以纤维素为碳源发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯的方法
【专利摘要】本发明涉及微生物发酵【技术领域】，具体涉及一种以纤维素为碳源发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯（PHAMCL）的方法，其主要技术特征为：构建了一株包含聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phaC1的大肠杆菌重组工程菌，在含有纤维素的培养基中发酵，得到中长链聚羟基脂肪酸酯。本发明进一步涉及一种生物燃料中长链羟基脂肪酸甲酯（3HAME）的制备方法，由中长链聚羟基脂肪酸酯在水解酶催化下醇解获得。该方法原料纤维素价格低廉，PHAMCL表达量可达7.8g/L以上，3HAME燃烧热达35.5MJ/kg，可以替代石油资源，具有良好的应用前景。
【专利说明】以纤维素为碳源发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯的方法
[0001]【技术领域】:
本发明涉及微生物发酵【技术领域】，具体地本发明涉及以纤维素为碳源发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯的方法。
[0002]【背景技术】:
聚羟基脂肪酸酯(PHA, polyhydroxyalkanoates),是近20多年迅速发展的生物高分子材料，是微生物合成的一种细胞内聚酯。具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的热加工性能，可作为生物医用材料和生物可降解包装材料。PHA还具有非线性光学性、压电性、气体相隔性等高附加值性能。研究发现，PHA可以作为生物燃料的原料，是一种比较理想的石油替代品。PHA可分为短链PHA和中长链PHA。短链PHA (PHAsa),含C4-C5单体，以PHB(聚三羟基丁酸酯，Poly-3-hydroxybutyrate)为代表,硬度高可塑性低。含6_14个碳原子的中等链长的PHA (PHAmcl)是结晶度很低的弹性体，在药物释放及组织工程等方面具有很广阔的应用前景。
[0003]目前聚羟基脂肪酸酯的生产主要是以发酵法为主，但普遍存在成本高或产率低的问题。利用工业废水和城市废水中丰富的有机物做碳源生产PHA可降低原料费用，但是产率太低。以葡萄糖为原料制备PHB，原料成本较高，工业生产仍受限制，目前，市场上PHB价格大约为20美元/千克，为普通石化塑料的10倍，因此，PHB还无法与石化塑料相竞争。
[0004]假单胞菌在各种研究过的微生物中合成PHAm能力最强，可以利用多种相关碳源和非相关碳源大量合成和积累的PHA，常用的底物有丙烯酸、葵酸及相应的盐、葡萄糖、淀粉、生活污水等。目前认为细菌PHA合成酶分为3类，第I类以R.eutropha为代表的PHAm合成酶phaC ;第2类以P.0leovorpha和P.aeruginosa为代表的ΡΗΑΜα的合成酶phaCl和phaC2 ;第 3 类以 Chromatium vinosum和 Tiio-capsia vioiacae 为代表的 PHA合成酶phaC和phaE。以门多萨假单胞菌合成酶基因ph`aCl，利用大肠杆菌表达载体构建基因工程菌，以添加辛酸的LB培养基发酵，制备中长链聚羟基脂肪酸酯，产物由3-羟基己酸和3-羟基辛酸两种单体组成，但是产量还较低。将phaCl基因构建到大肠杆菌JMU193染色体上，获得高产稳定表达菌株；对宿主细胞进一步改造，双敲除fadR和fadB/fadA，得到ΡΗΑΜα含量可达细胞干重的30% ;近期研究表明，在大肠杆菌中共表达paaG、paaF和ydbU，可提高产物量至0.37 g/L、0.25 g/L、0.33 g/L，带有fadB基因的WBlOl菌株，以癸酸钠为碳源，表达外源phaC2基因，可得到两倍量ΡΗΑΜα。
[0005]纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，是植物细胞壁的主要成分，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。纤维素作为一种廉价碳源，是世界上最丰富的可再生自然资源，我国每年仅作物秸杆的纤维产量就可达2亿吨以上。已有利用纤维素制备生物乙醇、丁醇等生物燃料的应用。目前还未见以纤维素为碳源发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯的报道。
[0006]当脂肪酸碳链长度为12-18C时，其甲酯就是生物柴油的基本成分。中长链羟基脂肪酸甲酯(3ΗΑΜΕ)是一种新型的生物燃料，对其研究和开发刚刚开始，有人利用酸催化的水解方法，把PHB和MCL PHA分别转化为3-羟基丁酸甲酯(3ΗΒΜ)和中长链羟基脂肪酸甲酯(MCL HAM)，燃烧热值分别为19.43KJ/kg、36.5KJ/kg (罗容聪，汕头大学硕士论文，2008)。但是利用水解酶和氢氧化钾催化醇解的研究还未见报道。
[0007]
【发明内容】
: 针对目前ΡΗΑΜα发酵制备成本高、收率低的问题，本发明提供一种以廉价纤维素为碳源发酵生产中长链聚羟基脂肪酸酯的方法。
[0008]本发明的另一个目的是提供利用中长链聚羟基脂肪酸酯制备生物燃料中长链羟基脂肪酸甲酯(3ΗΑΜΕ)的方法。
[0009]为实现上述目的，本发明采用的技术解决方案如下:
1、中长链聚羟基脂肪酸酯PHAm发酵制备:
(I)构建包含聚羟基脂肪酸酯合成酶基因PhaCl的重组工程菌；phaCl基因来源于油田土壤分离出的铜绿假单胞菌，重组工程菌为大肠杆菌重组工程菌。
[0010](2)—定发酵条件下，重组工程菌在以纤维素为碳源的培养基中发酵；培养基中纤维素质量百分含量为0.1~10.0%，优选百分含量0.5~3.0%，发酵温度30~37°C，采用分批培养的方式。
[0011](3)发酵产物过滤菌体后，用溶剂I萃取，除去溶剂I后，再用溶剂2重结晶，得到产物ΡΗΑΜα。溶剂I选自二氯甲烷、四氯化碳、乙醚，溶剂2选自甲醇、乙醇、乙二醇。
[0012]2、由中长链聚羟基脂肪酸酯(ΡΗΑΜα)制备生物燃料中长链羟基脂肪酸甲酯(3ΗΑΜΕ):中长链聚羟基脂肪酸酯(PHAm)在催化剂作用下，在醇类溶剂与水的混合溶剂中反应10~30h。催化剂为分解酶IP0-701、或氢氧化钾。醇类溶剂为甲醇、或乙醇、或乙二醇。
[0013]本发明所提供的以纤维素为碳源，含PHAm合成酶基因phaCl的大肠杆菌重组工程菌发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯，与现有技术相比，具有如下优点:本发明以廉价纤维素为碳源，大大降低了 PHAsn的生产成本，使ΡΗΑΜα的大规模工业化生产成为可能。本发明产物收率高，优选条件下，纤维素转化率97%，产物表达量7.5g/L，醇解率98%，中长链羟基脂肪酸甲酯(3HAME)含量98.5%，燃烧热35.5MJ/kg。
[0014]【具体实施方式】:
下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例，而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。
[0015]实施例1 质粒及菌株:
克隆载体pBluescript SK_,大肠杆菌E.Coli JMlO 9购自商业公司；
限制性内切酶，Taq酶，T4 DNA连接酶均购自大连宝生物公司。其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。
[0016]培养基:
PHA合成菌分离培养基:蒸懼水1000mL,牛肉膏IOg,蛋白胨10g,NaCl 5g,葡萄糖20g,琼粉 15g，ΡΗ7.0，0.IMPa 灭菌 15min。冷却至 45°C~50°C，加入尼尔红(Nile Red) 2mL/L(0.25mg Nile Red溶于IOOmL 二甲基亚砜),无菌条件下倒入培养皿,冷却后备用；
磷酸盐缓冲溶液:蒸馏水 1000mL, Na2HPO4.Iffi2O 8.95g，KH2PO4 1.5g，PH 7.0 ；0.1MPa高压蒸汽灭菌，15~20min,备用；基因工程菌富集培养为LB培养基；
发酵培养基为添加0.8%纤维素半水解物的LB培养基，以丙烯酸作为基因工程菌脂肪酸β氧化抑制剂，必要时加入50 μ g/L的氨苄青霉素。
[0017]菌种分离鉴定:
本试验菌株系本公司采用尼耳红(Nile Red)荧光染色分离自山东胜利油田土壤，取长期浸于原油中的土壤。以无菌生理盐水稀释1000倍，将该土壤悬浊液1.0mL涂布于PHA合成菌分离培养基，于30°C~35°C培养5d~6d。菌落出现后，以ZF-2型三用紫外分析仪312nm波长照射，呈现橘红色荧光菌落者即为ΡΗΑΜα合成菌。
[0018]PHAmcl合成酶phaCl基因的获得与重组质粒的构建:
通过对中长链PHA合成酶phaCl进行序列分析,设计了保守引物:primer-olf:
5' -CCACGACAGCGGCCTGTTCACCTG-3'，primer-prz:5'-GTCGTCGTCACCGGCCAGCACCAG-3'，以新抗假单胞菌基因组DNA为模版扩增得到一个大的片段，从中分析得到ΡΗΑΜα合成酶基因1680bp大小的开放阅读框，根据获得的序列设计PHAm合成酶基因phacl的扩增引物，在上下游分别引入了 XbaI 和 EcoRI 位点:primer-f:5' -GGGGCTCTAGAAAGCGACTCAG-GACATTGGA-3'，primer-r:5'-CCCCGGAATTCTTCTGCGGTTGAGGTGGATG-3'。对 pBluescript SIT 和 PCR扩增产物进行XbaI和EcoRI双酶处理，回收后在T4DNA连接酶作用下16°C连续过夜，以备转化。
[0019]PCR 扩增:97°C预变性 10min，94°C变形 60s，58°C退火 30s，72°C延伸 60-120s，30个循环后72°C延伸IOmin。
[0020]将phaCl基因和载体质粒pBluescript SIT同时进行XbaI和EcoRI双酶切，酶切后利用T4连接酶将phaCl基因连接到质粒pBluescript SIT中，得重组质粒pSK-phaCl。
[0021]大肠杆菌感受态细胞的制备与转化:
采用钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于ImlLB培养集中36°C、150r/min振荡培养2h,均匀涂布于含有氨节青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。
[0022]重组大肠杆菌发酵生产PHAMCl:
-70°C保藏的重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，36°C培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入ImmoI/L的IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导phaCl的表达，以0.2g/L丙烯酸抑制脂肪酸β氧化，为？撤^合成提供(R)-3-羟基脂肪酸辅酶A前体，发酵培养72h。采取补料分批发酵的方式逐次加入纤维素半水解物底物。
[0023]发酵产物的分离:发酵收获后，收集菌体，过滤丝状菌体，用二氯甲烷为萃取剂，在60°C水浴搅拌加热2h。以旋转蒸发仪浓缩去除萃取剂，再用甲醇重结晶，白色沉淀即为ΡΗΑΜα。纤维素转化率97%，产品含量98%，产物表达量7.8g/L。
[0024]PHAm的醇解:最佳醇解条件分别为:在35°C下，以甲醇和水为溶剂，分解酶IPA-750为催化剂，？撤^与甲醇反应时间16h。醇解结束后，先收集分解酶再蒸出大部分的剩余甲醇后，从水中析出产物即为3HAME。醇解率98%，含量98.5%，3HAME燃烧热35.5MJ/kg ο
[0025]实施例2培养基和重组大肠杆菌工程菌构建同实施例1。
[0026]发酵培养基为添加0.1%纤维素半水解物的LB培养基。
[0027]重组大肠杆菌发酵生产ΡΗΑΜα:
-70°C保藏的重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，30°C培养过夜，以1.5%的接种量接种于发酵培养基中，加入1.5mmol/L的IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导phaCl的表达，以0.2g/L丙烯酸抑制脂肪酸β氧化，为PHAm合成提供(R)-3-羟基脂肪酸辅酶A前体，发酵培养48h，采取补料分批发酵的方式逐次加入纤维素半水解物底物。
[0028]发酵产物的分离:发酵收获后，收集菌体，过滤丝状菌体，用四氯化碳为萃取剂，在60°C水浴搅拌加热2h。以旋转蒸发仪浓缩去除萃取剂，再用乙二醇重结晶，白色沉淀即为ΡΗΑΜα。纤维素转化率95%，产品含量97%，产物表达量8.lg/L。
[0029]PHAmcl的醇解:在30°C下，以乙醇和水为溶剂，氢氧化钾为催化剂，ΡΗΑΜα与甲醇在80°C下反应8~10h，然后先蒸出大部分甲醇后，加入水洗涤无机杂质等，再析出3HAME。醇解率91.6%,含量95.4%ο
[0030]实施例3
培养基和重组大肠杆菌工程菌构建同实施例1。
[0031 ] 发酵培养基为添加7.0%纤维素半水解物的LB培养基。
[0032]重组大肠杆菌发酵生产PHAmcl:
-70°C保藏的重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，37°C培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入ImmoI/L的IPTG诱导phaCl的表达，以0.2g/L丙烯酸抑制脂肪酸β氧化，为？撤【合成提供(R)_3_羟基脂肪酸辅酶A前体，发酵培养72h，采取补料分批发酵的方式逐次加入纤维素半水解物底物。
[0033]发酵产物的分离:发酵收获后，收集菌体，过滤丝状菌体，用乙醚为萃取剂，在60°C水浴搅拌加热2h。以旋转蒸发仪浓缩去除萃取剂，再用乙醇重结晶，白色沉淀即为ΡΗΑΜα。纤维素转化率77.2%，产品含量86.5%，产物表达量8.5g/L。
[0034]PHAmcl的醇解:在37°C下，以乙二醇和水为溶剂，分解酶IPA-750为催化剂，反应时间10h，醇解结束后，先收集分解酶再蒸出大部分的剩余甲醇后，从水中析出产物。醇解率82.6%，含量 91.1%。
【权利要求】
1.一种中长链聚羟基脂肪酸酯(ΡΗΑΜα)的制备方法，包括以下步骤: (O构建包含聚羟基脂肪酸酯合成酶基因PhaCl的重组工程菌； (2)一定发酵条件下，重组工程菌在以纤维素为碳源的培养基中发酵； (3)发酵产物过滤菌体后，用溶剂I萃取，除去溶剂I后，再用溶剂2重结晶，得到产物PHAmcl。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)所述的PhaCl基因来源于油田土壤分离出的铜绿假单胞菌，重组工程菌为大肠杆菌重组工程菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:培养基中纤维素质量百分含量为0.1~10.0%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的发酵条件为:发酵温度30~37°C，采用分批培养的方式。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的溶剂I选自二氯甲烷、四氯化碳、乙醚，溶剂2选自甲醇、乙醇、乙二醇。
6.一种根据权利要求1所述中长链聚羟基脂肪酸酯(PHAsn)制备生物燃料中长链羟基脂肪酸甲酯(3HAME)的方法，其特征在于:中长链聚羟基脂肪酸酯(ΡΗΑΜα)在催化剂作用下，在醇类溶剂与水的混合溶剂中反应10~30h。
7.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述的催化剂为分解酶IP0-701、或氢氧化钾。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述的醇类溶剂为甲醇、或乙醇、或乙二`醇。
【文档编号】C12R1/385GK103571894SQ201210279029
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月8日 优先权日:2012年8月8日
【发明者】不公告发明人 申请人:徐州瑞赛科技实业有限公司