc aacctgaaag tttctgacgg ttcttctgaa atcttcttcaaaatcaaaaa aaccaccccg ctgcgtcgtc tgatggaagc gttcgcgaaacgtcagggta aagaaatgga ctctctgcgt ttcctgtacg acggtatccgtatccaggcg gaccagaccc cggaagacct ggacatggaa gacaacgacatcatcgaagc gcaccgtgaa cagatcggtg gtaactctga ctctgaatgcccgctgtctc acgacggtta ctgcctgcac gacggtgttt gcatgtacatcgaagcgctg gacaaatacg cgtgcaactg cgttgttggt tacatcggtgaacgttgcca gtaccgtgac ctgaaatggt gggaactgcg ttaaaagcttgcagtcttο
9.根据权利要求I所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板，合成ME-Kan-cspA-SE片段，然后将ME-Kan-cspA-SE片段和转座酶混合构建转座体。
10.根据权利要求9所述的构建转座体步骤，其特征在于在适合的PCR反应条件下，合成 ME_Kan_cspA_SE 片段。
11.根据权利要求10所述的利用PCR方法合成ME-Kan-cspA-SE片段所用的引物序列如下引物 M_l:5' -ctgtctcttatacacatctcttttctacggggtctgacg-3' (SEQ ID NO :5)引物 M_2:5' -ctgtctcttatacacatctcaggccctttcgtctcgcgc-3' (SEQ ID NO :6)。
12.根据权利要求I所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于转化获得高表达SUMO-hEGF大肠杆菌的方法如下将转座体同Origami 2 (DE3)感受态细胞混合，先进行冰水浴，然后热激，再加入适量LB培养基短暂培养，涂布平板，筛选抗卡那霉素的克隆。
13.根据权利要求I所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于筛选高表达SUMO-hEGF大肠杆菌的方法如下挑取具有卡那霉素抗性的克隆，在含有卡那霉素的培养基中培养，然后将培养温度降低，并加入诱导剂进行诱导表达。分时段提取诱导表达的菌液，离心收集菌体，超声破碎后检测SUMO-hEGF的表达结果，表达量高的菌株即可用做生产用菌株。
全文摘要
本发明提供了一种重组人表皮生长因子(hEGF)工程菌的构建和筛选方法。主要步骤为一、由PCR技术获得卡那霉素抗性基因，由化学合成方式获得大肠杆菌cspA基因功能元件；二、对编码SUMO蛋白和hEGF的基因序列，分别进行优化，然后由化学合成获得大量表达的融合蛋白基因序列OPT-SUMO-hEGF；三、将前两步所得片段连入pET21质粒，得到pET-Kan-cspA-SE质粒；四、以上述质粒为模板，构建转座体；五、将转座体转入大肠杆菌Origami 2(DE3)；六、筛选出融合蛋白SUMO-hEGF表达量高的菌株。本发明得到的菌株基因组稳定，表达的hEGF可溶率高，适合大规模工业化生产。
文档编号C12N15/70GK102978231SQ20121027221
公开日2013年3月20日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者郑春阳, 王磊, 王巍, 徐彬 申请人:天津强微特生物科技有限公司