专利名称：土传病害鉴定病圃的建立方法
技术领域：
本发明涉及植物病害防治领域，具体涉及土传病害鉴定病圃的建立方法。
背景技术：
对植物病害防治的研究，尤其是植物土传病害防治的研究，建立合适的病圃对于研究植物的抗病性鉴定和抗病育种意义非常重大。病圃的设置与利用是进行抗病性鉴定的基本条件，没有重而均匀的发病条件就难以对植物品种资源的抗病性做出可靠的鉴定。合适均匀病圃的建立，一方面关系到对植物的抗病性鉴定是否准确可靠，鉴定结论是否可信，能否用于指导科研生产；另一方面，对于植物的抗病育种也至关重要，它能对育种材料或品种的抗性进行最全面、严格的考验，鉴定 出适合在生产中应用的材料或品种，合适均匀的病圃可以利于促进抗病育种的选育步伐。病圃的建立可分为天然病圃和常规人工病圃。天然病圃是指在连年耕作的常规农田中，局部或部分面积地块病原菌逐年积累，自然形成的重病块或重病区，人们选择这部分田块作为天然病圃。天然病圃的选择建立有其特定的缺点和不足①发病不均匀天然病圃土壤中病原菌含量不均匀、相差较大，表现为局部地块发病很重、局部地块发病很轻的情况，这无论对抗病性鉴定还是抗病品种选育都不准确，容易造成偏差。②病原菌生理小种不可控很多土传病害，存在不同的生理小种，各生理小种之间，致病力有所不同，所以，无论选择致病力极强的生理小种还是选择致病力极弱的生理小种，都不能很好地反映出植物的抗病性，而天然病圃中病原菌的生理小种存在不确定性，致病力过强或过弱都不适宜植物的抗病性鉴定和抗病品种的选育。③病圃位置存在隐患绝大多数土传病害都属于检疫性病害，因为科研工作的需要，建立土传病圃时，一般都遵循植物检疫的原则，做到有效杜绝病原物的外传，保持农业生产区的纯净。而天然病圃大多都在农田区域范围内，具有潜在扩散传播的危险性，使得机耕、灌溉等农事操作及农产品种子、苗木、茎杆及果实的运输带来不便。常规人工病圃是指人为把病原菌从病株上分离出来，经纯化后在特定培养基上扩大培养，待长满整个培养基后，将病原菌和培养基一同撒施到规划好的区域内，建立土传病害病圃的ー种方法。常规的人工病圃建立也有其缺点和不足的地方①常规人工病圃费时耗力，耗费大量物资。常规人工病圃需要制作大量的培养基，常见培养基有大麦、小麦、棉子壳、麦麸等的混合物，需要把这些物质进行浸泡处理、装袋密封及高压灭菌工作，用量大，费エ费时，消耗水电。②操作过程容易污染，对环境要求高整个培养基制作、灭菌、接种以及存放等均需要无菌的环境，ー不小心容易造成杂菌感染，培养基接种后还要需要大量洁净的空间存放培养，对环境要求高。③常规人工病圃效率低下，エ效不高，エ期较长。常规人工病圃的建立需要大量的接种物，如果建立面积较大的病圃，处理起来非常麻烦，功效很低，需要连续多年才能建造成比较成熟的病圃。④常规人工病圃也存在不均匀的现象。人エ培养的培养基及病原菌混合物虽然可以在撒入土壌中做到尽量均匀，但是，因为人工培养基多为固体团粒状，无法均匀撒开，且病原菌的菌丝体或孢子生长不一致，所以常规人工病圃也存在局部很重，局部很轻的情況。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中运用方法繁复、成本偏高、费エ费时、病圃均匀性低等缺陷，提供了一种土传病害鉴定病圃的建立方法。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为土传病害鉴定病圃的建立方法，包括以下步骤
1)病原物的分离纯化将病原物从植物病株中分离出来后，进行单孢分离并纯化后得到病原物单菌落；
2)菌落培养将步骤I)得到的培养好的病原物单菌落，用打孔器沿菌落边缘打取直径 为IOmm的菌块，接种于马铃薯PDA培养基上，28°C培养5_7天，之后将培养好的病原物菌落连同马铃薯PDA培养基全部接入查氏培养液中进行培养，并于28°C摇床培养4-5天，摇床转速为120转/分，得到孢子悬浮液，再以无菌水配制成浓度为I X IO7个/ml的病原物孢子悬浮液；
3)二次培养将步骤2)得到的病原物孢子悬浮液按照1:40体积比例接入到查氏培养液中，静置培养10天，以监测孢子量大于等于I X IO7个/ml为达到所需标准，得到可接种孢子液；
4)接入病圃将步骤3)得到的可接种孢子液按照每亩地IOOkg接种量施入病圃中，分别在植物生长的第30、50、70和90天施入。进ー步的，所述步骤I)中，病原物为土壤习居菌，属于土传病害可以利用此方法。进ー步的，所述步骤2)中，马铃薯PDA培养基中各组分比例为按照质量比马铃薯甸甸糖:琼月旨:水为100 9 9 :382。进ー步的，所述步骤2)中，病原物单菌落接种于马铃薯PDA培养基上，280C培养6天。进ー步的，所述步骤2)中，查氏培养液中各组分比例为按照质量比硝酸钾磷酸~-氣钟:硫fe续氣化钟硫Ife亚铁庶糖水为2 I 0. 5 0. 5 0. 01 30 :1000。本发明的有益效果为本发明提供的技术方案，具有以下效果
1、以前的常规人工建立病圃的方法是费时耗力，耗费大量物资，本技术方案可以节省大量的培养基物质，省去固体培养基浸泡处理、装袋密封、高压灭菌以及人工接菌等繁琐过程，直接接入液体查氏培养基中即可，省时省エ，可节省大量成本；
2、以前的常规人工建立病圃的方法容易引起杂菌的感染，本技术方案直接接入到液体培养基中，密封性好，不容易混入杂菌，減少了常规接种等复杂操作过程中不慎混入杂菌的感染的可能性；
3、本技术方案可以减少操作步骤，提高工作效率，可以大批量制备，液体查氏培养基易于制备，简单可行，无需复杂操作；
4、通过滴灌的方式随水滴施进入病圃的方法均匀性好，病原菌孢子可以均匀分布到土壌中，而且直接在土壌中定殖，利于侵染寄主植物，避免常规人工接种过程中在田间撒施时，因为风吹日晒、紫外线辐射使部分病原菌菌丝及孢子死亡的现象发生。
具体实施例方式实施例I :
棉花枯萎病病圃的建立
1)从棉花枯萎病株体中分离纯化出枯萎病单菌落，编号为XH-I，保存备用；
2)将编号为XH-I的枯萎病单菌落接种于制备好的马铃薯PDA培养基上，置于28°C霉菌培养箱中培养5 7天，至菌落长满整个培养皿；
3)沿菌落边缘打成直径IOmm的菌饼，在超净工作台上接到500ml三角锥形瓶的查氏培养液中，每IOOml培养液接入3片菌饼，每瓶接入10片菌饼(因每个三角锥形瓶装入查氏培养液体积约为330ml)；
4)置于120转/分，温度设置为28°C的摇床上，摇培4-5天后，得到孢子悬浮液，用无·菌水调节成I X 107孢子悬浮液；
5)然后将其按1:40比例接到体积为20L密闭容器装入4/5体积灭菌好的查氏培养液中，静置培养10天，当监测孢子量ミI X IO7个/ml吋，即可接种；
6)按照姆亩地IOOkg接种量随水滴施进入病圃中,在整个棉花生长季节的第30天、50天、70天和90天连续施入4次。查氏培养液中各组分比例为按照质量比硝酸钾磷酸ニ氢钾硫酸镁氯化钾硫酸亚铁蔗糖水为 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0实施例2:
棉花黄萎病病圃的建立
1)从棉花黄萎病株体中分离纯化出黄萎病单菌落，编号为143T-5，保存备用；
2)将编号为143T-5的黄萎病单菌落接种于制备好的PDA培养基上，置于28°C霉菌培养箱中培养5 7天，至菌落长满整个培养皿；
3)沿菌落边缘打成直径IOmm的菌饼，在超净工作台上接到500ml三角锥形瓶的查氏培养液中，每IOOml培养液接入3片菌饼，每瓶接入10片菌饼(因每个三角锥形瓶装入查氏培养液体积约为330ml)；
4)置于120转/分，温度设置为28°C的摇床上，摇培4-5天后，得到孢子悬浮液，用无菌水调节成I X 107孢子悬浮液；
5)然后将其按1:40比例接到体积为20L密闭容器装入4/5体积灭菌好的查氏培养液中，静置培养10天，当监测孢子量彡IX 107个/ml吋，即可接种；
6)按照姆亩地IOOkg接种量随水滴施进入病圃中,在整个棉花生长季节的第30天、50天、70天和90天连续施入4次。查氏培养液中各组分比例为按照质量比硝酸钾磷酸ニ氢钾硫酸镁氯化钾硫酸亚铁蔗糖水为 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0实施例3:
向日葵菌核病病圃的建立
1)从向日葵菌核病株体中分离纯化出菌核病单菌落，编号为BTU-10，保存备用；
2)将编号为BTU-10的菌核病单菌落接种于制备好的PDA培养基上，置于28°C霉菌培养箱中培养5 7天，至菌落长满整个培养皿；
3)沿菌落边缘打成直径IOmm的菌饼，在超净工作台上接到500ml三角锥形瓶的查氏培养液中，每IOOml培养液接入3片菌饼，每瓶接入10片菌饼(因每个三角锥形瓶装入查氏培养液体积约为330ml)；
4)置于120转/分，温度设置为28°C的摇床上，摇培4-5天后，得到孢子悬浮液，用无菌水调节成I X 107孢子悬浮液；
5)然后将其按1:40比例接到体积为20L密闭容器装入4/5体积灭菌好的查氏培养液中，静置培养10天，当监测孢子量彡IX 107个/ml吋，即可接种；
6)按照姆亩地IOOkg接种量随水滴施进入病圃中,在整个向日葵生长季节的第30天、50天、70天和90天连续施入4次。查氏培养液中各组分比例为按照质量比硝酸钾磷酸ニ氢钾硫酸镁氯化钾硫酸亚铁蔗糖水为 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管參照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.土传病害鉴定病圃的建立方法，其特征在于，包括以下步骤 1)病原物的分离纯化将病原物从植物病株中分离出来后，进行单孢分离并纯化后得到病原物单菌落； 2)菌落培养将步骤I)得到的培养好的病原物单菌落，用打孔器沿菌落边缘打取直径为IOmm的菌块，接种于马铃薯PDA培养基上，28°C培养5_7天，之后将培养好的病原物菌落连同马铃薯PDA培养基全部接入查氏培养液中进行培养，并于28°C摇床培养4-5天，摇床转速为120转/分，得到孢子悬浮液，再以无菌水配制成浓度为I X IO7个/ml的病原物孢子悬浮液； 3)二次培养将步骤2)得到的病原物孢子悬浮液按照1:40体积比例接入到查氏培养液中，静置培养10天，以监测孢子量大于等于I X IO7个/ml为达到所需标准，得到可接种孢子液； 4)接入病圃将步骤3)得到的可接种孢子液按照每亩地IOOkg接种量施入病圃中，分别在植物生长的第30、50、70和90天施入。
2.根据权利要求I所述的土传病害鉴定病圃的建立方法，其特征在于，所述步骤I)中，病原物为土壤习居菌。
3.根据权利要求I所述的土传病害鉴定病圃的建立方法，其特征在于，所述步骤2)中，马铃薯PDA培养基中各组分比例为按照质量比马铃薯葡萄糖琼脂 水为100 9 9 :382。
4.根据权利要求I所述的土传病害鉴定病圃的建立方法，其特征在于，所述步骤2)中，病原物单菌落接种于马铃薯PDA培养基上，28°C培养6天。
5.根据权利要求I所述的土传病害鉴定病圃的建立方法，其特征在于，所述步骤2)中，查氏培养液中各组分比例为按照质量比硝酸钾磷酸ニ氢钾硫酸镁氯化钾硫酸亚铁蔗糖 水为 2 1 :0. 5 :0. 5 :0. 01 30 =IOOO0
全文摘要
本发明公开了土传病害鉴定病圃的建立方法，包括以下步骤1)病原物的分离纯化；2)菌落培养；3)二次培养；4)接入病圃。本发明的有益效果为1、节省大量的培养基物质，省去固体培养基浸泡处理、装袋密封、高压灭菌以及人工接菌等繁琐过程，可节省大量成本；2、直接接入到液体培养基中，密封性好，不容易混入杂菌，减少了常规接种等复杂操作过程中不慎混入杂菌的感染的可能性；3、可以减少操作步骤，提高工作效率，可以大批量制备，液体查氏培养基易于制备，简单可行，无需复杂操作；4、通过滴灌的方式随水滴施进入病圃的方法均匀性好，利于侵染寄主植物。
文档编号C12N3/00GK102835288SQ201210309640
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者刘政, 孙艳, 余渝, 林海, 刘丽, 陈兵, 韩焕勇, 王方勇, 董承光, 宿俊吉 申请人:新疆农垦科学院