一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法

一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的与植物抗盐性相关的蛋白及其编码基因Lc9230受高盐诱导，其转基因植物具有较强的抗盐能力，实验结果显示，经150mM?NaCl胁迫培养3周后，野生型拟南芥植株仅有25%的植株存活，而转Lc9230基因植株存活率在90%左右，可见Lc9230基因可作为植物抗盐基因工程的候选基因，可用于改良植物的抗盐能力。
【专利说明】一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种源于羊草并与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因，与在培育抗盐性提高的转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002]世界上盐溃土壤面积超过8亿hm2，我国各类盐溃土壤总面积约0.99亿hm2。盐溃化土地面积的不断扩大、程度不断加深，严重制约了农业和畜牧业的发展。盐害是影响植物生长和作物产量的主要因素，能导致平均每亩产量降低50%以上。因此，提高农作物和各种畜牧草类对盐的适应能力，是当前现代农业与畜牧业【技术领域】的研究热点，同时也是我国及世界农业与畜牧业亟需解决的重大课题。
[0003]植物对盐溃胁迫的抵抗和忍耐能力称为抗盐性，抗盐性是植物在长期演化过程中形成的对不良环境的适应结果。盐胁迫影响植物的生长发育，限制植物的产量。植物为了抵抗环境中的高盐胁迫，其在生理，生化，细胞和分子水平产生保护机制，使其不受盐胁迫伤害。同时，在盐胁迫条件下，植物许多基因的表达发生变化，如转录因子、酶、分子伴侣、离子通道、信号分子和可溶性物质合成基因等。多年来，人们对植物响应盐胁迫的机制进行了大量研究，积累了丰富的资料。但由于其机制十分复杂，植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。 [0004]近年来，抑制消减杂交、基因表达序列分析、高通量测序技术等大规模表达基因鉴定技术的出现，大大丰富了盐碱胁迫下功能基因的获得途径，使得大量基因组、转录组信息的迅速获得成为可能；基因芯片、转录组测序技术在植物抗盐碱胁迫表达基因研究中的运用，为研究植物耐盐机制提供了全新的思路和方法，促进了植物抗盐机理研究的深入开展。同时，转基因方法为植物抗盐育种提供了有效途径，通过对耐盐植物中抗盐相关基因的克隆和转化，可明显提高转基因植物的抗盐性。因此，基因工程是提高植物耐盐性的有效的育种方法之一，其核心是从强耐盐植物中克隆得到耐盐的关键基因。通过现代基因工程手段将获得更多的耐盐突变体和耐盐转基因植物，并最终培育出能用于生产的耐盐作物和牧草品种，从而推动我国和世界盐碱地及次生盐碱地的开发利用。

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种与植物抗盐相关的蛋白及其编码基因和应用。
[0006]本发明所提供的蛋白质，名称为Lc9230,来源于羊草(Leymus chinensis (Trin.)Tzvel.),是如下(a)或(b):
[0007](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008](b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列I衍生的蛋白质。
[0009]上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0010]序列表中序列i由200个氨基酸残基组成。
[0011]编码所述Lc9230蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0012]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0013]在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述Lc9230蛋白的基因(命名为Lc9230);所述Lc9230基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子:
[0014]I)编码序列为序列表中序列2自5’末端第146至748位核苷酸所示的DNA分子；
[0015]2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0016]3)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0017]4 )在严格条件下与I)或2 )或3 )限定的DNA分子杂交且编码所述Lc9230蛋白的DNA分子；
[0018]5)与I)或2)或3)或4)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述Lc9230蛋白的DNA分子。
[0019]上述严格条件可为在0.1 XSSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0020]其中，序列2由1075个核苷酸组成，第146-748位为编码序列，编码序列表中序列I所示的蛋白质。序列5由2187个核`苷酸组成，第1-191位与序列2的第1-191位一致；第407-826位与序列2的第192-611位一`致，第1752-2187位与序列2的第612-1047位一致，即序列5所示基因为Lc9230基因的基因组序列，具有两个内含子(序列5的第192-406位；序列5的第827-1751位)和三个外显子(序列5的第1-191位；序列5的第407-826位；序列5的第1752-2187位)。
[0021]含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0022]所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0023]所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1302、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0024]在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述Lc9230基因转录的启动子可为35S启动子，具体如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在PSN1301质粒的多克隆位点处插入所述Lc9230基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为Kpn I和Sac I。
[0025]所述表达盒由能够启动所述Lc9230基因表达的启动子，所述Lc9230基因，以及转录终止序列组成。
[0026]所述Lc9230蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下al)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围: [0027]a I)调控植物抗盐性；
[0028]a2)选育抗盐植物品种。
[0029]在本发明的一个实施例中，所述调控植株抗盐性具体为提高植物的抗盐性。
[0030]所述选育抗盐植物品种的方法，具体可包括将所述Lc9230蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0031]本发明的另一个目的是提供一种培育抗盐性提高的转基因植物的方法。
[0032]该方法包括将编码所述Lc9230蛋白的基因导入目的植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗盐性提高。
[0033]所述Lc9230蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述Lc9230蛋白的基因(即Lc9230基因)是所述基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子:
[0034]I)编码序列为序列表中序列2自5’末端第146至748位核苷酸所示的DNA分子；
[0035]2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0036]3)序列表中序列5所示的DNA分子；
[0037]4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码所述Lc9230蛋白的DNA分子；
[0038]5)与I)或2)或3)或4)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述Lc9230蛋白的DNA分子。
[0039]上述严格条件可为在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0040]所述Lc9230基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。
[0041]所述植物可为双子叶植物，也可为单子叶植物，所述双子叶植株如拟南芥。
[0042]在本发明的一个实施例中，所述植物具体为拟南芥品种哥伦比亚(Col-0)。
[0043]扩增所述Lc9230基因的全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0044]实验证明，Lc9230可以调控植物抗盐胁迫能力，在受盐胁迫诱导时，表达水平明显提高，可以参与羊草对盐胁迫的响应，提高植物的抗逆性。实验证明，转Lc9230基因的拟南芥株系抗盐能力明显高于野生型。将MS培养基上生长7天的拟南芥移入含有150mM NaCl的MS培养基进行盐胁迫，3周后野生型拟南芥植株有25%的植株存活，其余植株均出现叶片逐渐发白死亡，而转Lc9230基因植株存活率在90%左右。由此可见，该基因可提高植物的抗盐能力，可用于农牧业和生态环境治理及能源植物所需的抗旱新品种的培育与鉴定，具有较高的应用价值。本发明在农业、畜牧业及绿色清洁能源等领域具有广阔的应用前景。
【专利附图】

【附图说明】
[0045]图1为羊草总RNA的电泳图谱。泳道1-泳道3为三个重复，每个泳道中的两个条带从上到下依次为28S RNA和18S RNA。
[0046]图2为Lc9230基因的5’ RACE PCR扩增产物和3’ RACE PCR扩增产物电泳图。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，由大到小依次为 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ;泳道 I 为5’ RACE PCR扩增产物；泳道2为3’ RACE PCR扩增产物。
[0047]图3为Lc9230基因全长cDNA的PCR扩增结果。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，由大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ;泳道 I 为 PCR 扩增产物。
[0048]图4为Lc9230基因的基因组序列PCR扩增结果。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，由大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp和750bp， 泳道I为基因组序列扩增产物。
[0049]图5为Lc9230基因在400mM NaCl盐胁迫处理下基因的表达情况。其中，CK表示处理时间为Oh。
[0050]图6为Lc9230基因在不同组织中的表达量分析。
[0051]图7为转入pCAMBIA1302空载体的烟草表皮细胞的激光共聚焦/TIRF显微镜图。其中，A为荧光下的烟草叶片表皮细胞；B为明场下的烟草叶片表皮细胞；C为A与B的叠加。
[0052]图8为转入重组表达载体pCAMBIA1302-Lc9230的烟草表皮细胞的激光共聚焦/TIRF显微镜图。其中，A为荧光下的烟草叶片表皮细胞出为明场下的烟草叶片表皮细胞；C为A与B的叠加。
[0053]图9为转Lc9230基因拟南芥植株基因组PCR检测结果。其中，A为Col-O/pSN1301-Lc9230的PCR检测结果；B为Col_0/pSN1301的PCR检测结果。A中，泳道1-5表示不同的Col-0/pSN1301-Lc9230株系，泳道ck表示转空载的拟南芥植株对照，泳道M为DL2000DNA 分子量标准，由大到小依次为 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和lOObp。B中，泳道1-6表示不同的Col-0/pSN1301株系；泳道ck为负对照(野生型拟南芥Col-Ο);泳道M为DL2000DNA分子量标准，由大到小依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp0
[0054]图10为T3代转Lc9230基因拟南芥的抗盐性检测结果。其中，A为转基因株系Linel与野生型(WT)在不含NaCl的MS培养基上的生长情况；B，C，D分别为转基因株系Linel，Line3，Line9与野生型(WT)在含有150mM NaCl的培养基上生长3周后的情况。其中，平皿的上半部分(黑色线条的上方)为野生型(WT);平皿的下半部分(黑色线条的下方)为转Lc9230基因株系。
[0055]图11为T3代转Lc9230基因拟南芥在盐胁迫(150mM NaCl)下的存活率统计结果。【具体实施方式】
[0056]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0057]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0058]实施例1、羊草抗盐相关基因Lc9230全长cDNA序列及基因组序列的获得
[0059]一、羊草抗盐相关基因Lc9230的5’端序列的克隆
[0060]1、植物材料处理及总RNA的提取
[0061]以羊草(Leymus chinensis (Trin.)品种中科二号(中国科学院植物研究所)幼苗为材料，盐胁迫处理6小时后提取总RNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。
[0062]2、羊草抗盐相关基因Lc9230的5’端序列的克隆
[0063]以步骤I提取的经盐胁迫理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech公司的5’ RACE试剂盒(产品目录号:634914)并参照试剂盒说明书，反转录合成U端cDNA模板。反应体系(10 μ I):1 μ I RNA, I μ I 5’-CDS primerA, I μ I SMART IIA oligo, I μ IDTT (20mM)，I μ I dNTP Mix (IOmM)，I μ I 反转录酶 MMLV，2 μ I 5 X First-Strand Buffer,2 μ I H2O ;其中，所述 5’-CDS primer A>SMART II A oligo>5XFirst-Strand Buffer 等组分均为随试剂盒提供。反应条件:70°C 2min，冰上2min，42°C 1.5h,72°C IOmin0
[0064]根据本实验室454转录组测序结果，筛选出与胁迫相关的基因序列，设计引物，具体的引物序列如下:
[0065]Lcl:5/ -ACCCCATCACCACGGCGATTCAT-3'(序列 2 的第 473-495 位的反向互补序列)
[0066]以上述合成的5 '端cDNA为模板，引物Lcl与引物UPM (Clontech公司:Long (0.4 μ Μ):5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，Short(2 μ M):5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)配对进行 PCR 扩增。PCR 反应体系(50 μ I):1 μ I 50 X Advantage 2Polymerase Mix, 34.5 μ I PCR-Grade Water, 5 μ IlOXAdvantage2PCR Buffer, I μ I dNTP Mix (IOmM)，5 μ I UPM，I μ I 引物 Lcl，2.5 μ IcDNA 模板；其中所述 50 XAdvantage 2Polymerase Mix、PCR-Grade Water、Advantage2PCR Buffer 等组分是Clontech公司，产品目录号为639206的试剂盒中的成份。反应条件为:94°C 30s,68°C30s, 70°C 60s，共 35 个循环；最后 70°C延伸 lOmin。
[0067]反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2泳道I所示，经PCR扩增获得了长度约为500bp的目的片段。回收并纯化5’ RNCE产物，将其连接到PMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该片段的长度为495bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3(序列2的第1-495位)所示。[0068]二、羊草抗盐相关基因Lcl3670的3’端序列的克隆
[0069]以步骤一 I中提取的经盐胁迫处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech公司的3’ RACE试剂盒((产品目录号:634914)并参照试剂盒说明书，反转录合成其3’端cDNA。反应体系(10 μ I):1 μ I RNA, I μ I 5’ -CDS primerA, I μ I DTT (20mM)，I μ I dNTPMix(IOmM)，I μ I 反转录酶 MMLV，2y I 5 X First-Strand Buffer, 3 μ I H2O;其中，所述5’-CDS primer A>SMART II A oligo>5XFirst-Strand Buffer 等组分随试剂盒提供。反应条件:70°C 2min，冰上 2min，42°C 1.5h,72°C IOmin0
[0070]根据上述步骤一获得的Lc9230基因5’端cDNA序列(序列3)设计引物:
[0071]Lc2:5/ -CACCACCACGCCGCTGCCGATA-3'(序列 2 的第 305-326 位)。
[0072]以上述获得的3’端cDNA为模板，引物Lc2与引物UPM (Clontech公司:Long(0.4 μ Μ):5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，Short(2 μ M):5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’)配对进行 PCR 扩增。PCR 反应体系(50 μ I):1 μ I 50 X Advantage2Polymerase Mix, 34.5 μ I PCR-Grade Water, 5 μ IlOXAdvantage 2PCR Buffer, I μ IdNTP Mix(IOmM) ,5 μ I UPM，I μ I 引物 Lc2，2.5 μ IcDNA 模板。反应条件:先 94 °C 30s，68°C 30s, 70°C 60s，共 35 个循环；最后 70°C延伸 lOmin。
[0073]反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2泳道2所示，经PCR扩增获得了长度约为800bp的目的片段。回收并纯化3’ RACE产物，将其连接到PMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该片段的长度为771bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4 (序列2的第305-1075 位)所示。
[0074]三、羊草抗盐相关基因Lc9230全长cDNA序列的获得及PCR检测
`[0075]利用上述步骤一和步骤二获得的长度为495bp (序列3)和77Ibp (序列4)片段之间的重叠区，借助Contig软件拼接得到的Lc9230基因的全长cDNA序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由1075个碱基组成，自5’端第146位-第748位为其编码序列，编码具有序列表中序列I所示的蛋白质。序列表中序列I由200个氨基酸残基组成。
[0076]根据Lc9230基因全长cDNA序列(序列2)设计如下引物:
[0077]Lc3:5/ -CTCTCCAATACTTTTTTGCCGT-3'(序列 2 的第 1026-1047 位的反向互补序列)
[0078]以上述反转录获得的5’端cDNA为模板，引物Lc3与引物N U P:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT (Clontech公司)配对进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，经PCR扩增获得了长度约为1000bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到PMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明，该PCR扩增产物与上述拼接得到的序列(序列2)在扩增部分完全相同，扩增部分的片段的核苷酸序列如序列2的自5’端第1-1047位所示，自5’端第146位-748位为其编码序列。这表明所克隆的3’ RACE片段和5’ RACE片段属于同一基因，将该基因命名为Lc9230，将其编码的蛋白命名为Lc9230。[0079]四、羊草抗盐相关基因Lc9230基因组序列的获得
[0080]以羊草(中科二号，中国科学院植物研究所)幼苗为材料，盐胁迫处理6小时后利用CTAB法提取其基因组DNA，贮存于_20°C备用。
[0081]以上述获得的基因组DNA为模板，根据步骤三获得的Lc9230基因全长cDNA序列(序列 2)设计引物 Lc4:5' -AGGAGGACGACGACCATCAA-3'(序列 2 的第 1_20 位)与引物 Lc3:5' -CTCTCCAATACTTTTTTGCCGT-3'(序列2的第1026-1047位的反向互补序列)，配对进行PCR 扩增。PCR 反应体系(20 μ l):cDNA 模板、Lc3 引物与 Lc4 各 I μ I, IOXBuffer 2.5μ I,dNTP MixtureC IOmmo 1/1 each)2 μ 1，Taq 酶 0.25 μ 1，ddH20 12.25 μ L.反应条件:先 94°C预变性 5min ;然后 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 90s，共 35 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。 [0082]反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，经PCR扩增获得了长度约为2100bp的目的片段。回收并纯化PCR产物，将其连接到pMD-18T载体(Takara公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该片段的长度为2187bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所示，通过比对，发现序列5的第1-191位与序列2的第1-191位一致；序列5的第407-826位与序列2的第192-611位一致，序列5的第1752-2187位与序列2的第612-1047位一致，这表明所得到的序列5为羊草抗盐相关基因Lc9230的基因组序列，且分析表明该基因具有两个内含子(序列5的第192-406位；序列5的第827-1751位)和三个外显子(序列5的第1-191位；序列5的第407-826 位；序列 5 的第 1752-2187 位)。
[0083]实施例2、Lc9230基因在盐胁迫条件下的表达模式及组织特异性分析
[0084]将正常生长4周的羊草(中科二号)幼苗进行盐胁迫(400mM NaCl)处理。胁迫处理时间为0、1、3、5、8、12、24小时。分别提取上述处理羊草幼苗的总RNA，分别通过RT-PCR方法分析Lc9230基因在不同胁迫条件下的表达模式。其中扩增Lc9230基因引物序列为5 ' -GGACGACGACCATCAATC-3 '(序列 2 的第 5-22 位)和 5 ' -CTTCACGCCGAAAGGACA-3 '(序列2的第851-868位的反向互补序列)；反应条件为94°C 4min ；94°C 30s,56°C 30s,72°C 30s，30个循环；72°C IOmin0以Actin作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为5' -GTGCTTTCCCTCTATGCAAGTGGT-3 和 5 ' -CTGTTCTTGGCAGTCTCCAGCTC-3 ';反应条件为940C 4min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s，28 个循环；72°C IOmin0
[0085]结果如图5所示，Lc9230基因的转录水平明显受盐胁迫诱导，随盐胁迫时间的延长，Lc9230基因的表达量迅速增加。
[0086]以2年生羊草(中科二号)为实验材料，分别提取根、根茎、叶鞘、茎、芽、叶和幼穗七种组织的总RNA，利用RT-PCR分析Lc9230基因的组织特异性表达模式。所用引物及反应条件均同上所述。
[0087]结果如图6所示，Lc9230基因在羊草的根、根茎、叶鞘、茎、芽、叶和幼穗七种组织中的表达存在差异，其中在根、根茎和叶中表达量较高，其余各组织表达量较低。
[0088]实施例3、Lc9230基因的亚细胞定位
[0089]将上述实施例1扩增得到的Lc9230基因cDNA(序列2)为模板，以两端分别带有酶切位点 Bgl II 和 Spe I 的 h.下游引物 5’-GAAGATCTGATGGGGGACGTGTCG-3’(划线处为 Bgl II识别位点，其后的序列为序列2的第145-160位)和5’GGACTAGTCCACCGCTTGTCGCC-3’ (划线处为Spe I识别位点，其后的序列为序列2的第731-745位的反向互补序列)进行PCR扩增，得到大小为617bp的目的条带，将该目的条带用限制性内切酶Bgl II和Spe I进行双酶切。与经同样酶切的表达载体 pCAMBIA 1302(Robert et al.(2006) A hypermorphic mutationin the protein phosphatase2C HABl strongly affects ABA signaling in ArabidopsisFEBS Lett.580,4691 - 4696，该载体上带有GFP基因)的骨架片段相连，获得重组质粒pCAMBIA1302-Lc9230o将重组表达载体pCAMBIA1302_Lc9230通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105，采用叶脉注射的方法转入幼嫩的烟草叶片细胞，同时以转入pCAMBIA1302空载体的烟草表皮细胞作为对照。转化的烟草在23°C条件下生长2-3d后用激光共聚焦/TIRF显微镜(Leica TCS SP5)下观察并照相。[0090]结果如图7 (转入PCAMBIA1302空载体的烟草)和图8 (转入重组表达载体pCAMBIA1302-Lc9230的烟草)所示:转入载体pCAMBIA1302的转基因细胞中表达的蛋白分布在整个细胞内；转入pCAMBIA1302-Lc9230重组表达载体的转基因细胞中表达的蛋白主要在细胞核和细胞膜上表达，而在细胞膜上表达较弱。
[0091]实施例4、转Lc9230基因拟南芥的获得及其抗盐性检测
[0092]一、重组表达载体pSN1301_Lc9230的构建
[0093]将上述实施例1扩增得到的Lc9230基因cDNA (序列2)为模板，以两端分别带有酶切位点 KpnI 和 Sac I 的 h下游引物 5’GGGGTACCATGGGGGACGTGTCGACG-3’ (划线处为 KpnI识别位点，其后的序列为序列2的第146-163位)和5’ -CGAGCTCTCACCACCGCTTGTCGCC-3，(划线处为Sac I识别位点，其后的序列为序列2的第731-748位的反向互补序列)进行PCR扩增，得到大小为618bp的目的条带，将该目的条带用限制性内切酶Kpn I和SacI进行双酶切。与经同样酶切的植物表达载体pSN1301 (Zhou J, et al.Basic helix-loop-helixtranscription factor from wild rice (0rbHLH2)improves tolerance tosalt-and osmotic stress in Arabidopsis.J Plant Physiol(2009), do1:10.1016/j.jplph.2009.02.007)的骨架片段相连，获得重组质粒。对所得的重组质粒进行Kpn I和SacI的双酶切鉴定，将经鉴定表明含有大小为618bp的目的条带的重组质粒进行测序，将经测序表明含有序列表中序列2的第146-748位的重组质粒命名为pSN1301-Lc9230。在重组表达载体pSN1301-Lc9230中，启动Lc9230基因表达的启动子为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子。
[0094]二、转Lc9230基因拟南芥的获得
[0095]将步骤一构建的重组表达载体pSN1301_Lc9230 (或pSN1301空载体)通过冻融 法(Holsters M, de Waele D,Depicker A.Transfection and transformationof Agrobacterium tumefaciens.Mol Gen Genet, 1978，183:181-187)导入根癌农杆菌EHA105。对转化后的重组农杆菌用由5 ’ -GGGGTACCATGGGGGACGTGTCGACG-3 ’和5，-CGAGCTCTCACCACCGCTTGTCGCC-3，组成的引物对进行PCR鉴定。将经酶切初步鉴定正确的样品进一步测序验证，将经测序鉴定表明含有Lc9230基因(PCR目的条带大小为618bp)的农杆菌EHA105命名为EHA105/pSN1301-Lc9230 ;将转入pSN1301空载体的农杆菌EHA105命名为 EHA105/pSN1301。
[0096]采用农杆菌花序侵染的方法(Bechtold N等，(1993) In plantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsisthaliana plants.C.R.Acad.Sc1.316:1194-1199)将上述所得的重组农杆菌 EHA105/pSN1301-Lc9230 (或EHA105/pSN1301)转化拟南芥品种哥伦比亚(Col-Ο型)。
[0097]收集转基因拟南芥的种子并在含有潮霉素B抗生素的平板上培养。通过潮霉素抗性筛选，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入pSN1301-Lc9230的拟南芥植株和转入pSN1301空载体的拟南芥植株。
[0098]进一步对上述获得的两种转基因拟南芥植株(Tl代)进行PCR鉴定，筛选PCR鉴定阳性株系。分别提取两种转基因拟南芥植株的基因组DNA作为模板，对与转入pSN1301-Lc9230的拟南芥植株的PCR鉴定，以Lc9230为靶基因，以5’ -GGGGTACCATGGGGGACGTGTCGACG-3’ 和 5’ -CGAGCTCTCACCACCGCTTGTCGCC-3’ 为引物，进行PCR扩增；对与转入pSN1301空载体的拟南芥植株的PCR鉴定，以⑶S为靶基因，以5，-ACGGCAAAGTGTGGGTCAA-3 ’和 5 ’ -CTCACACTATAGATGGGCGA-3 ’为引物，进行 PCR 扩增。同时设置野生型拟南芥Col-O作为负对照。结果显示:可以扩增出预计大小的片段(图9)。将经PCR鉴定表明含有Lc9230基因(目的条带大小约为618bp)的转入pSN1301_Lc9230的拟南芥命名为Col-0/pSN1301-Lc9230 ;同时将转入pSN1301空载体的拟南芥(目的条带大小约为520bp)命名为Col-0/pSN1301。将获得的Tl代转基因拟南芥植株自交授粉，获得T2代种子，T2代自交繁殖获得T3代。
[0099]三、T3代转Lc9230基因拟南芥的抗盐性检测 [0100]选取3个(Linel,Line3和Line9)纯合体株系(T3代)进行抗盐试验。方法如下:将在基本MS培养基上生长7d的转Lc9230基因拟南芥苗pSN1301_Lc9230和Col-O分为两组，每组12株，其中一组移栽至含150mM NaCl的MS培养基上培养，另一组在不含NaCl的MS培养基上培养，3周后观察其表型，并统计存活率。同时设置未转基因的拟南芥植株(WT)作为空白对照，设置转入PSN1301空载体的T3代Col-0/pSN1301作为空载体对照。设三次重复实验，统计分析成活率。
[0101]结果如图10所示，移苗3周后观察转基因株系及野生型表型，在不含NaCl的MS培养基上转基因基因植株与野生型均正常生长，表型上不存在差异；而在含150mM NaCl的MS培养基上，野生型大部分发白死亡，而3个转基因株系植株大部分仍为绿色。通过对其成活率进行统计，结果显示3周后野生型拟南芥植株有25%的植株存活，而转Lc9230基因植株存活率在90%左右(图11和表1)。空载体对照组无论是表型还是存活率的统计结果与野生型对照组基本一致，无显著差异。上述结果表明转Lc9230基因株系和作为空白对照的WT (野生型)拟南芥及作为空载体对照的Col-0/pSN1301相比，抗盐能力得到明显提高。
[0102]表1T3代转Lc Lc9230基因拟南芥在盐胁迫(150mM NaCl)下的存活率统计
[0103]
【权利要求】
1.蛋白质，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子: 1)编码序列为序列表中序列2自5’末端第146-748位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)序列表中序列5所示的DNA分子； 4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 5)与I)或2)或3)或4)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于:所述重组表达载体为在PSN1301载体的多克隆位点处插入编码权利要求1所述蛋白质的基因，得到的重组质粒。
8.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4-6中任一所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下al)或a2)中的应用: al)调控植物抗盐性； a2)选育抗盐植物品种。
9.一种培育抗盐性提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗盐性提闻。
10.根据权利要求8所述的应用，或权利要求9所述的方法，其特征在于:所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
【文档编号】C12N15/84GK103626857SQ201210308697
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月27日 优先权日:2012年8月27日
【发明者】刘公社, 李晓霞, 程丽琴, 高琼, 马甜 申请人:中国科学院植物研究所