专利名称：定性检测kras基因分型的测序引物对及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外核酸检测领域，采用PCR结合焦磷酸测序技术，用于检测患者组织DNA中KRAS基因型，具体涉及一种定性检测KRAS基因分型的测序引物对及其试剂盒。
背景技术：
RAS基因家族与人类 肿瘤相关的基因有三种——HRASjKRAS和NRAS，其中KRAS对人类癌症影响最大，它好像分子开关当正常时能控制调控细胞生长的路径；异常时该基因永久活化，导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭，使细胞增殖失控而癌变(见图I )。据统计，KRAS突变型结直肠癌患者约占30-40%，在肺癌患者中突变率约占20-30%。NCCN专家组认为，KRAS突变是结直肠癌形成过程中的早期事件，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致，可用于早期诊断和复发的及时监测。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解结直肠癌等恶性肿瘤的发展预后、评估放化疗疗效的重要指标为结直肠癌等恶性肿瘤的早期诊断提供依据科学研究发现，人体内从单个细胞开始到形成米粒大小的肿瘤，需要8 10年，在此阶段人体几乎没有任何症状；从米粒大小的肿瘤发展成杏仁大小的肿瘤，只需I年左右；如果没有及时发现，杏仁大小的肿瘤发展到晚期只需要2 6个月。近几年西妥昔单抗、帕尼单抗等靶向药物(表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)联合化疗的应用为广大结直肠癌患者带来福音。KRAS基因检测已被写入最新版《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。新指南传递出了两条重要的信息一是所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；二是只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗和帕尼单抗治疗(见图I)。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出当KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用特罗凯进行分子靶向治疗。为癌症患者的预后提供指导。例如Ryan et al (2003)发表在顶尖杂志⑶T(IF>10)的文章指出，术后血清KRAS基因突变检测对于肿瘤的预后具有重要作用术后血清KRAS基因突变检测阳性者复发率高达63%，而术后血清KRAS基因突变检测阴性者的复发率仅为2%。a. EGFR被TGF a、EGF等配体激活后启动细胞内信号传导，维持细胞存活，促进细胞增殖、转移，在存在血管内皮生长因子(VEGF)的条件下还可促进新生血管生成。b.肿瘤的靶向治疗药物如抗EGFR单抗(西妥昔单抗、帕尼单抗等)通过阻断EGFR二聚体的形成，抑制其下游的细胞内信号传导，从而抑制肿瘤细胞的存活、增殖、转移以及新生血管生成。c. KRAS基因突变可旁路激活细胞内信号传导，从而导致抗EGFR单抗丧失抗癌活性。目前医院用于KRAS基因检测的“金标准”是PCR-直接测序法，但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含〈10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(确定DNA中核苷酸的顺序)方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析出峰情况，达到测定DNA序列的目的。目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行KRAS的基因多态性检测的产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高、成本低、定量、准确检测KRAS的基因突变的测序引物对及其试剂盒。·为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种检测KRAS基因分型的测序引物对，所述引物对为如下引物KRAS1213 正向扩增引物5' -TATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3' (SEQ ID NO. I)；KRAS1213 反向扩增引物5' -TATTCGTCCACAAAATGATTCTGA-3' (SEQ ID NO. 2)KRAS1213 测序引物5' -GCACTCTTGCCTACG-3' (SEQ ID N0:3)KRAS6I 正向扩增引物5' -AATTGATGGAGAAACCTGTCTCTT-3; (SEQID NO. 4)KRAS61 反向扩增引物5' -TCCTCATGTACTGGTCCCTCATT-3' (SEQID NO. 5)KRAS61 测序引物5' -CTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID NO. 6)其中，KRAS1213正向扩增引物(SEQ ID NO. I)和 KRAS61 (SEQ ID NO. 5)反向扩增引物的5'端分别进行生物素标记。一种定性检测KRAS基因分型的测序试剂盒，所述试剂盒包括含有SEQ IDN0. 2所示反向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向扩增引物的PCR反应液2，SEQID NO. I所示的正向扩增引物，SEQ ID NO. 5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端进行生物素标记。进一步地，所述试剂盒中还包括质控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作为空白对照品的超纯水；质控序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。进一步地，所述试剂盒还包括KRAS1213阳性对照品1，KRAS1213阳性对照品2，；KRAS61阳性对照品1，KRAS61阳性对照品2 ；所述KRAS1213阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的KRAS1213野生纯合子质粒；所述KRAS1213阳性对照品2为所述KRAS1213野生纯合子质粒与插有SEQID NO. 9所示核苷酸序列的KRAS1213突变纯合子质粒组成的质粒混合物；所述KRAS61阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的KRAS61野生纯合子质粒；KRAS61阳性对照品2为所述KRAS61野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的KRAS61突变纯合子质粒组成的质粒混合物；其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述KRAS1213质粒混合物中KRAS1213突变纯合子质粒和所述KRAS1213野生纯合子质粒的数量比为1:1 ;所述KRAS61质粒混合物中KRAS61突变纯合子质粒和所述KRAS61野生纯合子质粒的数量比为1:1。所述的PCR反应液I和PCR反应液2中其他组分为常规的IOx PCR Buffer^dNTPs和H2O,各组分按常规体积比配置(10x PCR Buffer、dNTPs、H20和反应液中引物的体积比为5:3:37. 5:1)。试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5'-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本发明的优点及有益效果
I)本发明提供的定量检测KRAS基因突变的焦磷酸测序试剂盒定性准确，具有灵敏性高、特异性强的优点，样品处理简单，测序速度快，高通量，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点频率分析，结果直观。2)本发明提供的定量检测KRAS基因突变多态性的焦磷酸测序试剂盒灵敏度和特异性高；3)本发明提供的定量检测KRAS基因突变多态性的焦磷酸测序试剂盒检测速度快；4)本发明提供的定量检测KRAS基因突变多态性的焦磷酸测序试剂盒步骤简单；5)本发明提供的定量检测KRAS基因突变多态性的焦磷酸测序试剂盒可同时进行高通量的样本检测。6 )本发明的试剂盒中设置了空白对照、阳性对照和阳性对照，能更好的确保检测结果的准确性。由于设计了灵敏度高，特异性好的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对KRAS基因分型进行快速检测。本发明的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，高通量，比金标准一一毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。
图I抗EGFR单抗作用机制及KRAS基因突变效应示意图；图2为临床KRAS密码子1213野生型的焦磷酸测序图；图3为临床KRAS密码子1213突变型的焦磷酸测序图；图4为临床KRAS密码子61野生型的焦磷酸测序图；图5为临床KRAS密码子61突变型的焦磷酸测序图；图6为临床质控品control oligo的焦磷酸测序图；图7为临床空白对照的焦磷酸测序图；图8至图11为多组设计引物的焦磷酸测序图；其中图8、图9、图10的测序结果均不准确，只有图11的测序结果真实可靠。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例I :试剂盒的制备I.引物和探针的设计与合成研究表明目前针对KRAS基因突变主要集中在2号外显子的12、13号密码子和3号外显子的61号密码子中，选择特异的突变位点，使用PyroMark Assay Design2. O软件，设计引物；其中扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中SEQ ID NO: I和SEQ ID NO. 5的5，为生物素标记。
突变位点与类型表I:
MutationBase change
Glyl2AlaGGT>GCT
Glyl2AspGGT>GAT
Glyl2ArgGGT>CGT
Glyl2CysGGTXTGT
Glyl2SerGGT>AGT
Glyl2ValGGT>GTT
Glyl3AspGGOGAC
Gln61ArgCAA>CGA扩增序列如表2 表2.特异性扩增引物与测序引物序列
权利要求
1.一种定性检测KRAS基因分型的测序引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向扩增引物，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 5所示引物的5’端进行生物素标记。
2.一种定性检测KRAS基因分型的测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有SEQID NO. 2所示反向扩增引物的PCR反应液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向扩增引物的PCR反应液2，SEQ ID NO. I所示的正向扩增引物，SEQ ID NO. 5所示的反向扩增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的测序引物；其中，SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端进行生物素标记。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括SEQID NO. 7所示的质控品和空白对照品。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为水。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括KRAS1213阳性对照品1，KRAS1213阳性对照品2，；KRAS61阳性对照品1，KRAS61阳性对照品2 ； 所述KRAS1213阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的KRAS1213野生纯合子质粒；所述KRAS1213阳性对照品2为所述KRAS1213野生纯合子质粒与插有SEQ IDNO. 9所示核苷酸序列的KRAS1213突变纯合子质粒组成的质粒混合物； 所述KRAS61阳性对照品I为插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的KRAS61野生纯合子质粒；KRAS61阳性对照品2为所述KRAS61野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的KRAS61突变纯合子质粒组成的质粒混合物； 其中，质粒载体为PMD18-T质粒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述KRAS1213质粒混合物中KRAS1213突变纯合子质粒和所述KRAS1213野生纯合子质粒的数量比为1:1。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述KRAS61质粒混合物中KRAS61突变纯合子质粒和所述KRAS61野生纯合子质粒的数量比为1:1。
全文摘要
本发明提供一种检测KRAS基因第2外显子密码子12、13和第3外显子密码子61突变的测序引物对及其试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR扩增引物以及测序引物；本发明提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。
文档编号C12N15/11GK102899408SQ201210349330
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者肖芳 申请人:长沙三济生物科技有限公司