利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法。本发明是在基片的表面制备出分形结构的表面，然后将肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在所述的具有分形结构的表面上后放置在细胞培养板中，将待测样品滴加到所述的肿瘤细胞表面的特异性抗体的表面上，然后置于细胞培养箱中，由所述的肿瘤细胞表面的特异性抗体与所述的分形结构的协同作用，特异性捕获待测样品中的循环肿瘤细胞。本发明的基于分形结构的表面的捕获方法可用于癌症相关的细胞的捕获。本发明所述的方法可以有效提高循环肿瘤细胞的捕获效率，成本低廉，操作简单，可用于临床诊断。
【专利说明】利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法。
【背景技术】
[0002]癌症是导致人类死亡的第二大杀手。其中90%的死亡是由转移癌引起的。转移癌主要是由从初始癌变位置脱离的癌细胞引起的，这部分癌细胞通过血管或者淋巴管扩散到机体的其他组织或者器官，从而形成转移癌。癌细胞进入血液循环是实现癌症转移的最初阶段，为最终形成肿瘤的转移病灶提供了可能。这部分进入人体外周血中的癌细胞就是循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells)。通过检测外周血中的循环肿瘤细胞可以有效预测癌症转移的发生、进行癌症的早期诊断、预测癌症病人的生存几率以及监测治疗的效果等。因此，检测血液中的循环肿瘤细胞具有重要的临床应用价值，循环肿瘤细胞的检测对于癌症的早期诊断、病情监测、治疗预后等具有重要意义。
[0003]实现循环肿瘤细胞检测的前提是对血液中的循环肿瘤细胞进行捕获与分离。由于其在血液中的数量很少(每毫升几个到几十个)，循环肿瘤细胞的捕获与分离仍是一个巨大的挑战。目前，循环肿瘤细胞捕获与分离的方法主要是根据肿瘤细胞自身特殊的形貌与生物化学特征进行的，比如尺寸，密度和肿瘤细胞表面特殊表达的蛋白质。现有的捕获与分离技术主要包括ISET(Iso lation by size of epithelial tumor cells)技术(Am J Pathol2000，156，57 - 63)、密度梯度离心技术(Cytometry2002, 49，150 - 158)和免疫磁性分离技术(N Engl J Med 2004，351，781-91)。ISET技术利用肿瘤细胞与血细胞尺寸之间的差异进行循环肿瘤细胞的分离，但是该技术分离纯度低，难以满足实际需求。密度梯度离心技术则是基于血液中各种细胞密度的差异，红细胞、中性白细胞等密度较大的细胞迁移至底部，肿瘤细胞则仍处于顶部，从而达到分离的目的。但是该技术存在的问题同样是纯度较低，而且在处理与转移的过程中会不可避免地损失循环肿瘤细胞，进而影响捕获效率。免疫磁性分离技术是目前研究和应用最广泛的技术之一，其原理是将特异性抗体修饰在磁性颗粒表面，与循环肿瘤细胞表面抗原结合后在磁场作用下实现捕获与分离的目的，该技术能够实现较高的捕获效率，但是由于其过程复杂、费用较高而限制了其应用。
[0004]在最新的生物学研究领域，王树涛等(Angew.Chem.1nt.Ed., 2009, 48, 8970 -8973)率先将三维纳米结构基片应用于循环肿瘤细胞检测领域。该技术通过增强细胞表面的纳米组分(例如，微绒毛、丝状伪足等)与三维纳米结构之间的相互作用极大地提高了其捕获效率。随后，导电聚合物(Adv.Mater.2011,23，4788-4792)、PDMS (Cancer2012，118，1145-54)和 TiO2 纳米纤维(Adv.Mater.2012，24，2756-2760)等都用于三维纳米结构的构建从而增强循环肿瘤细胞的捕获效率。由于其捕获效率高、灵敏度高，这一技术越来越引起科学家的关注。但是该技术存在成本较高、使用不便等缺点，而且该技术背后的基本设计原则尚不清楚。因此，迫切需求一种新的高效率、高特异性的循环肿瘤细胞的捕获技术。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法。
[0006]本发明的利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法，其基本原理是在基片的表面制备出所需的分形结构的表面，将肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在该具有所需的分形结构的表面上，将待测样品滴加到该肿瘤细胞表面的特异性抗体的表面上，通过待测样品中的肿瘤细胞表面的特异性抗原与固定在该具有所需的分形结构的表面上的肿瘤细胞表面的特异性抗体之间的特异性结合，实现循环肿瘤细胞的特异性捕获，通过待测样品中的肿瘤细胞表面的纳米组分(例如:微绒毛、丝状伪足等)与所述基片表面的分形结构之间的相互作用，提高循环肿瘤细胞的特异性捕获效率，从而达到高效、高特异性循环肿瘤细胞捕获的目的。
[0007]本发明的利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0008](I)在基片的表面制备出所需的分形结构的表面；
[0009]所述的分形结构选自枝状分形结构、花椰菜状分形结构或海胆状分形结构中的一种；
[0010](2)将肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在步骤(1)得到的基片上的具有所需的分形结构的表面上，然后放置在细胞培养板中；
[0011](3)将待测样品滴加到步骤(2)得到的基片上的具有所需的分形结构的表面所固定的肿瘤细胞表面的特异性抗体的表面上，然后置于细胞培养箱中，由所述的肿瘤细胞表面的特异性抗体与所述的分形结构的协同作用，特异性捕获待测样品中的循环肿瘤细胞。
`[0012]所述的基片的材料选自导电金属、导电无机非金属、导电无机非金属化合物、非导电无机非金属化合物和非导电聚合物中的一种。所述的导电金属选自金、银、钼、IE、铜、铁、锌和铝中的一种。所述的导电无机非金属是晶体硅。所述的导电无机非金属化合物是氧化铟锡(ITO)玻璃。所述的非导电无机非金属化合物是石英或普通玻璃。所述的非导电聚合物选自聚二甲基硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乳酸和聚乙烯醇中的至少一种。
[0013]所述的分形结构的表面的材料选自金属、金属化合物、无机非金属、无机非金属化合物、导电聚合物和非导电聚合物中的一种。所述的金属选自金、银、钼、钯、铜、铁、锌和铝中的一种。所述的金属化合物选自氧化铜、氧化铁、氧化锌和二氧化钛中的一种。所述的无机非金属是晶体硅。所述的无机非金属化合物是石英。所述的导电聚合物选自聚噻吩、聚吡咯、聚苯胺和聚苯中的一种。所述的非导电聚合物选自聚二甲基硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乳酸和聚乙烯醇中的至少一种。
[0014]所述的在基片的表面制备出所需的分形结构的表面的方法有多种，包括以下所述的方法:
[0015]在导电金属基片、导电无机非金属基片或导电无机非金属化合物基片的表面制备出所述的分形结构的表面为金属材料的，较佳地是采用电化学沉积的方法进行制备，即采用传统的三电极体系，以钼丝或钼片作为对电极，以银/氯化银电极作为参比电极，以所述的导电金属基片、所述的导电无机非金属基片或所述的导电无机非金属化合物基片作为工作电极，以氯金酸水溶液、硝酸银水溶液、氯钼酸水溶液、氯钯酸水溶液、硝酸铜水溶液、氯化亚铁水溶液、硫酸锌水溶液或硫酸招水溶液等作为电解液(如以金作为基片可采用氯金酸水溶液作为电解液，还可以选择其它所述的电解液)，通过调整工作电压(-0.1V~-0.5V)以及电解液中相应酸根离子的浓度(0.01mol/L~2mol/L)，室温下电化学沉积20分钟~180分钟，即可在所述的导电金属基片、所述的导电无机非金属基片或所述的导电无机非金属化合物基片的表面可分别制备出枝状分形结构的表面、花椰菜状分形结构的表面或海胆状分形结构的表面。
[0016]在导电金属基片、导电无机非金属基片或导电无机非金属化合物基片的表面制备出所述的分形结构的表面为导电聚合物材料的，对于以导电聚合物材料为聚噻吩作为分形结构的表面而言，较佳地采用文献(于伟利，电沉积制备聚噻吩有序微结构及有机太阳能电池.吉林大学，2009.)所述的方法，即可在所述的导电金属基片、所述的导电无机非金属基片或所述的导电无机非金属化合物基片的表面制备出花椰菜状分形结构的表面或海胆状分形结构的表面；对于以导电聚合物材料为聚吡咯作为分形结构的表面而言，较佳地采用文献(王杰，电化学合成聚吡咯膜的电学性能与应用.西安交通大学，2008.)所述的方法，即 可在所述的导电金属基片、所述的导电无机非金属基片或所述的导电无机非金属化合物基片的表面制备出花椰菜状分形结构的表面或海胆状分形结构的表面；对于以导电聚合物材料为聚苯胺作为分形结构的表面而言，较佳地采用文献(J.Phys.Chem.C 2010, 114, 8062 - 8067)所述的方法，即可在所述的导电金属基片、所述的导电无机非金属基片或所述的导电无机非金属化合物基片的表面制备出海胆状分形结构的表面；对于以导电聚合物材料为聚苯作为分形结构的表面而言，较佳地采用文献(科学通报，2003，48, 35-37)所述的方法,即可在所述的导电金属基片、所述的导电无机非金属基片或所述的导电无机非金属化合物基片的表面制备出海胆状分形结构的表面。
[0017]在导电无机非金属基片、导电无机非金属化合物基片或非导电无机非金属化合物基片的表面制备出所述的分形结构的表面为金属化合物材料的，对于以金属化合物为氧化铜作为分形结构的表面而言，较佳地采用文献(陕西师范大学学报(自然科学版)，2009, 37，60-62)所述的方法，即可在所述的导电无机非金属基片、所述的导电无机非金属化合物基片或所述的非导电无机非金属化合物基片的表面制备出花椰菜状分形结构的表面或海胆状分形结构的表面；对于以金属化合物为氧化铁作为分形结构的表面而言，较佳地采用文献(东北师大学报(自然科学版)，2012，44，155-157)所述的方法，即可在所述的导电无机非金属基片、所述的导电无机非金属化合物基片或所述的非导电无机非金属化合物基片的表面制备出海胆状分形结构的表面；对于以金属化合物为氧化锌作为分形结构的表面而言，较佳地采用文献(Adv.Funct.Mater.，2006, 16，335 - 344)所述的方法，即可在所述的导电无机非金属基片、所述的导电无机非金属化合物基片或所述的非导电无机非金属化合物基片的表面制备出枝状分形结构的表面或海胆状分形结构的表面；对于以金属化合物为二氧化钛作为分形结构的表面而言，较佳地采用文献(ACS Nano, 2009, 3，1212-1218)所述的方法，即可在所述的导电无机非金属基片、所述的导电无机非金属化合物基片或所述的非导电无机非金属化合物基片的表面制备出枝状分形结构的表面或海胆状分形结构的表面。
[0018]在导电无机非金属基片的表面制备出所述的分形结构的表面为无机非金属材料的(此时所述的基片是与所述的分形结构的表面的化学组成一致)，或者在非导电无机非金属化合物基片的表面制备出所述的分形结构的表面为无机非金属化合物材料的(此时所述的基片是与所述的分形结构的表面的化学组成一致)，均较佳地采用文献(Macromol.RapidCommun.2005, 26, 1805-1809)所述的方法，即可在所述的导电无机非金属基片或所述的非导电无机非金属化合物基片的表面制备出花椰菜状分形结构的表面。
[0019]在非导电聚合物基片的表面制备出所述的分形结构的表面为非导电聚合物材料的(此时所述的基片是与所述的分形结构的表面的化学组成一致)，采用文献(Macromol.Rapid Commun.2005, 26，1805 - 1809)所述的方法，即可在所述的非导电聚合物基片的表面制备出花椰菜状分形结构的表面；采用文献(Angew.Chem.1nt.Ed.2002, 41，1221-1223)所述的方法，即可在所述的非导电聚合物基片的表面制备出枝状分形结构的表面。
[0020]所述的将肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在步骤(1)得到的基片上的具有所需的分形结构的表面上的方法有多种，较佳的固定方法可按照如下步骤进行固定:
[0021](a)将一端接有功能基团的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将表面为具有所需的分形结构的表面的基片浸泡在上述一端接有功能基团的生物素的浓度为2mM的水溶液中(表面为具有所需的分形结构的表面的基片在使用前用去离子水冲洗干净；优选浸泡的时间为12小 时以上);取出表面为具有所需的分形结构的表面的基片，用去离子水洗漆，干燥；
[0022](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释为10 μ g/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的表面为具有所需的分形结构的表面的基片浸泡在上述10 μ g/mL的链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置(优选室温下放置30分钟左右)；取出表面具有为具有所需的分形结构的表面的基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0023](c)将肿瘤细胞表面的特异性抗体(如抗EpCAM抗体)用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的表面为具有所需的分形结构的表面的基片的表面上(如取25 μ L滴加到表面为具有所需的分形结构的表面的基片的表面上(面积为Icm2))，室温放置(优选室温下放置30分钟)。
[0024]所述的将肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在步骤(1)得到的基片上的具有所需的分形结构的表面上，其固定在具有所需的分形结构的表面上的肿瘤细胞表面的特异性抗体的固定量不少于0.1 μ g/cm2。
[0025]所述的分形结构的表面的表征参数分维的范围是:2 <分维< 3。
[0026]所述的肿瘤细胞表面的特异性抗体为抗EpCAM抗体。
[0027]所述的一端接有功能基团的生物素、链霉亲和素以及抗EpCAM抗体均为市售产
品O
[0028]所述的一端接有功能基团的生物素中的功能基团为巯基，羧基或者氨基中的一种。
[0029]本发明建立了一种利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法，此方法(I)证明了分形结构的表面可以实现循环肿瘤细胞的高效捕获；(2)特异性强，可以捕获特异性肿瘤细胞，减少非特异性肿瘤细胞的粘附。[0030]本发明的利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法可用于癌症相关的细胞的捕获。所述的方法可以有效提高循环肿瘤细胞的捕获效率，成本低廉，操作简单，可用于临床诊断。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1a.本发明实施例1制备的具有枝状分形结构的金表面的表面形貌的大面积扫描电镜照片；图1b是具有枝状分形结构的金表面的单个颗粒的扫描电镜的放大照片。
[0032]图2.本发明实施例1的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在具有枝状分形结构的金表面的基片上的过程示意图。
[0033]图3.本发明实施例1的捕获效率柱状图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合实施例，对本发明作进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不应用于限制本发明的保护范围。
[0035]实施例1
[0036]本实施例所制备的具有枝状分形结构的金表面的分维为2.73 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Jurkat T为待 捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0037](I)采用电化学沉积的方法，在晶体硅基片的表面制备出具有枝状分形结构的金表面
[0038]采用传统的三电极体系，钼丝作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极，晶体硅基片作为工作电极，氯金酸水溶液(lmg/mL)作为电解液(氯离子浓度为0.01mo/L)，在工作电压为-0.5V下电化学沉积20分钟即在晶体硅基片的表面制备出具有枝状分形结构的金表面。表面形貌的大面积扫描电镜照片如图1a所示，单个颗粒的扫描电镜的放大照片如图1b所示。
[0039](2)固定过程如图2所示，将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的晶体硅基片上的具有枝状分形结构的金表面上
[0040](a)将一端接有巯基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有枝状分形结构的金表面的晶体娃基片浸泡在上述一端接有疏基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有枝状分形结构的金表面的晶体硅基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有枝状分形结构的金表面的晶体硅基片，用去离子水洗涤，干燥；
[0041](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有枝状分形结构的金表面的晶体硅基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有枝状分形结构的金表面的晶体硅基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0042](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有枝状分形结构的金表面的晶体硅基片上，室温放置30分钟。
[0043](3)准备待测样品[0044]取MCF7细胞悬浮液20 μ L，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用细胞培养基DMEM稀释至I X IO5个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
[0045]取Jurkat T细胞悬浮液20 μ L，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用细胞培养基1640稀释至IXlO5个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。[0046](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0047]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的晶体硅基片上的具有枝状分形结构的金表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个lcm2的具有枝状分形结构的金表面的晶体硅基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与枝状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的晶体硅基片上的具有枝状分形结构的金表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0048]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整金表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0049](5)捕获效果的评价
[0050]将捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的金表面的晶体硅基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为
0.4%的Triton-X 100水溶液浸泡10分钟，2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的金表面的晶体硅基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的金表面的晶体硅基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0051]捕获了循环肿瘤细胞的平整金表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0052]实验结果表明，该具有枝状分形结构的金表面的MCF7细胞的捕获效率为63.3%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为1.2% ;对照实验中平整金表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.8%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为0.3%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。如图3所示的捕获效率柱状图。
[0053]实施例2
[0054]本实施例所制备的具有花椰菜状分形结构的金表面的分维为2.54 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Daudi为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0055](I)采用电化学沉积的方法，在氧化铟锡(ΙΤ0)玻璃基片的表面制备出具有花椰菜状分形结构的金表面
[0056]采用传统的三电极体系，钼片作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极，氧化铟锡(ITO)玻璃基片作为工作电极，氯金酸水溶液(lmg/mL)作为电解液(氯离子浓度为
0.9mo/L)，在工作电压为-0.15V下电化学沉积90分钟即可在氧化铟锡(ITO)玻璃基片的表面制备出具有花椰菜状分形结构的金表面。
[0057](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜状分形结构的金表面上[0058](a)将一端接有巯基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有花椰菜状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片浸泡在上述一端接有巯基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有花椰菜状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有花椰菜状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片，用去离子水洗涤，干燥；
[0059](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有花椰菜状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有花椰菜状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0060](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25 μ L滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有花椰菜状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上，室温放置30分钟。
[0061](3)准备待测样品
[0062]取MCF7细胞悬浮液20 μ L，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用细胞培养基DMEM稀释至I X IO5个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
[0063]取Daudi细胞悬浮液20 μ L，用细胞计数器计数并计算其浓度，取一定量上述细胞悬浮液，用细胞培养基1640稀释至I X IO5个细胞/mL，混合均匀，室温下保存。
[0064](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0065]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的`氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜状分形结构的金表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个Icm2的具有花椰菜状状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与花椰菜状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜状分形结构的金表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0066]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整金表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0067](5)捕获效果的评价
[0068]将捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟，2 μ g/mLDAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的金表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0069]捕获了循环肿瘤细胞的平整金表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0070]实验结果表明，该具有花椰菜状分形结构的金表面的MCF7细胞的捕获效率为35.3%，Daudi细胞的捕获效率仅为0.9% ;对照实验中平整金表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.1%，Daudi细胞的捕获效率仅为0.2%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0071]实施例3
[0072]本实施例所制备的具有海胆状分形结构的金表面的分维为2.23 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Jurkat T为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0073](I)采用电化学沉积的方法，在金基片的表面制备出具有海胆状分形结构的金表面
[0074]采用传统的三电极体系，钼片作为对电极，银/氯化银电极作为参比电极，金基片作为工作电极，氯金酸水溶液(lmg/mL)作为电解液(氯离子浓度为2mo/L)，在工作电压为-0.1V下电化学沉积180分钟即可在金基片的表面制备出具有海胆状分形结构的金表面的制备。
[0075](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的金基片上的具有海胆状分形结构的金表面 上
[0076](a)将一端接有巯基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有海胆状分形结构的金表面的金基片浸泡在上述一端接有巯基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有海胆状分形结构的金表面的金基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有海胆状分形结构的金表面的金基片，用去离子水洗涤，干燥；
[0077](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有海胆状分形结构的金表面的金基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有海胆状分形结构的金表面的金基片，用磷酸盐缓冲液洗漆;
[0078](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有海胆状分形结构的金表面的金基片上，室温放置30分钟。
[0079](3)准备待测样品
[0080]同实施例1。
[0081](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0082]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的金基片上的具有海胆状分形结构的金表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个Icm2的具有海胆状分形结构的金表面的金基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与海胆状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的金基片上的具有海胆状分形结构的金表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0083]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整金表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0084](5)捕获效果的评价
[0085]将捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的金表面的金基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟,从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的金表面的金基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的金表面的金基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0086]捕获了循环肿瘤细胞的平整金表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0087]实验结果表明，该具有枝状分形结构的金表面的MCF7细胞的捕获效率为30.9%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为0.7%;对照实验中平整金表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.5%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为0.2%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0088]实施例4
[0089]本实施例所制备的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的分维为2.51 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Daudi为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0090](I)采用文献(王杰，电化学合成聚吡咯膜的电学性能与应用.西安交通大学，2008.)所述的方法即可在氧化铟锡(ITO)玻璃基片的表面制备出具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面。
[0091](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面上
[0092](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片在使用前用去离子水冲洗干净);取出具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片，用去`离子水洗涤，干燥；
[0093](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0094](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上，室温放置30分钟。
[0095](3)准备待测样品
[0096]同实施例2。
[0097](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0098]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养皿放置3个Icm2的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与花椰菜状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0099]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整聚吡咯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0100](5)捕获效果的评价
[0101]将捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟，2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ΙΤ0)玻璃基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的氧化铟锡(ΙΤ0)玻璃基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0102]捕获了循环肿瘤细胞的平整聚吡咯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0103]实验结果表明，该具有花椰菜状分形结构的聚吡咯表面的MCF7细胞的捕获效率为38.8%，Daudi细胞的捕获效率仅为0.7% ;对照实验中平整聚吡咯表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.1%，Daudi细胞的捕获效率仅为0.2%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0104]实施例5
[0105]本实施例所制备的具有海胆状分形结构的聚苯表面的分维为2.41 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Daudi为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0106](1)采用文献(科学通报，2003, 48，35_37)所述的方法即可在氧化铟锡(ITO)玻璃基片的表面制备出具有海胆状分形结构的聚苯表面。
[0107](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有海胆状分形结构的聚苯表面上
[0108](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片，用去离子水洗涤，干燥；
[0109](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0110](C)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至lOyg/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上，室温放置30分钟。
[0111](3)准备待测样品[0112]同实施例2。
[0113](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0114]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有海胆状分形结构的聚苯表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养皿放置3个Icm2的具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与海胆状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有海胆状分形结构的聚苯表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0115]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整聚苯表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0116](5)捕获效果的评价
[0117]将捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟，2 μ g/mLDAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的聚苯表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上所捕获的循 环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0118]捕获了循环肿瘤细胞的平整聚苯表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0119]实验结果表明，该具有海胆状分形结构的聚苯表面的MCF7细胞的捕获效率为37.8%, Daudi细胞的捕获效率仅为0.5% ;对照实验中平整聚苯表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.3%，Daudi细胞的捕获效率仅为0.3%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0120]实施例6
[0121]本实施例所制备的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的分维为2.41 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Daudi为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0122](1)采用文献(1 Phys.Chem.C 2010, 114，8062-8067)所述的方法即可在氧化铟锡(ITO)玻璃基片的表面制备出具有海胆状分形结构的聚苯胺表面。
[0123](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面上
[0124](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片在使用前用去离子水冲洗干净);取出具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片，用去离子水洗涤，干燥；
[0125](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ΙΤ0)玻璃基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0126](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上，室温放置30分钟。
[0127](3)准备待测样品
[0128]同实施例2。
[0129](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0130]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养皿放置3个Icm2的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与海胆状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0131]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整聚苯胺表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0132](5)捕获效果的评价
`[0133]将捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ITO)玻璃基片上用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟，2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ΙΤ0)玻璃基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的氧化铟锡(ΙΤ0)玻璃基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0134]捕获了循环肿瘤细胞的平整聚苯胺表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0135]实验结果表明，该具有海胆状分形结构的聚苯胺表面的MCF7细胞的捕获效率为40.1%，Daudi细胞的捕获效率仅为0.9% ;对照实验中平整聚苯胺表面的MCF7细胞的捕获效率仅为1.8%，Daudi细胞的捕获效率仅为1.2%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0136]实施例7
[0137]本实施例所制备的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的分维为2.51 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Daudi为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0138](I)采用文献(于伟利，电沉积制备聚噻吩有序微结构及有机太阳能电池.吉林大学，2009.)所述的方法即可在金基片的表面制备出具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面。
[0139](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的金基片上的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面上
[0140](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片，用去离子水洗涤，干燥；
[0141](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0142](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片上，室温放置30分钟。
[0143](3)准备待测样品
[0144]同实施例2。
[0145](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0146]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到 的金基片上的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养皿放置3个Icm2的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与花椰菜状状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的金基片上的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0147]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整聚噻吩表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0148](5)捕获效果的评价
[0149]将捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片上用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟,从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的金基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0150]捕获了循环肿瘤细胞的平整聚噻吩表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0151]实验结果表明，该具有花椰菜状分形结构的聚噻吩表面的MCF7细胞的捕获效率为39.8%，Daudi细胞的捕获效率仅为0.9% ;对照实验中平整聚噻吩表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.3%，Daudi细胞的捕获效率仅为0.8%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0152]实施例8[0153]本实施例所制备的具有枝状分形结构的氧化锌表面的分维为2.81 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Jurkat T为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0154](I)采用文献(Adv.Funct.Mater.，2006, 16，335 - 344)所述的方法即可在普通玻璃基片的表面制备出具有枝状分形结构的氧化锌表面。
[0155](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的普通玻璃基片上的具有枝状分形结构的氧化锌表面上
[0156](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片，用去离子水洗涤，干燥；
[0157](b )将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0158](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片上，室温放置30分钟。
[0159](3)准备待测样品
[0160]同实施例1。
[0161](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0162]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的普通玻璃基片上的具有枝状分形结构的氧化锌表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个Icm2的具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与枝状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的普通玻璃基片上的具有枝状分形结构的氧化锌表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0163]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整氧化锌表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0164](5)捕获效果的评价
[0165]将捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟,从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的氧化锌表面的普通玻璃基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。[0166]捕获了循环肿瘤细胞的平整氧化锌表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0167]实验结果表明，该具有枝状分形结构的氧化锌表面的MCF7细胞的捕获效率为65.3%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为1.1% ;对照实验中平整氧化锌表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.4%, Jurkat T细胞的捕获效率仅为1.3%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0168]实施例9
[0169]本实施例所制备的具有海胆状分形结构的氧化铜表面的分维为2.21 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Jurkat T为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0170](I)采用文献(陕西师范大学学报(自然科学版)，2009，37，60-62)所述的方法即可在普通玻璃基片的表面制备出具有海胆状分形结构的氧化铜表面。
[0171](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的普通玻璃基片上的具有海胆状分形结构的氧化铜表面上
[0172](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片，用去离子水洗漆，干燥；
[0173](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
`[0174](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片上，室温放置30分钟。
[0175](3)准备待测样品
[0176]同实施例1。
[0177](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0178]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的普通玻璃基片上的具有海胆状分形结构的氧化铜表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个Icm2的具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与海胆状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的普通玻璃基片上的具有海胆状分形结构的氧化铜表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0179]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整氧化铜表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0180](5)捕获效果的评价
[0181]将捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟,从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的氧化铜表面的普通玻璃基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0182]捕获了循环肿瘤细胞的平整氧化铜表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0183]实验结果表明，该具有海胆状分形结构的氧化铜表面的MCF7细胞的捕获效率为35.3%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为1.4% ;对照实验中平整氧化铜表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.4%, Jurkat T细胞的捕获效率仅为1.3%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0184]实施例10
[0185]本实施例所制备的具有海胆状分形结构的氧化铁表面的分维为2.23 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Jmkat T为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0186](I)采用文献(东北师大学报(自然科学版)，2012，44，155-157)所述的方法即可在普通玻璃基片的表面制备出具有海胆状分形结构的氧化铁表面。
[0187](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的普通玻璃基片上的具有海胆状分形结构的氧化铁表面上
[0188](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有海胆状分形结构的氧化铁表面的`普通玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有海胆状分形结构的氧化铁表面的普通玻璃基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有海胆状分形结构的氧化铁表面的普通玻璃基片，用去离子水洗漆，干燥；
[0189](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有海胆状分形结构的氧化铁表面的普通玻璃基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有海胆状分形结构的氧化铁表面的普通玻璃基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0190](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有海胆状分形结构的氧化铁表面的普通玻璃基片上，室温放置30分钟。
[0191](3)准备待测样品
[0192]同实施例1。
[0193](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0194]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的普通玻璃基片上的具有海胆状分形结构的氧化铁表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个Icm2的具有海胆状分形结构的氧化铁表面的普通玻璃基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与海胆状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的普通玻璃基片上的具有海胆状分形结构的氧化铁表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0195]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整氧化铁表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0196](5)捕获效果的评价
[0197]将捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的氧化铁表面的普通玻璃基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟,从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的氧化铁表面的普通玻璃基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有海胆状分形结构的氧化铁表面的普通玻璃基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0198]捕获了循环肿瘤细胞的平整氧化铁表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0199]实验结果表明，该具有海胆状分形结构的氧化铁表面的MCF7细胞的捕获效率为29.3%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为1.5% ;对照实验中平整氧化铁表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.1%，Jmkat T细胞的捕获效率仅为0.3%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0200]实施例11 [0201]本实施例所制备的具有枝状分形结构的二氧化钛表面的分维为2.83 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Jurkat T为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0202](I)采用文献(ACS Nano, 2009, 3，1212 - 1218)所述的方法即可在普通玻璃基片的表面制备出具有枝状分形结构的二氧化钛表面。
[0203](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的普通玻璃基片上的具有枝状分形结构的二氧化钛表面的基片上
[0204](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片，用去离子水洗漆，干燥；
[0205](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0206](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片上，室温放置30分钟。
[0207](3)准备待测样品
[0208]同实施例1。[0209](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0210]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的普通玻璃基片上的具有枝状分形结构的二氧化钛表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个Icm2的具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与枝状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的普通玻璃基片上的具有枝状分形结构的二氧化钛表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0211]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整二氧化钛表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0212](5)捕获效果的评价
[0213]将捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟,从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的二氧化钛表面的普通玻璃基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0214]捕获了循环肿瘤细胞的平整二氧化钛表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0215]实验结果表明，该具有枝状分形结构的二氧化钛表面的MCF7细胞的捕获效率为69.3%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为1.9% ;对照实验中平整二氧化钛表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.1%, Jurkat T细胞的捕获效率仅为0.6%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0216]实施例12
[0217]本实施例所制备的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的分维为2.51 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Daudi为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0218](I)采用文献(Macromol.Rapid Commun.2005, 26，1805 - 1809)所述的方法即可在晶体硅基片的表面制备出具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面。
[0219](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的晶体硅基片上的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面上
[0220](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片，用去离子水洗漆，干燥；
[0221](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0222](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片上，室温放置30分钟。
[0223](3)准备待测样品
[0224]同实施例2。
[0225](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0226]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的晶体硅基片上的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个Icm2的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与花椰菜状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的晶体硅基片上的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0227]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整晶体硅表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0228](5)捕获效果的评价
[0229]将捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗 3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟,从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的晶体硅基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0230]捕获了循环肿瘤细胞的平整晶体硅表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0231]实验结果表明，该具有花椰菜状分形结构的晶体硅表面的MCF7细胞的捕获效率为41.3%，Daudi细胞的捕获效率仅为1.5% ;对照实验中平整金表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.6%，Daudi细胞的捕获效率仅为0.7%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0232]实施例13
[0233]本实施例所制备的具有花椰菜状分形结构的石英表面的分维为2.57 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Daudi为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0234](I)采用文献(Macromol.Rapid Commun.2005, 26，1805 - 1809)所述的方法即可在石英基片的表面制备出具有花椰菜状分形结构的石英表面。
[0235](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的石英基片上的具有花椰菜状分形结构的石英表面上
[0236](a)将一端接有羧基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有花椰菜状分形结构的石英表面的石英基片浸泡在上述一端接有羧基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有花椰菜状分形结构的石英表面的石英基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有花椰菜状分形结构的石英表面的石英基片，用去离子水洗涤，干燥；
[0237](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有花椰菜状分形结构的石英表面的石英基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有花椰菜状分形结构的石英表面的石英基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0238](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的具有花椰菜状分形结构的石英表面的石英基片上，室温放置30分钟。
[0239](3)准备待测样品
[0240]同实施例2。
[0241](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0242]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的石英基片上的具有花椰菜状分形结构的石英表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养皿放置3个Icm2的具有花椰菜状状分形结构的金表面的石英基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与花椰菜状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的石英基片上的具有花椰菜状分形结构的石英表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0243]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整石英表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0244](5)捕获效果的评价`
[0245]将捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的石英表面的石英基片上用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟,从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的石英表面的石英基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有花椰菜状分形结构的石英表面的石英基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0246]捕获了循环肿瘤细胞的平整石英表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0247]实验结果表明，该具有花椰菜状分形结构的石英表面的MCF7细胞的捕获效率为51.7%，Daudi细胞的捕获效率仅为1.9% ;对照实验中平整石英表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.4%，Daudi细胞的捕获效率仅为1.2%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0248]实施例14
[0249]本实施例所制备的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的分维为2.81 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Jurkat T为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:[0250](I)采用文献(Angew.Chem.1nt.Ed.2002, 41，1221-1223)所述的方法即可在聚乙烯醇基片的表面制备出具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面。
[0251](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的聚乙烯醇基片上的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面上
[0252](a)将一端接有氨基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片浸泡在上述一端接有氨基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片在使用前用去离子水冲洗干净)；取出具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片，用去离子水洗漆，干燥；
[0253](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0254](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片上，室温放置30分钟。
[0255](3)准备待测样品
[0256]同实施例1。
[0257](4)捕获待 测样品中的循环肿瘤细胞
[0258]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的聚乙烯醇基片上的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个Icm2的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与枝状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的聚乙烯醇基片上的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0259]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整聚乙烯醇表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0260](5)捕获效果的评价
[0261]将捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟,2 μ g/mL DAPI水溶液浸泡15分钟,从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的聚乙烯醇基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0262]捕获了循环肿瘤细胞的平整聚乙烯醇表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0263]实验结果表明，该具有枝状分形结构的聚乙烯醇表面的MCF7细胞的捕获效率为71.5%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为1.5% ;对照实验中平整聚乙烯醇表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.5%, Jurkat T细胞的捕获效率仅为0.8%，这些数据表明该方法可以实现循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
[0264]实施例15[0265]本实施例所制备的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的分维为
2.74 ;以循环肿瘤细胞MCF7和Jurkat T为待捕获的循环肿瘤细胞为例，对本发明的捕获体系作进一步阐述和验证。利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法包括以下步骤:
[0266](I)采用文献(Angew.Chem.1nt.Ed.2002, 41，1221-1223)所述的方法即可在聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片的表面制备出具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面。
[0267](2)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体固定在步骤(1)得到的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面上
[0268](a)将一端接有氨基的生物素用去离子水稀释为2mM的水溶液，室温下，将具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片浸泡在上述一端接有氨基的生物素的浓度为2mM的水溶液中浸泡12小时(具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片在使用前用去离子水冲洗干净);取出具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片，用去离子水洗漆，干燥；
[0269](b)将链霉亲和素用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液稀释为10 μ g/mL的磷酸盐溶液，然后将步骤(a)干燥后得到的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片浸泡在链霉亲和素的磷酸盐溶液中，室温下放置30分钟；取出具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片，用磷酸盐缓冲液洗涤；
[0270](c)将肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至10μ g/mL，然后取25yL滴加到步骤(b)用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后得到的面积为Icm2的的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上，室温放置30分钟。
[0271](3)准备待测样品
[0272]同实施例1。
[0273](4)捕获待测样品中的循环肿瘤细胞
[0274]分别将步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液3mL滴加到放置在细胞培养板(直径3.5cm)中的步骤(2)得到的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上(每个细胞培养板放置3个Icm2的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片)，然后置于细胞培养箱中，由肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体与枝状分形结构的协同作用，特异性捕获滴加到步骤(2)得到的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面所固定的肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的表面上的步骤(3)混合均匀后得到的细胞悬浮液中的循环肿瘤细胞，捕获时间是45分钟。
[0275]作为对照实验，固定了肿瘤细胞表面的抗EpCAM抗体的平整聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面也进行相同的捕获待测样品中的循环肿瘤细胞实验。
[0276](5)捕获效果的评价
[0277]将捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，然后用质量浓度为4%的多聚甲醛水溶液浸泡20分钟，质量浓度为0.4%的Triton-XlOO水溶液浸泡10分钟，2 μ g/mLDAPI水溶液浸泡15分钟，从而达到染色的目的。用Nikon倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(每个捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片选取中间部分10个不同的位置)，并对捕获了循环肿瘤细胞的具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物基片上所捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获效率。
[0278]捕获了循环肿瘤细胞的平整聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面也按上述步骤进行，并计算捕获效率。
[0279]实验结果表明，该具有枝状分形结构的聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的MCF7细胞的捕获效率为67.4%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为2.1% ;对照实验中平整聚苯乙烯/聚乳酸共聚物表面的MCF7细胞的捕获效率仅为2.3%，Jurkat T细胞的捕获效率仅为1.8%，这些数据表明该方法可以实现`循环肿瘤细胞的高效特异性捕获。
【权利要求】
1.一种利用分形结构的表面进行循环肿瘤细胞的特异性捕获的方法，其特征是，所述的方法包括以下步骤: (1)在基片的表面制备出分形结构的表面； (2)将肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在步骤(1)得到的基片上的具有分形结构的表面上，然后放置在细胞培养板中； (3)将待测样品滴加到步骤(2)得到的基片上的具有分形结构的表面所固定的肿瘤细胞表面的特异性抗体的表面上，然后置于细胞培养箱中，由所述的肿瘤细胞表面的特异性抗体与所述的分形结构的协同作用，特异性捕获待测样品中的循环肿瘤细胞； 所述的分形结构选自枝状分形结构、花椰菜状分形结构或海胆状分形结构中的一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是:所述的将肿瘤细胞表面的特异性抗体固定在步骤(1)得到的基片上的具有分形结构的表面上，其固定在具有分形结构的表面上的肿瘤细胞表面的特异性抗体的固定量不少于0.1 μ g/cm2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的分形结构的表面的表征参数分维的范围是:2<分维<3。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的肿瘤细胞表面的特异性抗体为抗EpCAM抗体。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的基片的材料选自导电金属、导电无机非金属、导电无机非金属化合物、非导电无机非金属化合物和非导电聚合物中的一种。
6.根据权利要求5所述 的方法，其特征是:所述的导电金属选自金、银、钼、钯、铜、铁、锌和铝中的一种； 所述的导电无机非金属是晶体硅； 所述的导电无机非金属化合物是氧化铟锡玻璃； 所述的非导电无机非金属化合物是石英或普通玻璃； 所述的非导电聚合物选自聚二甲基硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乳酸和聚乙烯醇中的至少一种。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是:所述的分形结构的表面的材料选自金属、金属化合物、无机非金属、无机非金属化合物、导电聚合物和非导电聚合物中的一种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是:所述的金属选自金、银、钼、钯、铜、铁、锌和招中的一种； 所述的金属化合物选自氧化铜、氧化铁、氧化锌和二氧化钛中的一种； 所述的无机非金属是晶体硅； 所述的无机非金属化合物是石英； 所述的导电聚合物选自聚噻吩、聚吡咯、聚苯胺和聚苯中的一种； 所述的非导电聚合物选自聚二甲基硅氧烷、聚(甲基)丙烯酸酯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乳酸和聚乙烯醇中的至少一种。
【文档编号】C12N5/09GK103667191SQ201210330287
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2012年9月7日
【发明者】王树涛, 张鹏超, 陈立, 江雷 申请人:中国科学院化学研究所