专利名称：基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗冻剂的制备方法，特别涉及一种来源于丝胶蛋白的抗冻剂，用于防止肉类冻藏过程中发生蛋白冷冻变性。
背景技术：
鱼糜是机械去骨的鱼肉经水洗后加入冷冻保护剂以保持较长的冷冻货架期的鱼肉制品，是生产鱼糜制品的主要原料。目前日本、美国、俄罗斯、泰国和韩国都十分重视冷冻鱼糜的生产，并成为世界冷冻鱼糜生产大国。近年来，以淡水鱼为原料生产冷冻鱼糜及鱼糜制品引起国内外食品科技工作者的兴趣。鱼类的蛋白可分为三种，分别是肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和基质蛋白。其中肌浆蛋白是水溶性蛋白，肌原纤维蛋白是盐溶性的蛋白，基质蛋白则是既不溶于水也不溶于盐溶液的不溶性蛋白。肌原纤维蛋白占到了鱼类蛋白的65-75%，是鱼蛋白最重要的组分，鱼肉蛋白在冻藏过程中发生变性的主要是肌原纤维蛋白。已有的研究结果表明，添加抗冻剂是有效的抗鱼肉蛋白冷冻变性的方法。常用的抗冻变性剂为糖类，盐类、蛋白及水解物等。目前应用最多的商业抗冻剂的配方是蔗糖和山梨醇混合物、多聚磷酸盐，以及糖和多聚磷酸盐的混合物。蔗糖和山梨糖醇因其价格低廉、抗冻效果较好且不易发生美拉德反应产生褐变而受广泛应用于实际生产中。但此类抗冻剂带来较重的甜味和热量，一些人因疾病(如糖尿病)不能使用，这在一定程度上限制了糖类抗冻剂在鱼糜中的使用。因此低热量的抗冻剂成为目前的研究方向。研究发现某些蛋白酶解物含有较大比例的亲水性氨基酸，能与水作用形成氢键，增强冻结过程中水的稳定性，减少巨大冰晶体的形成，从而避免鱼肉蛋白空间构象变化而引起的变性。因此，寻找新型蛋白及水解物，提高鱼糜冷冻变性，是本领域研究的一项重要内容。
发明内容
解决的技术问题本发明提供一种基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，丝胶蛋白中含有大量亲水性的丝氨酸，以丝胶蛋白为原料，经酶解，最终得到一种非糖类抗冻剂。技术方案基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，步骤为用水溶解丝胶蛋白，质量体积比浓度为O. 5 10% (g/mL);用O. 5 I. 5mol/LNa0H溶液调pH 7. O 9. O,保持温度20 40°C;加入胰蛋白酶，加入量为胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=IOOOOU 40000U:lg，酶解反应O. 5 4h ;酶解结束后，将溶液加热到80 100°C，并保持5 IOmin进行灭酶处理；将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。上述的基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，优化步骤为1.用水将丝胶蛋白溶解，质量体积浓度为3% (g/mL)；2.用lmol/L的NaOH调pH值到8. 5，保持温度37°C ；3.力口入胰蛋白酶，加入量为胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=30000U :lg，酶解反应时长3h ;4.酶解结束后，将溶液加热到95°C，并保持6min进行灭酶处理，将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。有益效果I.本发明所得的新型抗冻剂属非糖类物质，应用于蛋白类食品的冷冻保鲜，不会增加这些食品的能量，糖尿病患者可以食用此类冻存的蛋白类食品。2.我国是养蚕大国，每年生产大量的蚕茧，丝胶产量巨大。本发明可以充分利用丝胶，达到废物利用的目的。
具体实施例方式实施例II.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为O. 5% (质量体积分数，g/mL)；2.用 I. 5mol/L 的 NaOH 调 pH 值到 9，保持温度 20°C。3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=40000U:lg)，酶解反应时长
O.5h ；4.酶解结束后，将溶液加热到80°C，并保持IOmin进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，得到丝胶源酶解蛋白抗冻剂。实施例2I.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为10% (质量体积分数，g/mL)；2.用 lmol/L 的 NaOH 调 pH 值到 7. 5，保持温度 30°C。3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=IOOOOU :lg)，酶解反应时长2h ；4.酶解结束后，将溶液加热到100°C，并保持5min进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。实施例3I.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为7. 5% (质量体积分数，g/mL);2.用 O. 5mol/L 的 NaOH 调 pH 值到 8，保持温度 40°C。3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=20000U :Ig)，酶解反应时长4h ；
4.酶解结束后，将溶液加热到90°C，并保持7min进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。实施例4I.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为3% (质量体积分数，g/mL);2.用 lmol/L 的 NaOH 调 pH 值到 8. 5，保持温度 37°C。3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=30000U:lg)，酶解反应时长3h ；4.酶解结束后，将溶液加热到95°C，并保持6min进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。实施例5I.用水将丝胶蛋白溶解，浓度为8% (质量体积分数，g/mL)；2.用 lmol/L 的 NaOH 调 pH 值到 7. 5，保持温度 40°C。
3.加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=40000U:lg)，酶解反应时长
I.5h ；4.酶解结束后，将溶液加热到100°C，并保持7min进行灭酶处理。将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。丝胶源性抗冻剂对鲢鱼糜的冷冻变性的保护作用按实施例4方法，制备得到丝胶源性抗冻剂，进行抗鲢鱼糜的冷冻变性试验。I.将鲢鱼清洗、去鳞、去头、去内脏，并经第二次清洗。然后采肉。漂洗4次及以 上，最后一次漂洗水中加入O. 15%的食盐(以使肌球蛋白收敛，容易脱水)。脱水；2.向脱水完毕的鱼糜中添加酶解后的丝胶蛋白粉(或与糖类抗冻剂联合应用)，分别为无抗冻剂、1% (酶解产物与鱼糜的质量分数，下同)丝胶蛋白酶解产物、O. 5%丝胶蛋白酶解产物、4 %蔗糖+4 %山梨醇、I %丝胶蛋白酶解产物+2 %蔗糖+2 %山梨醇，混匀，_20°C保存；3.每周检测鱼糜保水性、盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巯基含量、表面疏水性。同时以未加任何抗冻剂的鲢鱼糜为对照，评价酶解丝胶蛋白抗冻剂的效果。鱼糜质量检测方法如下(I)保水性称取鱼糜5. 0g，加入O. 65mL的10% NaCl溶液，擂溃6min，装入已经称重的干燥离心管，4000r/min离心5min，使其充填结实，4°C保存2h。水浴加热至内部温度90°C，取出，5000r/min离心5min,用滤纸吸干水分后称重。保水性计算公式如下
歷騰 X 100_o(2)盐溶性蛋白含量第一步用牛血清蛋白为对照，制作595nm处吸光度标准曲线牛血清蛋白标准曲线的制作采用考马斯亮蓝法。首先配制100 μ g/mL的牛血清白蛋白和lOmg/mL考马斯亮蓝G250溶液，按照表I添加各物质于试管中。用紫外分光光度计在595nm处测定其吸光度，根据所得数据绘制标准曲线。表I牛血清蛋白标准曲线的制作
实验号牛血清白蛋白(niL)蒸馏水(niL)考马斯亮蓝(lOmg/mL)总体积(niL)~
~OOI56
~020856
~2040656
~0~60456
~0~80~256
~5IO56
第二步称取鱼糜5. 0g，然后加入20mL冰冷的O. 6mol/L KCl溶液，在研钵中研磨、匀浆，4°C静置I. 5h，10000r/min离心30min，取上清液lmL，加入5mL考马斯亮蓝试剂，于595nm处测定吸光度，用0.6mol/L KCl做空白对照。根据所得的吸光度和所绘制的标准曲线计算出盐溶蛋白的含量。(3)肌原纤维蛋白溶液的测定取5g鱼肉样品，添加10倍量的20mmol/L Tris-maleate缓冲液(pH7. O,内含
O.05mol/L KCl),充分勻衆,然后在9000r/min下低温离心IOmin,以洗去鱼糜样品中残留水溶性蛋白质。弃去上清液，在沉淀中加入10倍量的20mmol/L Tris_maleate缓冲液(pH7. O,内含O. 6mol/L KCl )，充分匀浆后在4°C下提取盐溶性蛋白质lh，然后在9000r/min下低温离心lOmin，上清液即为实验用肌原纤维蛋白溶液。用考马斯亮蓝法测定其中的蛋白质含量，所得肌原纤维蛋白溶液用O. 6mol/L KCl调节浓度在4mg/mL，供属性(Ca2+-ATPase活性、巯基含量、表面疏水性)测定。(4) Ca2+-ATPase 活性测定测定的试剂体系如表2所示表2Ca2+_ATPase活性测定时添加的试剂
权利要求
1.基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，其特征在于步骤为用水溶解丝胶蛋白，质量体积比浓度为O. 5 10% (g/mL);用O. 5 I. 5mol/L NaOH溶液调pH 7. O 9. 0，保持温度20 40°C ;加入胰蛋白酶，加入量为胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=IOOOOU 40000U:Ig,酶解反应O. 5 4h ;酶解结束后，将溶液加热到80 100°C，并保持5 IOmin进行灭酶处理；将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。
2.根据权利要求I所述的基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，其特征在于步骤为I.用水将丝胶蛋白溶解，质量体积浓度为3%(g/mL);2.用lmol/L的NaOH调pH值到8. 5，保持温度37°C;3.加入胰蛋白酶，加入量为胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=30000U:lg，酶解反应时长3h ；4.酶解结束后，将溶液加热到95°C，并保持6min进行灭酶处理，将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。
全文摘要
基于丝胶蛋白的抗冻剂的制备方法，步骤为用水溶解丝胶蛋白，浓度为0.5～10％(质量体积分数，g/mL)；用0.5～1.5mol/L NaOH溶液调pH 7.0～9.0，保持温度20～40℃；加入胰蛋白酶(胰蛋白酶活力丝胶蛋白质量=10000U～40000U1g)，酶解反应0.5～4h；酶解结束后，将溶液加热到80～100℃，并保持5～10min进行灭酶处理；将所得多肽溶液冷冻干燥，丝胶源酶解蛋白抗冻剂。本发明所得的新型抗冻剂属非糖类物质，应用于蛋白类食品的冷冻保鲜，不会增加这些食品的能量，糖尿病患者可以食用此类冻存的蛋白类食品。
文档编号A23B4/09GK102823638SQ20121033275
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者颜辉, 吴琼英, 江明珠, 贾俊强 申请人:江苏科技大学