表达分泌型鸭坦布苏病毒e蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗的构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗，其保藏号为CCTCC?V201214，命名为rDEV-TE-tPAS，及其构建方法和应用。具体地，本发明利用重组克隆技术，将包含SV40启动子、鸭坦布苏病毒E蛋白和tPA(Tissue?plasminogen?activator)信号肽序列的基因片段SV40-E-tPA插入到鸭病毒性肠炎病毒的US7和US8基因之间的间隔区中，构建获得在US7和US8基因之间插入SV40-E-tPA表达框架的粘粒，由其拯救获得表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗CCTCC?V201214。本发明还涉及构建该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，以及该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株用于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和鸭坦布苏病毒引起的传染病的疫苗的应用。
【专利说明】表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗的构建和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于重组病毒疫苗领域，更具体地属于重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗领域。本发明提供一种表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCCV201214,命名为rDEV-TE-tPAS，及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV),又称鸭病毒性肠炎病毒。能引起鸭、鹅和其它雁形目禽类发生急性、热性、败血性为特征的烈性传染病。与其它疱疹病毒相比，针对DEV的研究较少。第八次国际病毒学分类委员会报告将其分类为疱疹病毒[1]，而具体属分类仍未确定；直至最近，其基因组全序列才被全部测序完成[2]。自2007年，本研究室开始了 DEV疫苗株基因组的测序工作，通过构建DEV疫苗株全基因组粘粒文库，分段对其进行了测序和分析，至2009年中期，已将DEV疫苗株全基因组序列解析完成。几乎同时，Li等也报道了 DEV疫苗株全基因组的测序和分析结果，其基因组大小约为158Kb，约编码78个蛋白。通过对DEV疫苗株基因组基因构成及结构分析，DEV被认为是α疱疹病亚科中的中间型病毒，与水痘病毒属成员更为相近[2]。而同为禽类疱疫病毒的马立克病毒(MDV)和火鸡疱疫病毒(HTV)属于马立克病毒属，鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鹤踏疱疫病毒(PsHV)为传染性喉气管炎病毒属。
[0003]自上世纪80年代成功利用痘病毒为载体表达单纯疱疹病毒的TK基因以来，人们开始尝试用各种不同DNA病毒为载体，表达不同外源基因，并将构建的重组疫苗用于人和各种不同动物疾病的预防。大量的研究结果表明，疱疹病毒因其基因组大，可供外源基因插入或替代的非必需基因多，被认为是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。截止目前，在常见畜禽疱疹病毒疾病中，已有大量的相关研究报道；如以伪狂犬病毒(PRV)为载体，分别在gD、gE、gG和TK等基因中插入猪瘟(CSF)的E2等外源基因，并用其免疫猪，取得了良好的免疫效果[4_11]。用在鸡传`染性喉气管炎病毒(ILTV)的ULO和UL50中分别插入不同HA基因构建成功的重组病毒免疫鸡，均效果良好[11_13]。同样，Sakaguchi M(1993 ；1994)和Sonoda K(1996)等分别在MDVl的US10、US3、IRL中插入Lac Z基因，用其免疫I日龄无特定病原鸡(SPF鸡)，I周后用vMDV、vvMDV攻毒，其对SPF鸡的保护效率为80~100% [14_16]；在MDVl的USlO中插入NDV F基因、在US2中插入IBDV VP2基因的重组病毒对MDV强毒的保护效率与对照MDVl相当[17’18] ；Tsukamoto K等(2002)以Pec作为传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2基因的启动子插入火鸡疱疹病毒(HVT)的UL45和UL46基因之间成功构建重组病毒，用其免疫的SPF鸡足以抵抗IBDV强毒的攻击[19]。当前，我国用于鸭瘟预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚弱化活疫苗。作为α疱疹病亚科一员，DEV也应该是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。
[0004]DEV的基因组成及结构与MDV等有着较大的差异，如MDV的基因组结构为TRL-UL-1RL-1RS-US-TRS,而DEV基因组的结构是UL-1RS-US-TRS。且DEV与同亚科的另外几种畜禽疱疹病毒在动物体内生长复制的生物学特点也不尽相同。因此，在PRV、MDV、ILTV中可稳定插入外源基因的位点不一定适用于DEV。由于对DEV的研究相对滞后，国内外关于DEV基因中复制非必需区的研究报道仍是空白。常用于构建疱疹病毒重组病毒的方法有三种。一种是同源重组；第二种是将病毒基因组插入BAC中，然后在BAC上构建突变，用其转染相应细胞拯救出重组病毒；第三种是将含有相互重叠区的疱疹病毒基因片段分别插入粘粒中，并在其相应区段上构建突变，再用其共转染相应细胞拯救出重组病毒。然而对于DEV这种基础研究缺乏、分类不清楚、非必需基因未知的病毒而言，用第一或第二种方法构建重组病毒工作量大，且效率低。而第三种方法的难点在于多粘粒感染性克隆的建立，如果这个平台构建成功，将能快速有效的构建重组病毒。至今，疱疹病毒的这种感染性克隆构建技术已比较成熟，且已见诸报道[2°_27]。
[0005]本研究室在前期研究中，在鸭病毒性肠炎病毒的基因组中鉴定出可供外源基因稳定插入的复制非必需区。在此基础之上，本研究将鸭坦布苏病毒PTD2010株的保护性基因E基因表达框架插入DEV基因组的US7和US8基因之间，用其免疫无特定病原鸭(SPF鸭)能使SPF鸭产生良好的对抗鸭坦布苏病毒的抗体，且不影响DEV的免疫效果。
【发明内容】
[0006]本发明提 供一种表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCC V201214，命名为rDEV-TE-tPAS，及其构建方法和应用。
[0007]具体地，本发明利用重组克隆技术，将包含鸭坦布苏病毒E基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-E(SEQ ID NO:1)插入到鸭病毒性肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)的US7和US8基因之间的间隔区(US7和US8基因之间的间隔区的核苷酸序列见SEQID NO:5)中，构建获得在US7和US8基因之间插入SV40E表达框的粘粒pF0S5us78 SV40E，由其拯救获得表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCCV201214，命名为rDEV-TE-tPAS。本发明还涉及构建该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，以及该重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株用于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和鸭坦布苏病毒引起的传染病的疫苗的应用。
[0008]在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCC V201214，命名为rDEV-TE-tPAS，其于2012年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编:430072)。所述表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCCV201214在鸭肠炎病毒DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区(SEQ ID NO:5)中插入包含鸭坦布苏病毒E基因和SV40启动子序列的基因片段SV40-E(SEQ ID N0:1)。
[0009]在本发明的一个实施方案中，本发明提供构建表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201214的方法，所述方法包括下述步骤:
[0010](I)构建鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因组的Fosmid文库，并从中选择用于拯救鸭病毒性肠炎病毒的5粘粒组合系统，将它们分别命名为pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中pF0S5粘粒包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区；
[0011](2)利用步骤(1)中获得的包含DEV基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区的粘粒PF0S5，在该粘粒的US7和US8基因之间插入包含鸭坦布苏病毒E蛋白和SV40启动子序列的基因片段(SEQ ID NO:1)，构建重组突变粘粒；和
[0012](3)利用步骤(2)中获得的重组突变粘粒和步骤(1)中获得的5粘粒组合系统中的pF0Sl、pF0S2、pF0S3和pF0S4共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，拯救出重组病毒株CCTCCV201214，将其命名为 rDEV-TE-tPAS。
[0013]在优选的实施方案中，上述步骤(1)中得到的5粘粒克隆所包含的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段两端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒全基因组(它们的重叠和覆盖模式可参见图9)。
[0014]在优选的实施方案中，上述步骤(2)中的鸭坦布苏病毒E蛋白来源于鸭坦布苏病毒PTD2010株，鸭坦布苏病毒PTD2010株由本发明人于2010年从福建莆田鸭群中分离得到，由兽医生物技术国家重点实验室暨农业部动物流感重点实验室保存；上述步骤(2)中的SV40启动子序列来源于包含SV40启动子的质粒，例如，pSI质粒(购自PiOmega公司)
坐寸ο
[0015]本发明所用的鸭病毒性肠炎病毒为DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBankEU082088)(中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，目录编号AV1222 ;购自中国兽医药品监察所)。
[0016]在本研究中，本发明人发现，E蛋白的插入位置不影响所构建的重组疫苗株对鸭病毒性肠炎病毒的免疫效果(数据未显示)。但E蛋白插入其他位置，是否会影响其抗鸭病毒性肠炎病毒的保护效果需要实验来证明。
`[0017]在本发明的一个实施方案中，本发明提供所述表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201214的应用，其用于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和鸭坦布苏病毒引起的传染病的疫苗。
[0018]在本发明的优选实施方案中，所述鸭病毒性肠炎病毒和鸭坦布苏病毒引起的传染病包括鸭病毒性肠炎病毒和鸭坦布苏病毒在家禽中引起的传染病，例如，由鸭病毒性肠炎病毒DEV引起的鸭病毒性肠炎，由鸭坦布苏病毒引起的鸭坦布苏病毒病等。
[0019]在本发明的一个实施方案中，本发明提供一种疫苗，其包括本发明所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201214,以及药用佐剂、赋形剂等。本领域技术人员根据所述疫苗的应用目的、进行免疫的禽类等因素，可以容易地选择适合的药用佐剂、赋形剂等。
[0020]在本发明的优选实施方案中，所述疫苗可以有效用于预防由鸭病毒性肠炎病毒和鸭坦布苏病毒在家禽中引起的传染病，例如，有效用于预防由鸭病毒性肠炎病毒DEV引起的鸭病毒性肠炎，由鸭坦布苏病毒引起的鸭坦布苏病毒病等。所述疫苗可用于家禽，例如，鸭、鹅、鸡等。
[0021]因此，本发明提供下述:
[0022]1.表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为 CCTCC V201214，命名为 rDEV-TE-tPAS。
[0023]2.根据第I项所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中在鸭肠炎病毒DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区中插入包含鸭坦布苏病毒E蛋白和SV40启动子序列的基因片段(SEQ ID NO:1)。[0024]3.根据第I项或第2项所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述鸭坦布苏病毒E蛋白由鸭坦布苏病毒PTD2010株扩增得到。
[0025]4.根据第2项所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述SV40启动子序列来源于包含SV40启动子的质粒。
[0026]5.根据第4项所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述包含SV40启动子的质粒包括pSI质粒。
[0027]6.构建第I项所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，所述方法包括下述步骤:
[0028](I)构建鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的Fosmid文库，并从中选择用于拯救鸭病毒性肠炎病毒的5粘粒组合系统，将它们分别命名为pF0Sl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中pF0S5粘粒包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区；
[0029](2)利用步骤⑴中获得的包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区的粘粒PF0S5，在该粘粒的US7和US8基因之间的间隔区中插入包含鸭坦布苏病毒E蛋白和SV40启动子序列的基因片段(SEQ ID NO:1)，构建重组突变粘粒；和
[0030](3)利用步骤(2)中获得的重组突变粘粒和步骤⑴中获得的5粘粒组合系统中的pF0Sl、pF0S2、pF0S3和pF0S4共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，拯救出重组病毒株CCTCCV201214，将其命名为 rDEV-TE-tPAS。
[0031]7.根据第6项所述的方法，其中步骤(1)中得到的5粘粒组合系统中的每一个粘粒克隆所包含的DEV DNA片段两端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接头，相互重叠，且拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒全基因组。
[0032]8.第I项所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的应用，其用于制备预防鸭病毒性肠`炎病毒和鸭坦布苏病毒引起的传染病的疫苗。
[0033]9.根据第8项所述的应用，其中所述鸭病毒性肠炎病毒和鸭坦布苏病毒引起的传染病包括鸭病毒性肠炎和鸭坦布苏病毒病。
[0034]10.一种疫苗，其包括第I项所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201214,以及药用佐剂、赋形剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0036]图1:PCClFos 粘粒图谱；
[0037]图2:拯救的病毒dDEV与亲本DEV疫苗株病毒基因组分别用BamH 1、EcoR 1.BbvCI酶切后的脉冲电泳图谱，其中DEV:亲本DEV疫苗株(即用于构建重组病毒的亲本病毒疫苗株)，dDEV:由本发明人构建和筛选的5粘粒系统(参见实施例1-3)拯救出的三株病毒，Ml:低范围PFG分子标记(Low Range PFG Marker) ；M2:DL15000分子标记；M3: λ -Hind III消化分子标记(λ-Hind III digest Marker)；
[0038]图3:pUC ccdB kan 质粒图谱；
[0039]图4:pF0S5 us78 Kan ccdB 粘粒图谱；
[0040]图5: pENTR MCS 质粒图谱；
[0041]图6:pSIE质粒图谱；[0042]图7:pENTR sv40_E 质粒图谱；
[0043]图8:pF0S5us78 SV40 E 粘粒图谱；
[0044]图9:鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆拯救重组病毒示意图；
[0045]图10:重组病毒E蛋白在CEF中的表达免疫荧光检测(A和B，B为阴性对照)及蛋白质印迹(western blot) (C)检测结果图；
[0046]图11:PCR检测外源表达框架在rDEV-TE-tPAS中的情况；
[0047]图12:免疫重组病毒后，在SPF鸭体内诱导中和抗体的情况；
[0048]图13:SEQ ID NO:1:SV40_E表达框架，其中斜体加粗部分为鸭坦布苏病毒E基因。
【具体实施方式】
[0049]以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0050]实施例1.DEV疫苗株基因组Fosmid文库的构建
[0051]按EPICENTRE 公司“CopyControI Fosmid Library Production Kit”试剂盒说明书构建DEV基因组的Fosmid文库。
[0052]方法如下:将DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBank EU082088)(中国兽医微生物菌种保藏管理中心，目录编号AV1222 ;购自中国兽医药品监察所)DNA用物理方法即用25号针头(购自上海治宇`医疗器械有限公司)抽吸多次进行切断处理，用T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase,购自 New England Biolabs)及喊性憐酸酶(AlkalinePhosphatase,购自New England Biolabs)对DNA片段进行末端平滑化及去磷酸化处理,脉冲电泳(用Bio-Rad公司CHEF Mapper? XA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为:电泳缓冲液为0.5xTBE,琼脂糖胶浓度为I %，程序为2K-80K)，回收38kbp_48kbp之间的DNA片段。将回收后的DEV DNA片断两端用T4连接酶连接上Fse 1-Sbf 1-Pme I接头，精制后连接到pCClFos (购自EPICENTRE，图谱见图1)载体上，4°C过夜连接。对混和液进行包装，转染大肠杆菌EPI300-T1 (购自EPICENTRE)。对文库滴度进行确认，其试验过程如下:将包装好的混和液进行10倍梯度稀释，分别取10_2，?ο-4, ?ο-5,10_6四个稀释度的稀释液10 μ I感染100 μ I ΕΡΙ300-Τ1细胞，将此菌涂于含12.5μ g/ml氯霉素的LB平板，37°C过夜培养，统计菌落数量，并计算其滴度，结果为3.8xl05cfu/lib。即成功构建DEV的fosmid文库。
[0053]实施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的选择
[0054]文库构建成功后，挑取286个克隆提取粘粒，用碱裂解法[5]提取粘粒，送大连宝生物公司对插入PCCl Fos中的DEV DNA片段末端进行测序，测序引物序列如下:
[0055]Primer 1:5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’
[0056]Primer 2:5’ -GCCAAGCTATTTAGGTGAGA-3’
[0057]经过末端测序的分析，共得到插入片段两端都连接有完整Fse 1-Sbf 1-Pme I接头的克隆250个。从这250个克隆中选取多组用于拯救DEV的5粘粒组合。其中每组中克隆的DEV DNA片段两端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV
基因组。[0058]实施例3.病毒拯救
[0059]用Qiagen公司的中量提取试剂盒提取所选择的粘粒的DNA。用Fse 1、Sbf I或Pme I内切酶(均购自New England Biolabs)对所选择的粘粒进行线性化处理,反应条件如下:Sbf I内切酶20U (也可以使用Fse I或Pme I内切酶)，粘粒10 μ g，37°C作用I小时，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制备转染用DEV DNA。
[0060]参照Reddy SM (2002)的磷酸钙方法将5段DEV DNA共转染次代鸡胚成纤维细胞(CEF) [28]，经多次重复，其中有3组5粘粒组合转染4-6天后可见CEF出现DEV病毒典型病变，选取重复性较好的一组5粘粒组合进行后续实验。收获此组5粘粒共转染拯救的病毒，命名为dDEV，用此dDEV与亲本DEV病毒(即用于构建该感染性克隆的亲本病毒)分别接种次代CEF。
[0061]CEF的制备方法如下:取9-10日龄SPF鸡胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭气室部位，脱碘后无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’ s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，并去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎。用0.25%的胰酶(4mL/胚)在37°C水浴中消化4_5分钟，弃去胰酶，用Hank’s液洗涤2次。加入适量的含血清与双抗(青霉素100u/mL，链霉素IOOmg/mL)的M199营养液(购自HyClone)，吹打使细胞分散，用四层纱布过滤后制成IO6-1O7细胞/毫升的细胞悬液，最后分装于培养转瓶中37°C旋转培养。36-48小时后，按毒种:细胞培养液体积比为1: 1000将病毒接种于CEF。待细胞病变达到100%时，收集培养液；4°C 6000g离心10分钟，去除细胞碎片；取上清50000g离心2小时富集病毒；然后经20%和60%蔗糖密度梯度离心，50000g离心2小时，回收20%和60%中间层；之后经50000g离心2小时超速离心脱糖处理获得纯化好的病毒。提取病毒全基因组DNAt29]，分别用BamH 1.EcoR I和BbvC 1(均购自New England Biolabs)对原疫苗株DEV和dDEV进行酶切。反应条件如下:分别取BamH I,EcoR I和BbvC I各20U，分别与DEV基因组DNA 8 μ g混和，于50 μ I体系中37°C作用I小时。用Bio-Rad公司CHEF Mapper? XA Pulsed Field系统进行脉冲电泳，脉冲电泳的条件为:电泳缓冲液位0.5x TBE，琼脂糖胶浓度为1%，程序为2K-70K。
[0062]拯获的病毒酶切图谱和亲本病毒相同，如图2所示。说明所选择的5粘粒组成功拯救DEV病毒。本发明人将所选择的5粘粒组成员分别命名为pFOSl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、PF0S5，该5粘粒克隆所包含的DEV DNA片段两端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接头，能相互重叠，且能拼接覆盖全DEV基因组(它们的重叠和覆盖模式可参见图9)，并且其中pF0S5包含DEV基因组的US7和US8基因以及它们之间的间隔区(US7和US8基因之间的间隔区的核苷酸序列参见SEQ ID N0:5)。关于该5粘粒系统本发明人已经申请专利，申请号为201010207207.8，题目为“鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆系统及其构建方法和应用”， 申请日期:为2010年6月13日。
[0063]实施例4.在DEV基因组的US7、US8基因之间的间隔区中插入SV40-E表达框架(SEQ ID NO:1)的重组突变粘粒的构建
[0064]基于上述实施例1-3结果，在所选择的5粘粒组成员pF0S5中DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区(SEQ ID NO:5)中，具体地，US7和US8基因之间的间隔区共223bp，本研究中，该间隔区缺失了其中第108至111位的四个核苷酸，代之以插入SV40-E表达框架(SV40-E表达框架的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，其中包含SV40启动子，参见图13，其中斜体加粗部分为E基因(SEQ ID NO:4))，构建I个重组突变粘粒，pF0S5us78 SV40 E (该突变粘粒的图谱如图8所示，其构建模式可参见图9)。在本研究中，本发明人发现，E基因的插入位置不影响其对鸭病毒性肠炎病毒的免疫效果。但E基因插入其他位置，是否会影响其对鸭病毒性肠炎病毒的保护效果需要实验来证明。
[0065]pF0S5us78 SV40 E粘粒的构建过程简述如下:
[0066]4.1 pUC ccdB kan 的构建:
[0067]用表1所示的三对引物(由TaKaRa公司合成)分别对Invitrogen公司GatewayVector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2 TlCompetent Cells试剂盒中提供的“RfA”(其中基因为aatRl-氯霉素-ccdB-aatR2)基因(SEQ ID NO:2)进行多重PCR扩增。
[0068]表1:用于克隆“Rfkan” (其中基因为aatRl-卡那霉素-ccdB_aatR2)基因的PCR引物
[0069]
【权利要求】
1.表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其保藏编号为CCTCC V201214。
2.根据权利要求1所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中在鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的US7和US8基因之间的间隔区中插入包含鸭坦布苏病毒E基因和SV40启动子序列的基因片段，所述基因片段的核苷酸序列为SEQ IDNO:1。
3.根据权利要求1或2所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述鸭坦布苏病毒E基因来源于PTD2010株病毒。
4.根据权利要求2所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述包含鸭坦布苏病毒E基因和SV40启动子序列的基因片段替换所述鸭病毒性肠炎病毒基因组的US7和US8基因之间的间隔区的第108至111位的四核苷酸片段。
5.根据权利要求2所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株，其中所述SV40启动子序列来源于包含SV40启动子的质粒,例如pSI质粒。
6.构建权利要求1所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的方法，所述方法包括下述步骤: (1)构建鸭病毒性肠炎病毒DEV基因组的Fosmid文库，并从中选择用于拯救鸭病毒性肠炎病毒的5粘粒组合系统，将它们分别命名为pFOSl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、pF0S5，其中PF0S5粘粒包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区； (2)利用步骤(1)中获得的包含鸭病毒性肠炎病毒基因组中的US7和US8基因以及它们之间的间隔区的粘粒PF0S5，在该粘粒的US7和US8基因之间的间隔区中插入包含鸭坦布苏病毒E基因和SV40启动子序列的基因片段SEQ ID NO:1，构建重组突变粘粒；和 (3)利用步骤(2)中获得的重组突变粘粒和步骤(1)中获得的5粘粒组合系统中的pFOSl、pF0S2、pF0S3和pF0S4共转染次代鸡胚成纤维细胞CEF，拯救出重组病毒株CCTCCV201214，将其命名为 rDEV-TE-tPAS。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中步骤(1)中得到的5粘粒组合系统中的每一个粘粒克隆所包含的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段两端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接头，相互重叠，并且拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒全基因组。
8.权利要求1所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株的应用，其用于制备预防鸭病毒性肠炎病毒和鸭坦布苏病毒引起的传染病的疫苗。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述鸭病毒性肠炎病毒和鸭坦布苏病毒引起的传染病包括鸭病毒性肠炎和鸭坦布苏病毒病。
10.一种疫苗，其包括权利要求1所述的表达分泌型鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株CCTCC V201214,以及药用佐剂、赋形剂。
【文档编号】C12N15/34GK103667198SQ201210331134
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月10日 优先权日:2012年9月10日
【发明者】陈化兰, 柳金雄, 陈普成, 姜永萍 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所