一种由微生物（单细胞真菌高山被孢霉）产生的富含花生四烯酸的油及其制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种能够大量生产花生四烯酸（或ARA）的高山被孢霉菌株，一种使用该菌株的相关脂类化合物的生产方法，以及使用该菌株制备的产物和化合物。
【专利说明】—种由微生物(单细胞真菌高山被孢霉)产生的富含花生四烯酸的油及其制备工艺
[0001]本发明涉及一种富含花生四烯酸油的新化合物，其是由微生物产生，且最好是被孢霉类的单细胞真菌(丝状霉)产生，本文指的是高山被孢霉的特殊菌株。
[0002]脂类、蛋白质和碳水化合物是三大营养素。
[0003]脂类中又特别包括甘油三酯和磷脂。
[0004]甘油三酯约占口服食用脂类的95%。在人体内，它们主要存在于脂肪组织，是贮存能量的主要形式。
[0005]磷脂是结构性脂类，它们是细胞膜的组成部分，尤其是保证细胞膜的流动性。
[0006]甘油三酯和磷脂的主要组成部分是脂肪酸，脂肪酸既可获自食物，也可以通过人体自身合成。
[0007]从生物化学角度，脂肪酸可分为(根据脂肪酸分子包含的双键数量)饱和脂肪酸(AGS)、单不饱和脂肪酸(AGMI)和多不饱和脂肪酸(AGPI )。
[0008]从生理学角度，我们将它们分成:
[0009]-必需脂肪酸:人体成长和正常运行必需，但又不能自身合成的脂肪酸；
[0010]-“条件性”必需脂肪酸，是保证细胞正常生长和生理功能的主要物质，如果是通过食物获取的，则可以通过它们的前体化合物获取。如果没有它们必需的前体，则为严格必
需脂肪酸。
[0011]-非必需脂肪酸。
[0012]所有必需脂肪酸和“条件性”必需脂肪酸组成了必需脂肪酸。
[0013]其它脂肪酸则未非必需脂肪酸。
[0014]我们将必需脂肪酸分成两大类:0mega 6脂肪酸(或AGPI n_6)，其前体和主要代表是亚油酸(LA)，以及omega 3脂肪酸(或AGPI n_3)，其前体是α-亚麻酸(ALA)。
[0015]在非必需脂肪酸中，尤其包括:
[0016]-omega 3脂肪酸类的二十碳五烯酸(EPA),
[0017]-油酸、食物中大量存在的单饱和脂肪酸以及
[0018]-饱和脂肪酸。
[0019]除了产自花生、红花、油菜、玉米、亚麻、核桃、芝麻、大豆、向日葵外，多种不饱和脂肪酸还可以由多种单细胞生物化合物(藻类、真菌等)产生。
[0020]花生四烯酸(“ARA”)是我们在有些植物油中发现的一种长链脂肪酸。
[0021]这是一种C 20:4 (n-6、n-9、n-12、n-15)多不饱和脂肪酸，比如20个碳原子和碳原子上的四个乙烯键5(11-15)、8(11-12)、11(11-9)和14(n_6)组成的脂肪酸。
[0022]这种脂肪酸也被称作“四烯酸”，因为它具有4个不饱和有机物(4个碳-碳双键)。
[0023]我们还可在专题著作中发现把它称作“全顺式-5，8，11,14- 二十碳四烯酸”(其中“顺式”定义了双键的构型，而且“全部”双键均为“顺式”构型)。
[0024]AM是人体内最丰富的一种C20的AGPI，人体可以通过亚油酸合成。
[0025]机体、肌肉和血液中都存在花生四烯酸。[0026]ARA是多种生物活性化合物的重要前体，这些生物活性化合物被统称为“类二十烷酸”，该家族包括前列腺素、凝血氧烷和白细胞三烯。
[0027]这些类二十烷酸对脂蛋白代谢、血液流变、肌肉紧张、白细胞功能、血小板激活和细胞生长具有调节作用。
[0028]ARA还是人乳乳脂成分之一，并被视为婴幼儿神经最佳生长必不可少的物质。科学家和食品监管机构努力获得与人乳中的长链脂肪酸性质一致的婴幼儿制品，他们建议在可在婴幼儿制品中添加花生四烯酸，尤其是用于给早产儿的配方中。
[0029]用于婴幼儿制品的含有花生四烯酸的油中最好特别含少量或不含其他AGPI (比如，二十碳五烯酸或EPA)。
[0030]实际上并不推荐其他AGPI，因为其中有些脂肪酸可能与婴幼儿制品中使用的花生四烯酸互相干扰，并且/或者可能妨碍含有花生四烯酸的油与其他油类混合，从而损害人乳中脂肪酸的恰当比例(重组人乳)或其他希望的应用。
[0031]此外，ARA还有多种应用，比如不仅用于人类食品的制备，还用于动物的食物中。
[0032]实际上ARA在动物营养学方面有许多公认的性质:
[0033]-消炎作用，因为ARA是系列2前列腺素和大麻素的前体(主要在猪身上得到证明)，
[0034]-在鱼类(鲷鱼)身上的抗应激性，通过与前列腺素不同的途径，
[0035]-在猪身上的调节免疫性。
[0036]此外还进行了传递研究，以显示花生四烯酸在肉体、奶和产出的卵内的转移。
[0037]当从微生物中被分离出来时，商业产物的主要可用形式为通过被孢菌类的丝状霉发酵获得的富含花生四烯酸的油。
[0038]在EP 276541 中描述了米用 alpina, hygrophila, spinosa 被抱菌生产 ARA 的工艺。
[0039]国际专利申请WO 94/28913则描述了一种使用高山被孢霉来生产基本上没有EPA的ARA的发酵工艺。
[0040]然而，正如EP 726.321中所断定的，用来测试其生产ARA能力的所有被孢菌(alpina, hygrophila, spinosa, schmuckeri 和 carmagensis),其中生产倉泛力最优秀的是被抱菌 schmuckeri 或 carmagensis 的菌株。
[0041]所以，ARA生产领域的专家们承认，与M.alpina、hygrophila或spinosa相比,选择M.Schmuckeri或M.carmagensis菌株,才能保证最佳效率、生产率和重量。
[0042]然而，我们仍旧需要具备可以生产ARA含量高、并且具有长链饱和脂肪酸或长链多不饱和脂肪酸全部特性的优质油。
[0043]此外，对于众多国家监管当局而言,婴儿食品中只允许使用高山被孢霉。
[0044]首先，要由申请公司提供富含花生四烯酸并同时具有下列成分的油的新配方:
[0045]-含有少量除ARA以外的多不饱和脂肪酸(比如EPA)，
[0046]-含量有限的一些长链饱和脂肪酸(比如山嵛酸、肉豆蘧酸、棕榈酸或木焦油酸)。
[0047]此外，申请公司注意到含有少量这些饱和脂肪酸可以获得在透明度、冷浊度低方面比商品油重量更好的油。
[0048]申请公司还关注调试比现有技术中描述的工艺更高效和更经济的替代生产工艺，所以在研究中鉴别了具有杰出的生产花生四烯酸的能力的高山被孢霉的新菌株，因为它可以生产50%的花生四烯酸(这里的％表示占全部脂肪酸的重量百分百)。
[0049]因此,与在M.Schmuckeri或M.carmagensis类型的菌株中进行研究的技术先例不同，申请公司找到了生产AM的最佳菌株。
[0050]此外，除了非凡的花生四烯酸生产能力之外，该菌株还可以获得(这里的％表示占全部脂肪酸的重量百分百):
[0051]-低于0.5%，最好是低于0.2%的EPA，
[0052]-低于0.5%，最好是低于0.2%的肉豆蘧酸(C14:0)，
[0053]-低于9%，最好是低于7%的棕榈酸(C16:0)，
[0054]-低于3%，最好是低于2.5%的山嵛酸(22:0)，以及
[0055]-低于3%，最好是低于2.5%的木焦油酸(C 24:0)。
[0056]2012年6月12日将这种高山被孢霉菌株交存至法国的巴斯德研究所的法国国家微生物保藏中心(CNCM)，编号为CNCM 1-4642，同时交存至中国的武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中华人民共和国武汉市，邮编:430072，编号为M 209116。
[0057]它的特征是:ARN 25S编码基因Dl - D2部位的顺序排列(ID序列号I):
[0058]
【权利要求】
1.一种高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株,其于2012年6月12日在法国国家微生物保藏中心(CNCM)以保藏号1-4642保藏。
2.—种高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株，其通过突变或基因工程从权利要求1的菌株获得，并且其具有产生以总脂肪酸的重量计至少50%的花生四烯酸的能力。
3.一种目的脂类化合物的生产方法，包括培养权利要求1或权利要求2的菌株，以及回收富含目的脂类化合物的生物质，以及任选地，回收目的脂类化合物。
4.权利要求3的方法，其中目的脂类化合物为花生四烯酸(或ARA)。
5.权利要求4的方法，其中花生四烯酸(ARA)以油形式存在。
6.权利要求5的方法，其中包含花生四烯酸的油通过包括下列步骤的方法来制备: -在异养条件下培养菌株，以生产生物质，所述生物质以重量计脂类为40到55%，优选以重量计脂类为40到50%，更优选以重量计脂类为约45%，并且具有以总脂肪酸的重量计50到55%的AM。 -回收所获得的生物质， -干燥所述生物质， -用选自己烷和丁烷的溶剂，尤其是用液体丁烷萃取油， -精炼和回收所萃取的油。
7.权利要求1或权利要求2 的菌株在生产目的脂类化合物，例如花生四烯酸(ARA)中的应用。
8.由权利要求3的方法产生的脂类化合物，例如花生四烯酸(ARA)在制备食品组合物中的应用。
9.一种产物或者组合物，其包含权利要求1或权利要求2的菌株，或者其富含目的脂类化合物，例如花生四烯酸(ARA)的细胞裂解物或者萃取物。
10.权利要求9的产物或组合物，其中所述产物或组合物富含花生四烯酸(ARA)。
11.权利要求10的产物或组合物，其中所述产物或组合物包含以总脂肪酸的重量计50%以上的花生四烯酸(ARA)，并且具有: -低于0.5%，优选低于0.2%的二十碳五烯酸(EPA)， -低于0.5%，优选低于0.2%的肉豆蘧酸(C14:0)， -低于9%，优选低于7%的棕榈酸(C16:0)， -低于3%，优选低于2.5%的山嵛酸(C22-.0)，以及 -低于3%，优选低于2.5%的木焦油酸(C24:0)。
12.权利要求9到11任一项的产物或组合物，其中所述产物或组合物是食品或膳食补充剂。
13.—种生产高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株的方法,所述高山被孢霉菌株具有产生以总脂肪酸的重量计至少50%的花生四烯酸，该方法包括权利要求1的菌株的突变和基因工程。
【文档编号】C12R1/645GK103667068SQ201210343057
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2012年9月14日
【发明者】钱云, 周洁, 伯纳德·波拉 申请人:罗盖特兄弟公司